專利名稱：一種提供多種細胞協(xié)同生長的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提供多種細胞協(xié)同生長的方法，還涉及與該方法相關的制備材料和制備工藝。
背景技術：
隨著細胞生物學的發(fā)展，人們越來越認識到不同種類細胞間相互作用的重要性。而細胞間相互作用的研究包含了幾個方面細胞間直接接觸產(chǎn)生生物學效應；細胞間通過細胞外基質(zhì)產(chǎn)生生物學效應；細胞間通過化學信號配體、受體產(chǎn)生生物學效應等。而目前對上述效應的研究和應用都是在開放體系，細胞間直接接觸共培養(yǎng)的情況下進行。這種方法的最大缺點就是難以區(qū)別細胞間相互作用的產(chǎn)生是由于直接接觸效應還是單純的化學信號傳導效應，且不同種類細胞不易分離，無法考察相互作用后單種細胞產(chǎn)生的生物學效應。 針對此問題，有研究者發(fā)明了 Transwell insert技術[參考文獻Le Visage,C ;Dunham,B ;Flint，P，et al. . Coculture of mesenchymal stem cells and respiratory epithelialcells to engineer a human composite respiratory mucosa，Tissue Engineering，2004，
10 1426-1435]，實現(xiàn)細胞分層培養(yǎng)，互不接觸，僅通過培養(yǎng)液實現(xiàn)信號傳導，分析細胞間的相互作用。但該技術的最大缺陷是無法提供細胞模擬在體的三維環(huán)境，應用時無法實現(xiàn)規(guī)模放大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新型的實現(xiàn)多種細胞協(xié)同生長的方法，是將生理條件下制備的水凝膠載體，以大載體中包埋小載體的方式，在不同載體中培養(yǎng)不同種類的細胞，通過控制小載體膜孔隙的截留分子量、表面電荷、粗糙度等參數(shù)，提供研究細胞間化學信號傳遞和相互作用的方法。該方法的結(jié)構(gòu)示意圖見附圖I。該方法與“生物人工反應裝置中的兩步微囊制備方法”[專利申請?zhí)?00910029377. 9]最大的區(qū)別在于大載體不具有半透膜結(jié)構(gòu)，由此可采用不同方法破碎大載體和小載體，從而實現(xiàn)分別回收不同載體中的不同細胞，有利于下游實驗的操作，使得該方法可用于細胞間相互作用的研究。本發(fā)明提供的方法可用于研究存在于兩種不同細胞間的相互作用，如子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞可調(diào)控上皮細胞的增殖和分化，軟骨細胞可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化，激活的小膠質(zhì)細胞可調(diào)控神經(jīng)元的存活；也可用于研究存在于多種細胞間的相互作用，如樹突狀細胞和細胞因子誘導的殺傷細胞可殺傷腫瘤細胞，腫瘤細胞和肌成纖維細胞可促進血管內(nèi)皮細胞活化；也可用于研究存在于細胞和組織間的相互作用，如骨髓間充質(zhì)干細胞可保護胰島的功能和活性，椎間盤可誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向椎間盤樣細胞分化。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的制備方法和工藝流程如下I)將細胞a均勻分散到10_40g/L海藻酸鈉溶液中，在0.01-1.011101/1的0&(12溶液作為凝膠浴或以0. 05-0. lmol/L碳酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣顆粒為分散相的條件下，制備出包埋有細胞a的海藻酸鈣微球，再與pH4-6的l-8g/L殼聚糖或0. 2-lg/L聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸中的一種溶液反應成膜，制備出包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊；也可以在步驟I之后，用鈣離子螯合劑20-80mmol/L檸檬酸鈉或O. 5-1OmmoI/LEDTA使水凝膠載體A內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有細胞a的海藻酸鈉微膠囊;2)將包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊和細胞b共同均勻分散到10_40g/L海藻酸鈉溶液中，在O. 01-1. OmoI/L的CaCl2溶液作為凝膠浴或以O. 05-0. lmol/L碳酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣顆粒為分散相的條件下，制備出包埋有含細胞a的海藻酸鈣微膠囊和細胞b的海藻酸韓微球；3)經(jīng)過培養(yǎng)后，當需要回收細胞時，用鈣離子螯合劑20-80mmol/L檸檬酸鈉或
O.5-1OmmoI/L EDTA使水凝膠載體B液化，釋放載體B中的細胞b，經(jīng)過過濾，細胞b與包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊分離，離心收集細胞b。再通過用機械方法如研磨或化學方法如 “一種在生理條件下溶解載細胞微膠囊的方法及配方”[專利申請?zhí)?2127631. 5]中提供的方法進行包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊的破碎，釋放出包埋的細胞a，離心收集細胞a。需要說明的是，關于制備海藻酸鈣微球或海藻酸鈉微膠囊的方法是一種公知的技術，比如采用靜電液滴法、氣動液滴法、乳化-外部凝膠化法、乳化-內(nèi)部凝膠化、膜乳化/內(nèi)部凝膠化、膜乳化/外部凝膠化等均可以制備出本發(fā)明所述的海藻酸鈣微球或海藻酸鈉微膠囊(載體A、B均可采用如下文獻工藝內(nèi)容進行操作)，為簡明起見，本發(fā)明對這些公知技術不作詳細描述。有關這些公知技術的詳細報道可參閱靜電液滴法[參閱文獻HommelM, Sun AM, Goosen MFA. Droplets generation.Canadian patent No. 1241598,1988]；氣動液滴法[參閱文獻MiyawakiO, Nakamura K, Yano T. Agric. Biol.Chem. 1980,44 :2865-2870]；乳化/內(nèi)部凝膠化[參閱文獻劉群，馬小軍，劉袖洞。一種乳化/內(nèi)部凝膠化制備海藻酸鈣凝膠珠的方法。中國專利NO.ZL01109449.4]；膜乳化/內(nèi)部凝膠化[參閱文獻劉袖洞，馬小軍，劉群。一種制備海藻酸鈣凝膠珠的膜乳化/內(nèi)部凝膠化耦合技術，中國專利No. ZL01104365. 2]；乳化/ 外部凝膠化[參閱文獻Lucinda_silva RM, EvangelistaRC. J. Microencapsulation, 2003, 20 145-152]膜乳化/ 外部凝膠化[參閱文獻You JO, Park SB, Park HY, Haam S, Chung CH,Kim WS. J. Microencapsulation, 2001,18 :521-532]海藻酸鈉微膠囊[參閱文獻I Ma X, Vacek I, Sun A. Artif Cells Blood SubstitTmmobi I Biotechnol, 1994, 22 :43-69 ;參閱文獻 2 Mcknight C. A. , Ku A, Goosen M. F. A.，Sun D, Penney C. J BIOACT COMPAT POL, 1988,3 :334-355]通過上述工藝制備出的包埋有細胞a的載體A和包埋有細胞b的水凝膠載體B，兩種載體在空間形成了細胞a、b的非直接接觸效應，用于研究不同種類細胞間的協(xié)同生長。上述兩種載體的空間分布是載體B包含載體A，載體B粒徑大于載體A粒徑；每種載體中含有一種細胞或二種以上不同種類的細胞或組織，且不同種類細胞或組織均處于三維培養(yǎng)環(huán)境。其中，載體A制備成具有半透膜結(jié)構(gòu)的微膠囊，膜孔隙大小由載體A和聚陽離子高分子材料的濃度決定，其截留分子量在60KDa-200KDa可控[截留分子量檢測方法參閱文獻解玉冰，馬小軍，虞星炬，袁權。膜科學與技術，1997，17 :15-19]。載體B制備成不具有半透膜結(jié)構(gòu)的微球，從而實現(xiàn)兩種載體可分別采用不同破碎方法先后釋放出其中的細胞，即首先用鈣離子螯合劑使水凝膠載體B液化，釋放載體B中的細胞b，經(jīng)過過濾，細胞b與載體A分離，離心收集細胞b ;再通過機械方法或化學方法破碎載體A，釋放出包埋的細胞a，離心收集細胞a，從而實現(xiàn)細胞間發(fā)生相互作用后的分別獲得，分別考察不同細胞的生物學效應。本發(fā)明具有如下優(yōu)點I、每種載體中可含有一種或二種以上不同種類的細胞或組織；
2、提供不同種類細胞的非直接接觸空間；3、實現(xiàn)不同種類細胞或組織均在三維環(huán)境中的生長；4、不同細胞間通過化學信號傳遞產(chǎn)生生物學效應；5、細胞間相互作用后產(chǎn)生的效應可以通過分別破碎各載體依次獲得不同種類細胞來考察；6、實際應用時易于回收和規(guī)模放大；


圖I為含細胞b的載體B包埋含細胞a的載體A的結(jié)構(gòu)示意圖。I載體A，2細胞a，3細胞b，4載體B。
具體實施例方式I.考察軟骨細胞與骨髓間充質(zhì)干細胞兩種細胞間的相互作用I)從SD大鼠(4周齡)取得股骨和脛骨，用一次性注射器吸取無血清DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，獲得骨髓細胞，經(jīng)細胞密度梯度離心法分離純化，用含15%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，于37°C、5% C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)傳代，至第3代后，運用流式細胞儀檢測細胞表面標記物進行骨髓間充質(zhì)干細胞的驗證；2)從SD大鼠(4周齡)的股骨和脛骨頭表面獲取關節(jié)軟骨，剪碎后，用2g/L的胰蛋白酶消化5hr后，再按體積比I : 10加入2. 5g/L的II型膠原酶消化，獲取關節(jié)軟骨細胞，用含15 %胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，于37 °C、5 % C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行原代培養(yǎng)，并運用甲苯胺藍及蘇木精/伊紅染色進行關節(jié)軟骨細胞的驗證；3)將關節(jié)軟骨細胞以I X IO6個/ml密度均勻分散到15g/L海藻酸鈉溶液中，在
0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為350 y m包埋有關節(jié)軟骨細胞的海藻酸鈣微球，再與0. 5g/L聚賴氨酸水溶液反應IOmin成膜，之后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有關節(jié)軟骨細胞的海藻酸鈉微膠囊;4)將第3代骨髓間充質(zhì)干細胞以I X IO6個/ml密度均勻分散到15g/L海藻酸鈉溶液中，再按I : 3體積比和包埋有關節(jié)軟骨細胞的海藻酸鈉微膠囊混勻，在O.Olmol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為600 u m包埋有含關節(jié)軟骨細胞的海藻酸鈉微膠囊和骨髓間充質(zhì)干細胞的海藻酸鈣微球，清洗后，用含15%胎牛血清的DMEM細胞培養(yǎng)基，于37°C、5% C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；5)培養(yǎng)5、10、15天后，用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使海藻酸鈣微球液化，釋放海藻酸鈣微球中的骨髓間充質(zhì)干細胞和海藻酸鈉微膠囊，經(jīng)過篩網(wǎng)過濾，骨髓間充質(zhì)干細胞與海藻酸鈉微膠囊分離，IOOOrpm離心5min收集骨髓間充質(zhì)干細胞，備用；再通過用機械研磨方法進行海藻酸鈉微膠囊的破碎，釋放出包埋的關節(jié)軟骨細胞，經(jīng)過篩網(wǎng)過濾除去微囊碎片，IOOOrpm離心5min收集關節(jié)軟骨細胞,備用；6)運用阿利新藍比色法測定骨髓間充質(zhì)干細胞氨基聚糖含量，具體操作如下將回收的骨髓間充質(zhì)干細胞用4°C預冷的PBS清洗；加入細胞裂解液，冰上裂解30min后，12000rpm離心5min ;吸取上清，加入PBS至Iml ;加入O. 5ml 5mg/L胰蛋白酶37°C水解24hr ;加入O. 5ml 5mg/L木瓜蛋白酶37°C水解24hr，備用；氨基聚糖標準曲線繪制加入Iml濃度為l、5、10、15、20、25、35、50mg/L的標準硫酸軟骨素溶液，空白對照加入Iml去離子水，再加入I. 5ml I. 4g/L的阿利新藍染液,混勻，IOmin后測定480nm的吸光度,繪制標準曲線；取樣品Iml,加入1.5ml I. 4g/L的阿利新藍染液,混勻，IOmin后測定480nm的吸光 度，并通過標準曲線計算出樣品中氨基聚糖含量。結(jié)果提示氨基聚糖含量隨著培養(yǎng)時間的延長而增加，說明關節(jié)軟骨細胞可通過非直接接觸方式誘導骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化；2.考察腫瘤細胞和成纖維細胞兩種細胞與血管內(nèi)皮細胞間的相互作用I)將人膠質(zhì)瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF等比例以2X IO6個/ml密度均勻分散到15g/L海藻酸鈉溶液中，在O. 01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為350 μ m包埋有人膠質(zhì)瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈣微球，再與O. 5g/L聚賴氨酸水溶液反應IOmin成膜，之后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有人膠質(zhì)瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈉微膠囊；2)將人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304以2 X IO6個/ml密度均勻分散到15g/L海藻酸鈉溶液中，再按I : 3體積比和包埋有人膠質(zhì)瘤細胞U87和人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈉微膠囊混勻，在O. 01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為600 μ m包埋有含人膠質(zhì)瘤細胞U87與人胚肺成纖維細胞HELF的海藻酸鈉微膠囊和人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304的海藻酸鈣微球，清洗后，用含15%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基，于37°C、5% C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；3)培養(yǎng)I天和5天后，用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使海藻酸鈣微球液化，釋放海藻酸鈣微球中的人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304和海藻酸鈉微膠囊，經(jīng)過篩網(wǎng)過濾，細胞ECV304與海藻酸鈉微膠囊分離，IOOOrpm離心5min收集細胞ECV304,備用；4)運用RT-PCR方法檢測人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304細胞周期素Cyclin E表達，具體操作如下將回收的ECV304細胞用PBS清洗，采用Trizol法提取總RNA ;按照試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄和PCR反應；上游引物5’ -CTG GAT GTT GAC TGC CTT GA-3’，下游引物5，-CCG CTG CTC TGC TTC TTA C-3’；反應參數(shù)95°C預變性 5min，95°C變性 40sec，53°C退火35sec，72°C延伸35sec，共30個循環(huán)，于72°C保溫IOmin終止反應；反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳并進行半定量分析。結(jié)果提示培養(yǎng)5天后，ECV304細胞Cyclin E表達上調(diào)，說明腫瘤細胞和成纖維細胞兩種細胞共培養(yǎng)可通過非直接接觸方式促進內(nèi)皮細胞的增殖。
3.考察骨髓間充質(zhì)干細胞與胰島間的相互作用I)從BALB/c小鼠(8周齡)取得股骨和脛骨，用一次性注射器吸取無血清RPMI1640培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，獲得骨髓細胞，用含20%胎牛血清的RPMI 1640細胞培養(yǎng)基，于37°C、5% C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)進行差速貼壁培養(yǎng)，傳代至第5代，運用流式細胞儀檢測細胞表面標記物進行骨髓間充質(zhì)干細胞的驗證；2)將BALB/c小鼠(8周齡)處死后，打開腹腔，暴露膽總管，結(jié)扎膽胰管在十二指腸的開口，沿膽總管逆行灌注Hank’s液(含0. 5mg/ml膠原酶P和8mg/ml DNase I),胰腺膨脹后，立即摘除胰腺組織，置入4°C Hank’ s液清洗后，剪成小塊，于37°C振蕩消化，成絮狀后,立即加入4°C Hank’ s液,離心洗漆,之后加入Hank’ s液混懸,運用110g/L、200g/L、230g/L的Ficoll進行梯度離心，純化胰島，并運用DTZ進行胰島的驗證；3)將分離得到的IOOiim左右的胰島均勻分散到15g/L海藻酸鈉溶液中，在 0.01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為300-400 y m包埋有胰島的海藻酸鈣微球，再與5g/L殼聚糖(MW40kD)醋酸溶液反應5min成膜，之后用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有胰島的海藻酸鈉微膠囊；4)將第5代骨髓間充質(zhì)干細胞以I X IO6個/ml密度均勻分散到15g/L海藻酸鈉溶液中，再按I : 3體積比和包埋有胰島的海藻酸鈉微膠囊混勻，在0. 01mol/L的CaCl2溶液作為凝膠浴，采用靜電液滴法，制備出粒徑為600-700 包埋有含胰島的海藻酸鈉微膠囊和骨髓間充質(zhì)干細胞的海藻酸鈣微球，清洗后，用含20%胎牛血清的RPMI1640細胞培養(yǎng)基，于37°C、5% C02、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；5)培養(yǎng)I天和10天后，離心收集上清，備用。并用55mmol/L檸檬酸鈉溶液使海藻酸鈣微球液化，釋放海藻酸鈣微球中的骨髓間充質(zhì)干細胞和海藻酸鈉微膠囊，經(jīng)過篩網(wǎng)過濾，骨髓間充質(zhì)干細胞與海藻酸鈉微膠囊分離；再通過用含5mol/L EDTA、20mmol/L碳酸氫鈉和35mmol/L檸檬酸鈉的破囊液按體積比10 I與海藻酸鈉微膠囊混合，進行海藻酸鈉微膠囊的破碎，釋放出包埋的胰島，IOOOrpm離心3min收集胰島，備用；6)運用酶聯(lián)免疫法檢測上清中胰島素含量，具體操作按試劑盒說明書進行，通過測定，可知培養(yǎng)10天后胰島素分泌水平提高，說明骨髓間充質(zhì)干細胞可通過非直接接觸方式維持胰島的功能；7)運用Calcein AM/ED-1活性染色檢測胰島活性,具體操作如下加入Hank’s液IOOOrpm離心 3min 洗漆膜島;吸棄 Hank’s 液,加入 2 u mol/L Calcein AM和 4iimol/L ED-I染液覆蓋胰島；37°C孵育45min ;于共聚焦顯微鏡下對胰島進行斷層掃描，可觀察到培養(yǎng)10天后仍能維持胰島活性，說明骨髓間充質(zhì)干細胞可通過非直接接觸方式維持胰島的活性。
權利要求
1.一種提供多種細胞協(xié)同生長的方法，其特征在于 1)首先制備包埋有細胞a的水凝膠載體A;再將包埋有細胞a的水凝膠載體A與聚陽離子高分子溶液反應成膜； 2)再將包膜的水凝膠載體A與另一種細胞b共同分散到水凝膠制備材料中，制備出包埋有包膜的載體A和細胞b的水凝膠載體B，兩種載體在空間形成了細胞a、b的非直接接觸效應； 3)其中，細胞a或b分別可以為一種或二種以上不同種類的細胞或組織；細胞a和細胞b之間通過非直接接觸效應協(xié)同生長，細胞a或b可以影響細胞b或a的增殖、凋亡、分化、細胞外泌功能中的一種或多種。
2.按照權利要求I所述的方法，其特征在于 細胞a或b分別為一種或二種以上不同種類的細胞或組織；所述細胞a和b為具有可通過細胞a、b非直接接觸方式由化學信號傳遞進行相互作用的細胞組合；所述相互作用是指細胞a或b可以影響細胞b或a的增殖、凋亡、分化、細胞外泌功能中的一種或多種。
3.按照權利要求I或2所述的方法，其特征在于 細胞a和b可以為不同的細胞或組織，分別對應于下述細胞的不同組合子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞和上皮細胞，軟骨細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞，小膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元，樹突狀細胞與殺傷細胞、和腫瘤細胞，腫瘤細胞與肌成纖維細胞、和血管內(nèi)皮細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞和胰島，椎間盤和骨髓間充質(zhì)干細胞。
4.按照權利要求I所述的方法，其特征在于 載體A與載體B分別是以海藻酸鈉為水凝膠材料，載體A制備成微膠囊，載體B制備成微球；兩種載體的空間分布是微球內(nèi)包含微膠囊，微球粒徑大于微膠囊粒徑； 微膠囊具有半透膜結(jié)構(gòu)，膜孔隙大小由載體A和聚陽離子高分子材料的濃度決定，其截留分子量在60KDa-200KDa可控。
5.按照權利要求I或3所述的方法，其特征在于 聚陽離子高分子溶液為PH4-6的l-8g/L殼聚糖或O. 2-lg/L聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸中的一種。
6.按照權利要求I所述的方法，其特征在于 制備載體A的水凝膠材料為海藻酸鈉，采用靜電液滴法、氣動液滴法、乳化-內(nèi)部凝膠化、膜乳化/內(nèi)部凝膠化、乳化-外部凝膠化或膜乳化/外部凝膠化方法制備出海藻酸鈣微球，再采用殼聚糖、聚賴氨酸、聚精氨酸或聚鳥氨酸包膜制備出海藻酸鈣微膠囊； 載制備體B的水凝膠材料為海藻酸鈉，采用靜電液滴法、氣動液滴法、乳化-內(nèi)部凝膠化、膜乳化/內(nèi)部凝膠化、乳化-外部凝膠化或膜乳化/外部凝膠化方法制備出海藻酸鈣微球。
7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于 包膜后的載體A制備后也可用I丐離子螯合劑20-80mmol/L朽1檬酸鈉或O. 5-10mmol/LEDTA使水凝膠載體A內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有細胞a的海藻酸鈉微膠囊。
8.按照權利要求I或5所述的方法，其特征在于 經(jīng)過培養(yǎng)后，載體A和載體B內(nèi)的細胞a和細胞b可分別收集；載體A和載體B破碎解離的方法不同；首先用鈣離子螯合劑20-80mmol/L檸檬酸鈉或0. 5-1OmmoI/L EDTA使水凝膠載體B液化，釋放載體B中的細胞b，經(jīng)過過濾，細胞b與包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊分離，離心收集細胞b ; 再通過機械方法或化學方法破碎包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊，釋放出包埋的細胞a，離心收集細胞a，從而實現(xiàn)細胞間發(fā)生相互作用后的分別獲得，分別考察不同細胞的生物學效應。
9.按照權利要求I所述的方法，其特征在于 該技術的制備步驟如下 1)將細胞a均勻分散到10-40g/L海藻酸鈉溶液中，在0.01-1.011101/1的0&(12溶液作為凝膠浴或以0. 05-0. lmol/L碳酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣顆粒為分散相的條件下，采用靜電液滴法、氣動液滴法、乳化_內(nèi)部凝膠化、膜乳化/內(nèi)部凝膠化、乳化_外部凝膠化或膜乳化/外部凝膠化方法制備出包埋有細胞a的海藻酸鈣微球，再與pH4-6的l-8g/L殼聚糖溶液或0. 2-lg/L聚賴氨酸、聚精氨酸、聚鳥氨酸中的一種溶液反應成膜，制備出包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊； 也可在步驟I)之后，用鈣離子螯合劑20-80mmol/L檸檬酸鈉或0. 5-1OmmoI/L EDTA使水凝膠載體A內(nèi)部液化，制備出內(nèi)部為液體環(huán)境的包埋有細胞a的海藻酸鈉微膠囊； 2)將包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊和細胞b共同均勻分散到10-40g/L海藻酸鈉溶液中，在0. 01-1. OmoI/L的CaCl2溶液作為凝膠浴或以0. 05-0. lmol/L碳酸鈣、檸檬酸鈣、乳酸鈣顆粒為分散相的條件下，采用靜電液滴法、氣動液滴法、乳化_內(nèi)部凝膠化、膜乳化/內(nèi)部凝膠化、乳化_外部凝膠化或膜乳化/外部凝膠化方法制備出包埋有含細胞a的海藻酸隹丐微膠囊和細胞b的海藻酸韓微球； 3)經(jīng)過培養(yǎng)后，當需要回收細胞時，首先用鈣離子螯合劑20-80mmol/L檸檬酸鈉或·0.5-1OmmoI/L EDTA使水凝膠載體B液化，釋放載體B中的細胞b，經(jīng)過過濾，細胞b與包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊分離，離心收集細胞b ; 再通過用機械方法或化學方法進行包埋有細胞a的海藻酸鈣微膠囊的破碎，釋放出包埋的細胞a，離心收集細胞a。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提供多種細胞協(xié)同生長的方法，其特征是將生理條件下制備的水凝膠載體，以大載體中包埋小載體的方式，在不同載體中培養(yǎng)不同種類細胞，提供研究細胞間化學信號傳遞和相互作用的方法。該方法的最大優(yōu)點是載體中可含有一種或二種以上不同種類的細胞或組織；提供不同種類細胞的非直接接觸空間；實現(xiàn)不同種類細胞或組織均在三維環(huán)境中的生長；不同細胞間通過化學信號傳遞產(chǎn)生生物學效應；細胞間相互作用后產(chǎn)生的效應可以通過分別破碎各載體依次獲得不同種類細胞來考察；實際應用時易于回收和規(guī)模放大。
文檔編號C12N11/10GK102965330SQ20111025732
公開日2013年3月13日 申請日期2011年9月1日 優(yōu)先權日2011年9月1日
發(fā)明者馬小軍, 李楠, 于煒婷, 孫廣煒, 王為 申請人:中國科學院大連化學物理研究所