專利名稱：一種海蜇降壓肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種多肽混合物的制備方法，尤其涉及一種海蜇降壓肽的制備方法。
背景技術(shù)：
高血壓是對人類健康危害嚴(yán)重的一種疾病，也是引起心血管疾病的主要因素，其危害是造成腦、心、腎等重要器官的損害。腦卒中和冠心病是高血壓最嚴(yán)重的并發(fā)癥。資料表明，世界各國的平均發(fā)病率為10% 20%，每年因高血壓死亡的人數(shù)達(dá)1200萬。目前，我國現(xiàn)有高血壓患者已超過1.2億人口。因此，治療和預(yù)防高血壓病是當(dāng)今社會十分重要的課題?，F(xiàn)階段高血壓病的醫(yī)學(xué)研究主要集中在ACE的抑制物質(zhì)(ACEI)方面。目前， 大多用化學(xué)合成的ACEI如卡托普利(Captopril)、依那普利(Enalapril)、賴諾普利 (Listinopril)等藥物來治療高血壓。這類藥物具有作用時(shí)間短，停藥后血壓易反彈等缺點(diǎn)，以及引起咳嗽、味覺喪失、腎臟損傷及血管神經(jīng)性水腫等副作用。血管緊張素源(RAS)和激肽源(KXS)在血壓調(diào)節(jié)方面是一對相互拮抗的體系，而血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)則對兩者起到調(diào)控作用，現(xiàn)在科學(xué)研究普遍認(rèn)為，ACE過高是導(dǎo)致高血壓病的根本病因。所以要從根本上控制甚至治療高血壓病，必須要從一定程度上抑制 ACE的分泌。海蜇體內(nèi)含有較高的蛋白質(zhì)及鈣、磷、碘、鐵等無機(jī)鹽，素有“水產(chǎn)瑰寶”之美稱，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為海蜇具有擴(kuò)張血管，降低血壓之功效。近代研究亦表明，海蜇具有治療高血壓，改善心血管功能作用。有關(guān)研究資料報(bào)道，海蜇中含有一種降壓短肽，被人體吸收后能發(fā)揮降血壓作用。國內(nèi)外已有報(bào)道利用海蜇或其他海洋動植物資源提取得到降壓肽，但得到的產(chǎn)物基本是粗體蛋白質(zhì)或者離心上清液，降壓肽部分得率低、純度低以及活性保存不好，作為降壓產(chǎn)品原料存在諸多不足。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明提供一種提取效率較高、產(chǎn)品活性保存較好、成本低， 且操作簡單的海蜇降壓肽的制備方法。本發(fā)明海蜇降壓肽的制備方法，包括以下步驟
(1)、去除金屬離子，將鹽漬海蜇和超純水按照1:1-2的比例混合，采用超純水機(jī)抽取去離子水去除海蜇體內(nèi)的各種金屬離子；
(2)、將去除金屬離子后的海蜇浙干水分，破碎并攪拌，然后用勻漿機(jī)勻漿；
(3)、對步驟(2)得到的海蜇漿料按照8000U/g標(biāo)準(zhǔn)加入中性蛋白酶制作酶解體系，在溫度40-60°C下，酶解1-2小時(shí)；酶解后的酶解液送入發(fā)酵罐進(jìn)行滅酶滅菌，將滅酶滅菌后的酶解液冷卻至室溫，離心，收集上清液；將該上清液用濾紙過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮，得濃縮液；(4)、在步驟(3)所得濃縮液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)50%，靜置，離心，收集上清液；
(5)、取步驟(4)所得的上清液用阻抗值不低于18的超純水稀釋50倍，加入超濾系統(tǒng)的超濾杯中，安裝截留分子量為2. 5kDa的超濾膜包，進(jìn)行超濾，收集濾出液并濃縮，冷凍干燥后得成品。其中，所述步驟(1)去除金屬離子步驟以下
1)從超純水機(jī)抽取去離子水，所述去離子水阻抗值不低于10，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘；
2)再從超出水機(jī)抽取去離子水，所述去離子水阻抗值不低于15，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘；及
3)三次從超純水機(jī)抽取去離子水，所述去離子水阻抗值不低于18，按照鹽漬海蜇比超純水為1:1的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌15分鐘。所述步驟(2)中，破碎后海蜇在勻漿機(jī)中以4500-6000r/min勻漿8_20分鐘。所述步驟(2)中勻漿后，還將勻漿好的海蜇漿料用阻抗值不低于18的超純水稀釋 100倍，在80°C下加熱10分鐘，再進(jìn)行酶解。所述步驟(2)勻漿后，還可以將勻漿后的海蜇漿料在干燥機(jī)內(nèi)45-55°C通風(fēng)干燥2 小時(shí)，制成海蜇粉末使用。所述步驟(3)中離心速率為4000r/min，離心時(shí)間為15分鐘。所述步驟(3)中將過濾后的上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/4。所述步驟(5)中超濾壓力為 20 30psig。本發(fā)明海蜇降壓肽的制備方法充分利用海蜇豐富的蛋白質(zhì)資源，通過去金屬離子處理將海蜇體內(nèi)各種金屬離子基本去除干凈，使后續(xù)的酶解和應(yīng)用更加安全。本發(fā)明制備方法結(jié)合現(xiàn)代酶工程技術(shù)，提供了一種新的高效的海蜇降壓肽的生產(chǎn)途徑，提高了海蜇資源的利用效率，具有操作簡單、提取率高、產(chǎn)物活性保存好的特點(diǎn)，同時(shí)降低了海蜇降壓肽的生產(chǎn)成本。用高血壓SHR大鼠模型進(jìn)行海蜇降壓肽降壓活性試驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明組與空白對照組相比差異有顯著性，本方法制備的海蜇降壓肽具有與陽性對照卡托普利相似的降血壓活性。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述和說明。實(shí)施例1
去除海蜇體內(nèi)的各種金屬離子首先采用超純水機(jī)抽取去離子水，要求阻抗值不低于 10，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘；再從超純水機(jī)抽取去離子水，要求阻抗值不低于15，按照鹽漬海蜇比超純水為1 2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30 分鐘；最后從超純水機(jī)抽取去離子水，要求阻抗值不低于18，按照鹽漬海蜇比超純水為1:1 的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌15分鐘。將去除金屬離子后的海蜇浙干水分，放到組織絞肉機(jī)內(nèi)絞碎；將絞碎的海蜇投放到勻漿機(jī)中，以5000r/min勻漿10分鐘。
將勻漿好的海蜇漿料用超純水(超純水的阻抗值不低于18)稀釋100倍，在80°C 下加熱10分鐘；按照8000U/g的標(biāo)準(zhǔn)加入中性蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?0°C下酶解2小時(shí)；酶解完成后，將得到的酶解液加熱至沸騰并保持10分鐘滅酶，然后將其在4000r/min下離心15分鐘，收集上清液。將該上清液用用濾紙過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀里進(jìn)行真空濃縮， 直至原體積的1/4，得濃縮液。在所得濃縮液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 50%，靜置12小時(shí)，離心，收集上清液。取收集的上清液用超純水(阻抗值不低于18)稀釋50倍，加入超濾系統(tǒng)的超濾杯中，安裝截留分子量為2. 5kDa的超濾膜包，控制壓力在20psig下進(jìn)行超濾，收集濾出液并濃縮，冷凍干燥后得到純化的海蜇降壓肽粉末。實(shí)施例2
先將鹽漬海蜇進(jìn)行預(yù)處理，去除海蜇體內(nèi)的各種金屬離子，從超純水機(jī)抽取去離子水， 要求阻抗值不低于10，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘； 再從超純水機(jī)抽取去離子水，要求阻抗值不低于15，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘；最后從超純水機(jī)抽取去離子水，要求阻抗值不低于18，按照鹽漬海蜇比超純水為1:1的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌15分鐘。將海蜇取出浙干水分，放到組織絞肉機(jī)內(nèi)絞碎；將絞碎的海蜇投放到勻漿機(jī)中，以 5000r/min勻漿10分鐘；勻漿后的海蜇漿料在干燥機(jī)內(nèi)50°C通風(fēng)干燥2小時(shí)，直至干燥成海蜇粉末，保存?zhèn)溆谩⑻幚砗玫暮ｒ胤勰?，加?000U/g中性蛋白酶配置成混懸液，在50°C下酶解2小時(shí)。酶解完成后，將酶解液加熱至沸騰并保持10分鐘滅酶，然后將其在4000r/min下離心 15分鐘，收集上清液。將該上清液用用濾紙過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀里進(jìn)行真空濃縮，直至原體積的1/4，得濃縮液。在所得濃縮液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 50%，靜置12小時(shí)，離心，收集上清液。取收集的上清液用超純水(阻抗值不低于18)稀釋50倍，加入超濾系統(tǒng)的超濾杯中，安裝截留分子量為2. 5kDa的超濾膜包，控制壓力在25psig下進(jìn)行超濾，收集濾出液并濃縮，冷凍干燥后得到純化的海蜇降壓肽粉末。實(shí)施例3
先將鹽漬海蜇進(jìn)行預(yù)處理，去除海蜇體內(nèi)的各種金屬離子，從超純水機(jī)抽取去離子水， 要求阻抗值不低于10，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘； 再從超純水機(jī)抽取去離子水，要求阻抗值不低于15，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘；最后從超純水機(jī)抽取去離子水，要求阻抗值不低于18，按照鹽漬海蜇比超純水為1:1的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌15分鐘。將海蜇取出浙干水分，放到組織絞肉機(jī)內(nèi)絞碎；將絞碎的海蜇投放到勻漿機(jī)中，以 5000r/min勻菜10分鐘。將勻漿好的海蜇漿料用超純水(阻抗值不低于18)稀釋100倍，在80°C下加熱10 分鐘，按照8000U/g的標(biāo)準(zhǔn)加入中性蛋白酶，充分?jǐn)嚢杈鶆?，?0°C下酶解1小時(shí)；酶解完成后，將酶解液加熱至沸騰并保持10分鐘滅酶，然后將其在4000r/min下離心15分鐘，收
5集上清液。將該上清液用用濾紙過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀里進(jìn)行真空濃縮，得體積為原體積 1/4的濃縮液。在所得濃縮液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到 50%，靜置12小時(shí)，離心，收集上清液。取收集的上清液用超純水(阻抗值不低于18)稀釋50倍，加入超濾系統(tǒng)的超濾杯中，安裝截留分子量為2. 5kDa的超濾膜包，控制壓力在30psig下進(jìn)行超濾，收集濾出液并濃縮，冷凍干燥后得到純化的海蜇降壓肽粉末。用高血壓SHR大鼠模型進(jìn)行海蜇降壓肽降壓活性試驗(yàn)，在給藥的8周(w)期間，本發(fā)明方法制備的海蜇降壓肽相對于傳統(tǒng)制備方法得到的海蜇降壓肽更能夠使大鼠高血壓癥狀得到緩解。兩種方法制備的海蜇降壓肽注射SHR大鼠后在不同時(shí)間點(diǎn)測得的血壓結(jié)果 (χ士sd, n=8, mmHg)如表 1 所示。
權(quán)利要求
1.一種海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)、去除金屬離子，將鹽漬海蜇和超純水按照1:1-2的比例混合，采用超純水機(jī)抽取去離子水去除海蜇體內(nèi)的各種金屬離子；(2)、將去除金屬離子后的海蜇浙干水分，破碎并攪拌，然后用勻漿機(jī)勻漿；(3)、對步驟(2)得到的海蜇漿料按照8000U/g標(biāo)準(zhǔn)加入中性蛋白酶制作酶解體系，在溫度40-60°C下，酶解1-2小時(shí)；酶解后的酶解液送入發(fā)酵罐進(jìn)行滅酶滅菌，將滅酶滅菌后的酶解液冷卻至室溫，離心，收集上清液；將該上清液用濾紙過濾后置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行真空濃縮，得濃縮液；(4)、在步驟(3)所得濃縮液中加入體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇溶液直至體系中乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)50%，靜置，離心，收集上清液；及(5)、取步驟(4)所得的上清液用阻抗值不低于18的超純水稀釋50倍，加入超濾系統(tǒng)的超濾杯中，安裝截留分子量為2. 5kDa的超濾膜包，進(jìn)行超濾，收集濾出液并濃縮，冷凍干燥后得成品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)去除金屬離子步驟包括1)從超純水機(jī)抽取去離子水，所述去離子水阻抗值不低于10，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘；2)再從超出水機(jī)抽取去離子水，所述去離子水阻抗值不低于15，按照鹽漬海蜇比超純水為1:2的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌30分鐘；及3)三次從超純水機(jī)抽取去離子水，所述去離子水阻抗值不低于18，按照鹽漬海蜇比超純水為1:1的質(zhì)量比將兩者混合，攪拌15分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中， 破碎后海蜇在勻漿機(jī)中以4500-6000r/min勻漿8_20分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中勻漿后，還將勻漿好的海蜇漿料用阻抗值不低于18的超純水稀釋100倍，在80°C下加熱10分鐘，再進(jìn)行酶解。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)勻漿后， 還將勻漿后的海蜇漿料在干燥機(jī)內(nèi)45-55°C通風(fēng)干燥2小時(shí)，制成海蜇粉末。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中滅酶方式為將酶解后的酶解液加熱至沸騰并保持10分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中離心速率為4000r/min，離心時(shí)間為15分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中將過濾后的上清液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至原體積的1/4。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的海蜇降壓肽的制備方法，其特征在于，所述步驟(5)中超濾壓力為 20-30psig。
全文摘要
一種海蜇降壓肽的制備方法，包括對海蜇的去金屬離子處理，并依次進(jìn)行勻漿、酶解、滅酶、濃縮、超濾及冷凍干燥等步驟，最終獲得純化的海蜇降壓肽粉末。本方法結(jié)合現(xiàn)代酶工程技術(shù)，提供了一種新的高效的海蜇降壓肽的生產(chǎn)途徑，提高了海蜇資源的利用效率，具有操作簡單、提取率高、產(chǎn)物活性保存好的特點(diǎn)，海蜇降壓肽生產(chǎn)成本降低。其充分利用海蜇豐富的蛋白質(zhì)資源，通過去金屬離子處理將海蜇體內(nèi)各種金屬離子基本去除干凈，使后續(xù)酶解和應(yīng)用更加安全。用高血壓SHR大鼠模型進(jìn)行海蜇降壓肽降壓活性試驗(yàn)結(jié)果顯示本發(fā)明組與空白對照組相比差異有顯著性，本方法制備的海蜇降壓肽具有與陽性對照卡托普利相似的降血壓活性。
文檔編號C12P21/06GK102286590SQ201110256019
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者林靖善, 胡光耀 申請人:李亞有