專利名稱：用于檢測kras基因突變的試劑盒及其檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測KRAS基因突變的試劑盒及其檢測方法，更具體地說，本發(fā)明涉及一種用于檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12和/或密碼子13突變的試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
基因?qū)蛐缘膫€體化治療是近年來臨床醫(yī)學(xué)和藥物研發(fā)的主要趨勢。KRAS基因突變是目前較為確定的表皮生長因子受體(EGFR)靶向藥物預(yù)測因素。研究表明，腫瘤患者KRAS基因突變狀態(tài)與EGFR靶向藥物治療結(jié)、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌的療效密切相關(guān)，當(dāng)患者腫瘤存在KRAS基因突變時，靶向藥物療效不佳。結(jié)、直腸癌和非小細(xì)胞肺癌患者使用 EGFR靶向藥物治療前，應(yīng)檢測KRAS基因狀態(tài)，該基因檢測能為臨床個體化治療提供科學(xué)依據(jù)，避免不必要的用藥和減少藥物毒副作用。目前對KRAS基因突變檢測的方法主要包括測序、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、變性高效液相色譜(DHPLC)、熒光定量PCR法、基因芯片、液相芯片等方法。測序法因?yàn)榭梢宰x到DNA每個堿基的變化，目前被認(rèn)為是檢測基因突變的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但因?yàn)殪`敏度低，檢測異質(zhì)性較高的臨床腫瘤組織樣本時假陰性率高，同時，測序步驟繁瑣、耗時長，對設(shè)備和操作人員的要求較高，不易于形成標(biāo)準(zhǔn)化操作的臨床診斷產(chǎn)品。SSCP、DHPLC、基因芯片、液相芯片等方法也因操作復(fù)雜、對設(shè)備要求高，目前僅在科研單位實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。熒光定量PCR法檢測基因突變是通過序列特異性探針實(shí)現(xiàn)的，該方法靈敏度高、特異性好，目前已有基于該方法的檢測KRAS基因突變的試劑盒，但該方法需熒光標(biāo)記的特異性探針，一種探針只能進(jìn)行一種基因突變類型的檢測，因此檢測試劑成本高，操作相對復(fù)雜，目前臨床上尚未大規(guī)模使用。因此，有必要提供一種改進(jìn)的方法以實(shí)現(xiàn)對KRAS基因突變的快速、有效且精確的檢測。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的之一在于提供一種用于檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12 和/或密碼子13突變的試劑盒，所述試劑盒包括檢測反應(yīng)液；以及SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:2所表示的引物對。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述檢測反應(yīng)液包含PCR緩沖液、dNTP混合液、 MgCl2, DNA聚合酶以及熒光染料。在本發(fā)明的一個實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括突變對照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對照標(biāo)準(zhǔn)品，所述突變對照標(biāo)準(zhǔn)品包含KRAS基因第12密碼子和/或第13 密碼子的突變型序列，所述野生對照標(biāo)準(zhǔn)品包含野生型KRAS基因序列。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述試劑盒還包括所述試劑盒的使用說明書。此外，本發(fā)明所使用的PCR緩沖液、dNTP 混合液、MgCl2、DNA聚合酶以及熒光染料皆為PCR反應(yīng)的常用材料，可從市場購得。另外， 熒光染料可選擇飽和熒光染料，例如LC Green, LC Green Plus, Eva Green或SYTO 9等。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12和/ 或密碼子13突變的方法，所述方法包括以下步驟(a)提取待測樣品的基因組DNA; (b)對所提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中擴(kuò)增使用SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 2所表示的引物對；以及(c)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，從而確定所述密碼子12和/或密碼子13是否發(fā)生突變。在一個實(shí)施方式中，上述步驟(a)中所述待測樣品為來自結(jié)腸癌、直腸癌或非小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織或其石蠟病理切片。優(yōu)選地，所述待測樣品為來自結(jié)腸癌、直腸癌或非小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織。更優(yōu)選地，所述待測樣品為來自結(jié)腸癌的腫瘤組織。在另一個實(shí)施方式中，優(yōu)選地，所述待測樣品為來自結(jié)腸癌的腫瘤組織的石蠟病理切片。在一個實(shí)施方式中，上述步驟(a)中所述基因組DNA的濃度被調(diào)節(jié)至2-8 ng / PL。優(yōu)選地，所述基因組DNA的濃度被調(diào)節(jié)至3-7 ng / μ 。更優(yōu)選地，所述基因組DNA的濃度被調(diào)節(jié)至4-6 ng / μ 。更優(yōu)選地，所述基因組DNA的濃度被調(diào)節(jié)至4 ng / μ 。在一個實(shí)施方式中，上述步驟(b)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性 3-5分鐘，然后以94°C 10-15秒、65°C 30-45秒進(jìn)行50次循環(huán)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性4-5分鐘，然后以94°C 12-15秒、65°C 30-40秒進(jìn)行50次循環(huán)。在更優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性5分鐘，然后以94°C 15秒、 65 0C 30秒進(jìn)行50次循環(huán)。在一個實(shí)施方式中，在進(jìn)行步驟(C)中所述HRM分析前PCR產(chǎn)物經(jīng)94°C 30秒變性和40°C 30秒復(fù)性后，在75°C到94°C收集熒光。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，在步驟(b)中同時進(jìn)行對突變對照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對照標(biāo)準(zhǔn)品的PCR擴(kuò)增，且在步驟(c)中同時進(jìn)行對突變對照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對照標(biāo)準(zhǔn)品的HRM分析。 所述突變對照標(biāo)準(zhǔn)品包含KRAS基因第12密碼子和/或第13密碼子的突變型序列，所述野生對照標(biāo)準(zhǔn)品包含野生型KRAS基因序列。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于預(yù)測患者對表皮生長因子受體(EGFR)靶向藥物治療效果的方法，所述方法包括以下步驟(a)提取所述患者的腫瘤組織的樣本； (b)提取所述樣本的基因組DNA; (c)確定所述基因組DNA中KRAS基因第2外顯子密碼子 12和/或密碼子13突變狀態(tài)；以及(d)根據(jù)所述突變狀態(tài)確定患者對表皮生長因子受體 (EGFR)靶向藥物治療效果。在本發(fā)明的實(shí)施方式中，所述EGFR靶向藥物主要有兩類一類作用于受體胞內(nèi)區(qū)的小分子酪氨酸激酶抑制劑(TKI)，主要包括吉非替尼、埃羅替尼(Erlotinib)、EKB-569、 PKI-166.GW-2016及CI-1033等；另一類作用于受體胞外區(qū)的單克隆抗體(MAb)，包括西妥昔單抗(cetuximab)、ABX-EGF 及 EMD 72000 等。本發(fā)明采用高分辨率熔解曲線(HRM)分析技術(shù)，該技術(shù)是近幾年來興起的一種用于鑒別基因序列差異的分析方法。其檢測原理是運(yùn)用PCR方法特異性擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞KRAS 基因片段，繼之用HRM法分析擴(kuò)增片段的差異，在HRM分析步驟中，由于反應(yīng)體系中使用了一種小分子熒光飽和染料，使突變導(dǎo)致的DNA分子熔解溫度的微小差異都能突顯出來。這種DNA分析技術(shù)以野生型基因組DNA為參照，能分辨出待檢測樣本中是否含有突變型基因， 具有極高的靈敏度和準(zhǔn)確性。該技術(shù)不受突變堿基位點(diǎn)與類型局限，無需序列特異性探針， 特別適用于突變位點(diǎn)較集中且臨床上無需區(qū)分具體突變類型的突變檢測，檢測突變靈敏度高于傳統(tǒng)測序。本發(fā)明的試劑盒方法可以檢測KRAS基因外顯子2密碼子12和密碼子13上的所有突變類型。在PCR結(jié)束后直接運(yùn)行高分辨熔解，即可完成對樣品突變的分析。與其它KRAS 基因突變檢測方法相比較，本發(fā)明方法具有其以下優(yōu)點(diǎn)簡單HRM無需序列特異性探針， 不受堿基位點(diǎn)局限，同時檢出已知或未知突變；全程閉管操作，避免交叉污染；易形成標(biāo)準(zhǔn)化操作的體外診斷試劑產(chǎn)品；高效可檢測出低至1%的突變分子，檢測靈敏度和特異性高； 快速可同時分析多個樣本，在60-90分鐘內(nèi)完成檢測；成本低無需熒光標(biāo)記探針，試劑成本低，適合臨床單位應(yīng)用。


下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
，對本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進(jìn)行進(jìn)一步說明。圖1為本發(fā)明的一個實(shí)施方式的樣本中含有KRAS基因第12密碼子GGT>GAT突變的HRM分析圖。圖2為本發(fā)明的一個實(shí)施方式的樣本中不含KRAS基因第12密碼子GGT>GAT突變的HRM分析圖。圖3為本發(fā)明的一個實(shí)施方式的樣本中含有KRAS基因第13密碼子GGOGAC突變的HRM分析圖。圖4為本發(fā)明的一個實(shí)施方式的樣本中不含KRAS基因第13密碼子GGOGAC突變的HRM分析圖。圖5為本發(fā)明的一個實(shí)施方式的樣本中含有KRAS基因第12密碼子GGT>TGT突變的HRM分析圖。圖6為本發(fā)明的一個實(shí)施方式的樣本中不含KRAS基因第12密碼子GGT>TGT突變的HRM分析圖。圖7為對不同突變比例的KRAS G12D (GGT>GAT)突變質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測的HRM分析圖，其顯示突變檢出靈敏度達(dá)1%。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
和實(shí)驗(yàn)詳細(xì)說明本發(fā)明的特征，但是，可以理解的是，說明書中的具體實(shí)施方式
僅僅用于對本發(fā)明進(jìn)行說明，并不能被解釋為對本發(fā)明的限制。
實(shí)施例實(shí)施例1.臨床采集的結(jié)腸癌腫瘤組織樣本KRAS基因發(fā)生在密碼子12的G12D (GGT)GAT)突變的檢測
在本實(shí)施例中，采用本發(fā)明的方法檢測結(jié)腸癌腫瘤組織樣本基因發(fā)生在密碼子12處是否發(fā)生突變。實(shí)驗(yàn)方案如下
1.樣品處理和基因組DNA提取接受來自臨床手術(shù)切除的結(jié)腸癌腫瘤組織樣品，將腫瘤組織剪碎，按照QIAamp DNA Mini試劑盒(凱杰生物技術(shù)(上海)有限公司)說明書操作進(jìn)行基因組DNA提取。將DNA濃度調(diào)整到4 ng/^L，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?.樣本DNA KRAS基因的特異性擴(kuò)增(羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司LightCycler 480實(shí)時熒光定量PCR儀) 'I'反應(yīng)體系的配制
權(quán)利要求
1.一種用于檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12和/或密碼子13突變的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括檢測反應(yīng)液；以及SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2所表示的引物對。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述檢測反應(yīng)液包含PCR緩沖液、dNTP 混合液、MgCl2, DNA聚合酶和熒光染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括突變對照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對照標(biāo)準(zhǔn)品，所述突變對照標(biāo)準(zhǔn)品包含KRAS基因第12密碼子和/或第13密碼子的突變型序列，所述野生對照標(biāo)準(zhǔn)品包含野生型KRAS基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括所述試劑盒的使用說明書。
5.一種用于檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12和/或密碼子13突變的方法，所述方法包括以下步驟(a)提取待測樣品的基因組DNA;(b)對所提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，擴(kuò)增使用SEQID NO:ID NO:2 所表示的引物對；以及(c)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析，從而確定所述密碼子12和/或密碼子13是否發(fā)生突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述待測樣品為來自結(jié)腸癌、 直腸癌或非小細(xì)胞肺癌的腫瘤組織或其石蠟病理切片。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟(a)中所述基因組DNA的濃度被調(diào)節(jié)至2-8 ng/μ L。
8.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，步驟(b)中所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為在94°C預(yù)變性3-5分鐘，然后以94°C 10-15秒、65°C 30-45秒進(jìn)行50次循環(huán)。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，在進(jìn)行步驟(c)中所述HRM分析前 PCR產(chǎn)物經(jīng)94°C 30秒變性和40°C 30秒復(fù)性后，在75°C到94°C收集熒光。
10.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的方法，其特征在于，在步驟(b)中同時進(jìn)行對突變對照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對照標(biāo)準(zhǔn)品的PCR擴(kuò)增，且在步驟(c)中同時進(jìn)行對突變對照標(biāo)準(zhǔn)品和野生對照標(biāo)準(zhǔn)品的HRM分析。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12和/或密碼子13突變的試劑盒，其包括檢測反應(yīng)液；以及SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所表示的引物對。本發(fā)明還提供一種用于檢測KRAS基因第2外顯子密碼子12和/或密碼子13突變的方法，該方法包括(a)提取待測樣品的基因組DNA；(b)對所提取的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其中，擴(kuò)增使用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所表示的引物對；以及(c)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行HRM分析。本發(fā)明的方法簡單、高效、快速且成本低，適合臨床單位應(yīng)用。
文檔編號C12Q1/68GK102304581SQ20111025663
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月1日
發(fā)明者吳嵐曉, 張穎芬, 曾慶, 鄒鴻志 申請人:廣州好芝生物科技有限公司