專利名稱：添加植物激素的培養(yǎng)基及其在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種添加有植物激素的培養(yǎng)基及其在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
研究表明，以二十二碳六烯酸(Docosahexaenoicacid, DHA, C22 :6，n_3)為代表的n-3多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)是必須脂肪酸，因?yàn)榫哂杏幸嬗谌祟惤】档亩喾N生理功能受到廣泛的重視。DHA是大腦皮層和視網(wǎng)膜的關(guān)鍵組份，對嬰幼兒視覺和神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育，維持視覺和神經(jīng)系統(tǒng)的功能至關(guān)重要。另外，還具有預(yù)防心血管疾病、抗癌、抗炎等生理功能。裂殖壺菌(Schizochytrium limacinum)是一種海洋真菌，這種真菌最顯著的特點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)積累大量的油脂，90%以上的油脂以人體易吸收的中性油脂-甘油三脂的形式存在?？傊舅嶂胁伙柡椭舅岷亢芨?，主要為DHA。裂殖壺菌生長速度快，易于進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)。該物種使用安全，沒有任何毒副作用，是一種生產(chǎn)DHA的理想的生物資源。本世紀(jì)以來，用裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)DHA取得了長足的進(jìn)展，成為我國DHA的主要來源。植物激素(plant hormone)是在植物體內(nèi)合成，并從產(chǎn)生之處運(yùn)送到別處，雖然濃度很低，但是對植物的生理過程及生長發(fā)育產(chǎn)生顯著作用的生物活性物質(zhì)。目前已發(fā)現(xiàn)的植物激素有細(xì)胞分裂素、生長素、赤霉素、乙烯和落葉酸5類，前三者為促進(jìn)生長發(fā)育的激素，而后兩者是負(fù)向激素，能夠抑制生長發(fā)育。研究表明，有的真菌(如根瘤菌)能夠直接合成或者誘導(dǎo)植物合成植物激素。植物激素對真菌的生長和代謝有也有一定的影響，楊中寶等000 研究了激素對叢枝菌根(Arbuscular mycorrhizae)侵染和產(chǎn)孢的影響；于建新等Q009)研究了菌根真菌生長及其與植物共生過程中可直接合成或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生多種激素類物質(zhì)，如生長素等，菌根真菌對植物激素種類、形態(tài)和含量的影響等。但還未見關(guān)于植物激素對裂殖壺菌的影響的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)中還未有關(guān)于植物激素對裂殖壺菌影響的報(bào)道，本發(fā)明提供了添加植物激素的培養(yǎng)基及其在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用，本發(fā)明通過在海洋真菌裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)添加適當(dāng)濃度的植物激素，達(dá)到了促進(jìn)裂殖壺菌生長及提高DHA含量的目的。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)添加植物激素的培養(yǎng)基，它包括以下組分以葡萄糖為碳源，濃度為10-100g/L ；以酵母提取物為氮源，濃度為10-80g/L ；海水占培養(yǎng)基總體積的20% -80% ；分別添加6-芐基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸中的一種。
對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述6-芐基腺嘌呤濃度為l-10mg/L ；糠基氨基嘌呤濃度為l_20mg/L ；赤霉素濃度為l-10mg/L ；所述吲哚丁酸濃度為Ι-lOmg/L ； α -萘乙酸濃度為l-10mg/L ；噴哚乙酸濃度為l-10mg/L。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述葡萄糖的優(yōu)化濃度為40_80g/L。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述酵母提取物的優(yōu)化濃度為20_60g/L。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述海水占培養(yǎng)基的優(yōu)化比例為30% -70%。本發(fā)明還提供了添加植物激素的培養(yǎng)基在裂殖壺菌發(fā)酵中應(yīng)用。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述裂殖壺菌為裂殖壺菌0UC88，菌種保藏號 CGMCC NO. 1240，保藏日期2004. 10. 27。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述裂殖壺菌以1-10%的接種量接入所述培養(yǎng)基中。對上述技術(shù)方案的進(jìn)一步改進(jìn)所述裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為18-30°C，pH值為4-8，轉(zhuǎn)速為100-250rpm，振蕩培養(yǎng)3-7天。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是本發(fā)明通過在裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適宜濃度的植物激素，以檢測植物激素對裂殖壺菌產(chǎn)生的影響，所述植物激素分別為細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、植物生長素吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸，它們單獨(dú)添加均能顯著提高裂殖壺菌生長速度和增加DHA含量；而且，采用本發(fā)明所述技術(shù)方案，可以顯著降低裂殖壺菌的發(fā)酵成本，提高發(fā)酵效率，從而促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實(shí)施方式
后，本發(fā)明的其他特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更加清林疋。


圖1表明本發(fā)明中6-BA對裂殖壺菌生長和DHA含量的影響。圖2表明本發(fā)明中KT對裂殖壺菌生長和DHA含量的影響。圖3表明本發(fā)明中GA對裂殖壺菌生長和DHA含量的影響。圖4表明本發(fā)明中IBA對裂殖壺菌生長和DHA含量的影響。圖5表明本發(fā)明中NAA對裂殖壺菌生長和DHA含量的影響。圖6表明本發(fā)明中IAA對裂殖壺菌生長和DHA含量的影響。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。在研究植物激素對裂殖壺菌的作用模式的時(shí)候，主要考查裂殖壺菌的生物量及細(xì)胞中DHA的含量，因?yàn)閮烧呤桥袛嗌a(chǎn)效率提高的兩個(gè)關(guān)鍵因素。為了提高裂殖壺菌的生產(chǎn)效益，本發(fā)明通過在裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加 6種不同植物激素驗(yàn)證這些植物激素對裂殖壺菌的影響，并通過進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)確定出各種植物激素的優(yōu)化添加量，本發(fā)明所述6種植物激素包括細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤(BA)、 糠基氨基嘌呤(KT)、赤霉素(GA)、植物生長素吲哚丁酸(IBA)、萘乙酸(NAA)和吲哚乙酸 (IAA)，以不添加植物激素的培養(yǎng)基作為對照，比較不同組別裂殖壺菌的生物量和DHA含量，本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)主要包括兩類
1.比較不同的植物激素對裂殖壺菌的生物量和DHA積累的作用；2.比較同一種植物激素在不同劑量條件下對裂殖壺菌生長和DHA積累的作用。實(shí)施例1 :6-BA對裂殖壺菌的生物量與DHA含量的影響裂殖壺菌培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，濃度為60g/L ；以酵母提取物為氮源，濃度為 20g/L ；培養(yǎng)基中海水的比例為50%。然后在裂殖壺菌培養(yǎng)基中加入6-BA，添加濃度分別為0. 5mg/LUmg/L,3mg/L, 6mg/L 禾口 IOmg八將裂殖壺菌以10%的接種量接入所述培養(yǎng)基中。發(fā)酵培養(yǎng)溫度為23士 1°C，pH值為6，轉(zhuǎn)速為200rpm，振蕩培養(yǎng)4天。如圖1所示，結(jié)果表明6-BA添加濃度為0. 5mg/L時(shí)對裂殖壺菌的生物量與DHA 含量的影響作用不明顯，濃度為llmg/L和3mg/L條件下，6-BA對裂殖壺菌生長和DHA含量起促進(jìn)作用，3mg/L時(shí)裂殖壺菌生物量達(dá)到最大值，生物量比對照組的7. 30g/L · d提高到 9. 28g/L · d，提高了 27. 1% ；DHA含量從13. 0%提高到16. 9%，提高了 30. 0%。但濃度為 6mg/L和10mg/L時(shí)，6-BA對裂殖壺菌生長和DHA含量產(chǎn)生抑制作用。實(shí)施例2 =KT對裂殖壺菌的生物量與DHA含量的影響裂殖壺菌培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。如圖2所示，結(jié)果表明ΚΤ在低濃度時(shí)((10mg/L)能夠提高裂殖壺菌的生物量和 DHA含量，在KT添加量為10mg/L時(shí)，裂殖壺菌生物量達(dá)到9. 55g/L · d，比對照組高2. 25g/ L · d ;DHA含量14. 9%，比對照組高1. 9%。當(dāng)KT添加量為15mg/L或更高QOmg/L)的情況下，對裂殖壺菌的生長和DHA積累產(chǎn)生明顯的抑制作用。實(shí)施例3 =GA對裂殖壺菌的生物量與DHA含量的影響裂殖壺菌培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。在培養(yǎng)基中加入GA，添加濃度分別為0. 5mg/L, 1. Omg/L, 3mg/L, 6mg/L和10mg/L。如圖3所示，結(jié)果表明當(dāng)GA添加量為lmg/L時(shí)，裂殖壺菌生物量和DHA含量均達(dá)到最大值，分別是8. 62g/L· d和17. 2%，分別比對照組高1.32g/L· d和4.2%。實(shí)施例4 =IBA對裂殖壺菌的生物量與DHA含量的影響裂殖壺菌培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。在裂殖壺菌培養(yǎng)基中加入濃度為0. 5mg/L, lmg/L,3mg/L,6mg/L, 1 Omg/L的IBA。如圖4所示，結(jié)果表明IBA對裂殖壺菌生長和DHA含量的影響較小，隨著IBA添加量的增大，裂殖壺菌生物量和DHA含量都緩慢上升。在IBA添加量在3mg/L時(shí)，裂殖壺菌生長和DHA含量達(dá)到最大值，分別比空白高1. 36g/L ·(!和3. 1 %，在添加量超過:3mg/L起抑制作用。實(shí)施例5 α -萘乙酸(NAA)對裂殖壺菌的生物量與DHA含量的影響裂殖壺菌培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。在裂殖壺菌培養(yǎng)基中分別加入0. 5mg/L、lmg/L,3mg/L,6mg/L, 1 Omg/L的NAA。如圖5所示，結(jié)果表明當(dāng)NAA添加量從0. 5mg/L到6mg/L時(shí)，隨著NAA添加量的增加，裂殖壺菌生物量和DHA含量逐漸增加，但增幅較小，在NAA添加量為6mg/L時(shí)達(dá)到最大8. 40g/L · d，15. 8%，分別比對照組高1. 10g/L · d和2. 8% ；添加量為1 Omg/L，有明顯的抑制作用。
實(shí)施例6 噴哚乙酸(IAA)對裂殖壺菌的生物量與DHA含量的影響裂殖壺菌培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)方法如實(shí)施例1所述。在裂殖壺菌培養(yǎng)基中加入IAA，濃度為0. 5mg/LUmg/L,3mg/L,6mg/L和10mg/L。如圖6所示，結(jié)果表明低濃度(0. 5mg/L、lmg/L和;3mg/L)的IAA對裂殖壺菌生長和DHA含量有一定的促進(jìn)作用，添加量為3mg/L時(shí)生物量和DHA含量均達(dá)到最大值，分別是 8. 29g/L · d 和 16. 0%，分別比對照組高 0. 99g/L · d 和 3. 0%。實(shí)施例7 3種植物激素對裂殖壺菌生長與DHA含量影響為了試驗(yàn)多種植物激素對裂殖壺菌的生長和DHA含量的影響，本發(fā)明選擇了有明顯促進(jìn)作用的3種激素(6-BA、KT及GA)在有效濃度范圍內(nèi)進(jìn)行三因子三水平正交試驗(yàn)(6-BA :0mg/L, 1. 5mg/L, 3. Omg/L ；KT :0mg/L，5. Omg/L, 10. Omg/L ；GA :0mg/L，0. 5mg/L, 1. Omg/L) ο正交實(shí)驗(yàn)的裂殖壺菌培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件與實(shí)施例1-6相同。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，生物量最高的是第6組(6-BA 1. 5mg/L，KT10mg/L)，達(dá)到8. 88g/L. d，比對照組提高28. 9%;DHA含量最高的是第4組(6-BA1. 5mg/L，GA0. 5mg/L)， 為14.2%，提高了 13.6%。與實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3比較，3種植物激素復(fù)合使用對DHA積累的促進(jìn)作用明顯低于單獨(dú)使用的6-BA、KT和GA，說明在某些組合中甚至出現(xiàn)了拮抗效應(yīng)，DHA含量有所降低。因此建議在裂殖壺菌發(fā)酵生產(chǎn)中單獨(dú)添加適量的植物激素。表1 :3種植物激素對裂殖壺菌生長與DHA含量影響的正交實(shí)驗(yàn)
權(quán)利要求
1.添加植物激素的培養(yǎng)基，其特征在于它包括以下組分 以葡萄糖為碳源， 濃度為10-100g/L ；以酵母提取物為氮源，濃度為10-80g/L ； 海水占培養(yǎng)基總體積的20%-80% ；分別添加6-芐基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸中的一種。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的添加植物激素的培養(yǎng)基，其特征在于所述6-芐基腺嘌呤濃度為l-10mg/L ；糠基氨基嘌呤濃度為l_20mg/L ；赤霉素濃度為Ι-lOmg/L ；所述吲哚丁酸濃度為l-10mg/L ； α -萘乙酸濃度為Ι-lOmg/L ；吲哚乙酸濃度為1-lOmg/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的添加植物激素的培養(yǎng)基，其特征在于所述葡萄糖的優(yōu)化濃度為 40-80g/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的添加植物激素的培養(yǎng)基，其特征在于所述酵母提取物的優(yōu)化濃度為20-60g/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的添加植物激素的培養(yǎng)基，其特征在于所述海水占培養(yǎng)基的優(yōu)化比例為30%-70%。
6.添加植物激素的培養(yǎng)基在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的添加植物激素的培養(yǎng)基在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于所述裂殖壺菌為裂殖壺菌0UC88，菌種保藏號CGMCC NO. 1240，保藏日期2004. 10. 27。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的添加植物激素的培養(yǎng)基在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于所述裂殖壺菌以1-10%的接種量接入所述培養(yǎng)基中。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的添加植物激素的培養(yǎng)基在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用，其特征在于所述裂殖壺菌的發(fā)酵培養(yǎng)溫度為18-30°C，pH值為4-8，轉(zhuǎn)速為100-250rpm，振蕩培養(yǎng) 3-7 天。
全文摘要
本發(fā)明提供了添加植物激素的培養(yǎng)基及其在裂殖壺菌發(fā)酵中的應(yīng)用。所述培養(yǎng)基包括以下組分以葡萄糖為碳源，濃度為10-100g/L；以酵母提取物為氮源，濃度為10-80g/L；海水占培養(yǎng)基總體積的20%-80%；分別添加6-芐基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸中的一種。本發(fā)明在裂殖壺菌發(fā)酵培養(yǎng)基中加入適宜濃度的植物激素，細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤、糠基氨基嘌呤、赤霉素、植物生長素吲哚丁酸、萘乙酸和吲哚乙酸均能顯著提高裂殖壺菌生長速度和增加DHA含量；而且，采用本發(fā)明所述技術(shù)方案，可以顯著降低裂殖壺菌的發(fā)酵成本，提高發(fā)酵效率，從而促進(jìn)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。
文檔編號C12N1/14GK102304479SQ201110255188
公開日2012年1月4日 申請日期2011年8月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月31日
發(fā)明者張學(xué)成, 徐滌, 楊青, 臧曉南, 許 永 申請人:中國海洋大學(xué)