專利名稱：化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，屬于工業(yè)蛋白粉的制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
制革生產(chǎn)中由于修邊、片皮和削勻等操作工序會(huì)產(chǎn)生大量的邊角余料，俗稱制革下腳料。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國(guó)制革行業(yè)中每年產(chǎn)生的下腳料達(dá)140萬(wàn)噸。如果將這類下腳料直接排放到環(huán)境中，不僅是資源的巨大浪費(fèi)，而且會(huì)造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。因此，對(duì)這些制革下腳料進(jìn)行回收再利用對(duì)制革工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。制革下腳料中一部分為含鉻下腳料，約占60% ；而另一部分為不含鉻下腳料，約占40%。隨著白濕皮技術(shù)在制革行業(yè)中的推廣應(yīng)用，不含鉻制革下腳料的數(shù)量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。制革下腳料的主要成分為膠原蛋白，約占總量的80 90%，是寶貴的蛋白資源。 在過(guò)去，制革下腳料主要用作生產(chǎn)飼料添加劑，但由于存在基因病的風(fēng)險(xiǎn)(G. J. Piazza, R. A. Garcia. Proteins and peptides as renewable flocculants, Bioresource Technology, 2010，101 :5759-5766)，近年來(lái)歐美及我國(guó)已禁止使用制革下腳料生產(chǎn)飼料添加劑。另一方面，由于蛋白類助劑(蛋白類表面活性劑、蛋白類膠粘劑等)具有獨(dú)特的功能特性和良好的生物降解性，因此可從制革下腳料中提取工業(yè)蛋白并以此生產(chǎn)各種助劑。但是，此類工業(yè)蛋白的分子量及其分布對(duì)下游產(chǎn)品的性能將產(chǎn)生重大影響(蔣挺大.膠原與膠原蛋白.化學(xué)工業(yè)出版社，2006，1-7)。例如，在制備浮選劑、絮凝劑、水凝膠和膠粘劑等產(chǎn)品時(shí)，一般應(yīng)選擇高分子量的工業(yè)蛋白作為原料，因?yàn)榇蠓肿拥牡鞍自跉滏I和疏水鍵的作用下更易形成分子間的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而具有更大的比表面積和更多的作用位點(diǎn)，進(jìn)而賦予產(chǎn)品良好的吸附性、持水性和粘結(jié)性；在開(kāi)發(fā)滲透劑、乳化劑等產(chǎn)品時(shí)，一般選擇中、 小分子量的工業(yè)蛋白作為原料，因?yàn)橹?、小分子的膠原蛋白具有更優(yōu)的溶解性和親水性，進(jìn)而賦予下游產(chǎn)品更優(yōu)的性能；在與其它高分子共混制備復(fù)合材料時(shí)，所采用工業(yè)蛋白的分子量性質(zhì)也將對(duì)復(fù)合材料的性能產(chǎn)生顯著影響。然而，我國(guó)以制革下腳料為原料制備工業(yè)蛋白粉的傳統(tǒng)工藝為酸法或堿法(劉忠.用皮革下腳料生產(chǎn)蛋白粉的方法.ZL95117460. 6 ； 張小燕，楊德玉，高全昌等.皮革下腳料提取蛋白的方法.ZL01106725. X)，上述方法雖然工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本較低，但膠原蛋白在被提取的過(guò)程中自身結(jié)構(gòu)受到嚴(yán)重的破壞，所得到蛋白粉的分子量及其分布難以控制，無(wú)法滿足生產(chǎn)具有高性能的下游產(chǎn)品的要求，而以制革下腳料為原料制備具有特定分子量工業(yè)蛋白粉的方法鮮有報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特點(diǎn)是克服傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝上的局限性，而建立一套以制革下腳料生產(chǎn)具有特定分子量及其分布的工業(yè)蛋白粉的方法，為生產(chǎn)具有高性能的工業(yè)蛋白產(chǎn)品提供必要的原料。
本發(fā)明的目的由以下技術(shù)措施實(shí)現(xiàn)，其中所述原料份數(shù)除特殊說(shuō)明外，均為重量份數(shù)。本發(fā)明者在考察以制革下腳料為原料制備得到的工業(yè)蛋白粉的性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，化學(xué)與酶協(xié)同工藝對(duì)水解制革下腳料中的膠原蛋白具有高效的靶向性和特異性，它可以選擇性地破壞膠原分子間的作用力和膠原分子內(nèi)的特定位置的化學(xué)鍵，進(jìn)而得到具有特定分子量及其分布的膠原蛋白粉。化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法包括以下步驟(1)將100份制革下腳料粉碎到粒度0. 1 0. 5mm,加入到400 800份水中，于溫度40 60°C浸泡0. 5 4. Oh,加入1 5份化學(xué)試劑，于溫度40 60°C攪拌反應(yīng)0. 5 4. Oh,再加入0. 2 0. 8份蛋白酶，于溫度40 70°C攪拌反應(yīng)2 6h，然后調(diào)節(jié)溶液pH至 6-8 ；(2)對(duì)步驟(1)反應(yīng)后的物料進(jìn)行酶滅活處理，然后過(guò)濾；(3)將步驟⑵中濾液進(jìn)行干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品；得到的產(chǎn)品分別為具有平均分子量1 5kDa，10 50kDa或100 300kDa的工業(yè)蛋白粉。制革下腳料為未經(jīng)鉻鞣制的邊角余料，包括牛皮、羊皮和豬皮?；瘜W(xué)試劑為氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸銨、鹽酸或硫酸中的任一種。蛋白酶為1398蛋白酶、2709蛋白酶、Alcalase、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、Neutral、 537蛋白酶、木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、蛋白酶K、鏈酶蛋白酶或胃蛋白酶中的任一種。酶滅活處理為在溫度100°C攪拌5 IOmin或加入0. 01 0. 5份過(guò)氧化氫在溫度30 60°C攪拌5 IOmin。干燥方式為噴霧干燥、熱風(fēng)干燥或冷凍干燥中的任一種。性能測(cè)試1.平均分子量的測(cè)定采用水相凝膠色譜法，凝膠色譜儀型號(hào)WaterS1515，測(cè)試范圍1 IOOOkDa02.氨基含量的測(cè)定采用甲醛滴定法(遲原龍等.膠原水解度的測(cè)定.中國(guó)皮革， 2010,39 13 16)。3.等電點(diǎn)的測(cè)定采用Zeta電位法，Zeta電位儀型號(hào)MalvernNano S90。4.基團(tuán)分析利用傅里葉紅外光譜儀，紅外光譜儀型號(hào)Thermofisher Nicdet is 10，測(cè)定范圍500 4000cm-1 ο5.分子量分布測(cè)定采用SDS-PAGE電泳法，電泳儀型號(hào)=Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra System，測(cè)定范圍3kDa 220kDa。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)1.采用本發(fā)明方法可以選擇性地制備得到具有特定性質(zhì)的工業(yè)蛋白粉，如分子量分布、等電點(diǎn)、氨基和羧基含量、氨基酸組成等，進(jìn)而賦予蛋白粉不同的結(jié)構(gòu)特征、物化性質(zhì)和功能特性等，為制備具有高性能的工業(yè)蛋白產(chǎn)品提供必要的原料。2.本發(fā)明方法生產(chǎn)過(guò)程簡(jiǎn)單，操作性強(qiáng)，易于推廣，且所得產(chǎn)品有較高的附加值， 具有良好的市場(chǎng)前景。
3.本發(fā)明方法以皮革廢棄物為原料，對(duì)制革工業(yè)的節(jié)能減排和生物質(zhì)資源的再利用具有積極作用。并且本發(fā)明方法采用化學(xué)與酶協(xié)同工藝，生產(chǎn)過(guò)程對(duì)環(huán)境污染小，屬于綠色清潔化技術(shù)。


圖1(a)、(b)和(c)分別為本發(fā)明實(shí)施例2、5、9中制備的工業(yè)蛋白粉的紅外圖譜， 圖中1653CHT1和1541CHT1為酰胺鍵的特征吸收峰，1457cm"1為亞甲基的特征吸收峰，以上特征峰值可以表征蛋白粉的基團(tuán)特征和蛋白降解程度。圖2為本發(fā)明實(shí)施例5中制備的工業(yè)蛋白粉的SDS-PAGE電泳譜帶，圖中M代表電泳測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品。圖3為本發(fā)明實(shí)施例9中制備的工業(yè)蛋白粉的SDS-PAGE電泳譜帶，圖中M代表電泳測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品。
具體實(shí)施例方式下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體的描述，有必要在此指出的是本實(shí)施例只用于對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)熟練人員可以根據(jù)上述本發(fā)明的內(nèi)容作出一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整。實(shí)施例1將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到400份水中，于溫度40°C浸泡4h，加入5份碳酸鈉，于溫度40°C攪拌反應(yīng)4h，再加入0. 3份菠蘿蛋白酶，于溫度50°C攪拌反應(yīng)他，然后調(diào)節(jié)溶液pH至7. 4 ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至常溫后以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為4800Da，氨基含量為0. 85mmol氨基/g蛋白粉，等電位為3. 3。實(shí)施例2將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到500份水中，于溫度50°C浸泡lh，加入2份氫氧化鈣，于溫度50°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0. 4份1398蛋白酶，于溫度60°C 攪拌反應(yīng)4h，然后調(diào)節(jié)溶液pH至7 ；升溫至100°C，滅酶活7min，冷卻至常溫后以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為4000Da，氨基含量為0. 95mmol氨基/g蛋白粉，等電位為3. 0。所制備的蛋白粉的紅外圖譜如1 (a)所示。實(shí)施例3將100份羊皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到600份水中，于溫度50°C浸泡3h，加入1份碳酸氫鈉，于溫度50°C攪拌反應(yīng)3h，再加入0. 6份Alcalase，于溫度50°C攪拌反應(yīng)池，然后調(diào)節(jié)溶液PH至7. 8 ；升溫至100°C，滅酶活lOmin，冷卻至常溫后以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為3300Da，氨基含量為1. 20mmol氨基/g蛋白粉，等電位為2. 3。實(shí)施例4將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到700份水中，于溫度60°C浸泡2h，加入3份氫氧化鈉，于溫度60°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0. 3份2709蛋白酶，于溫度60°C攪拌反應(yīng)池，然后調(diào)節(jié)溶液PH至8 ；升溫至100°C，滅酶活lOmin，冷卻至常溫后以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為2400Da，氨基含量為1. 40mmol氨基/g蛋白粉，等電位為1. 9。實(shí)施例5將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm，加入到450份水中，于溫度40°C浸泡4h，加入1份碳酸鈉，于溫度40°C攪拌反應(yīng)池，再加入0. 2份胰蛋白酶，于溫度45°C攪拌反應(yīng)4h，然后調(diào)節(jié)溶液pH至7. 5 ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時(shí)以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為141^^，氨基含量為0.75!1111101氨基/^蛋白粉，等電位為3.9。所制備的蛋白粉的紅外圖譜如1 (b)所示，電泳譜帶如圖2所示。實(shí)施例6將100份羊皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到500份水中，于溫度45°C 浸泡4h，加入3份氫氧化鈣，于溫度45°C攪拌反應(yīng)4h，再加入0. 4份Neutral ，于溫度55°C 攪拌反應(yīng)池，然后調(diào)節(jié)溶液PH至7. O ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時(shí)以 200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為26kDa，氨基含量為0. 6mmol氨基/g蛋白粉，等電位為4. 4。實(shí)施例7將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到600份水中，于溫度50°C浸泡2h，加入2份硫酸銨，于溫度50°C攪拌反應(yīng)3h，再加入0. 5份537蛋白酶，于溫度50°C 攪拌反應(yīng)3h，然后調(diào)節(jié)溶液pH至6. 5 ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時(shí)以 200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液先50°C熱風(fēng)干燥6h，再升溫至80°C干燥12h，產(chǎn)物粉碎至粒度 0. 1 0. 15mm，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為34kDa，氨基含量為0. 52mmol氨基/ g蛋白粉，等電位為5.0。實(shí)施例8將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到800份水中，于溫度60°C浸泡lh，加入1份硫酸，于溫度60°C攪拌反應(yīng)lh，再加入0. 8份木瓜蛋白酶，于溫度60°C攪拌反應(yīng)4h，然后調(diào)節(jié)溶液pH至7. O ；升溫至100°C，滅酶活5min，冷卻至45 55°C時(shí)以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液先50°C熱風(fēng)干燥8h，再升溫至80°C干燥12h，產(chǎn)物粉碎至粒度0. 1 0. 15mm，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為44kDa，氨基含量為0. 38mmol氨基/g蛋白粉，等電位為5.4。實(shí)施例9將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到700份水中，于溫度40°C浸泡3h，加入1. 2份硫酸，于溫度40°C攪拌反應(yīng)2h，再加入0. 3份胃蛋白酶，于溫度60°C攪拌反應(yīng)池，然后調(diào)節(jié)溶液PH至6 ；加入0. 5份過(guò)氧化氫滅酶活，然后以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾， 將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，再粉碎至粒度0. 1 0. 2mm，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為120kDa，氨基含量為0. 33mmol氨基/g蛋白粉，等電位為 6. O。所制備的蛋白粉的紅外圖譜如1 (c)所示，電泳譜帶如圖3所示。實(shí)施例10
將100份羊皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到400份水中，于溫度50°C浸泡0. 5h，加入5份氫氧化鈣，于溫度50°C攪拌反應(yīng)4h，再加入0. 8份無(wú)花果蛋白酶，于溫度 60°C攪拌反應(yīng)池，然后調(diào)節(jié)溶液pH至6. 4 ；加入0. 05份過(guò)氧化氫滅酶活，再以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于進(jìn)口溫度180°C，出口溫度100°C下進(jìn)行噴霧干燥，再粉碎至粒度0. 1 0.2mm，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為180kDa，氨基含量為0.24mmol氨基/g蛋白粉，等電位為6. 5。實(shí)施例11將100份豬皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到600份水中，于溫度40°C 浸泡3.證，加入1. 5份鹽酸，于溫度40°C攪拌反應(yīng)2. 5h，再加入0. 6份鏈酶蛋白酶，于溫度 45°C攪拌反應(yīng)他，然后調(diào)節(jié)溶液pH至6 ；加入0.2份過(guò)氧化氫滅酶活，然后以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于-60°C進(jìn)行冷凍干燥^h，再粉碎至粒度0. 1 0. 2mm，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。其平均分子量為250kDa，氨基含量為0. IOmmol氨基/g蛋白粉，等電位為7. 2。實(shí)施例12將100份牛皮下腳料粉碎至粒度0. 1 0. 5mm,加入到800份水中，于溫度40°C浸泡池，加入3份硫酸銨，于溫度40°C攪拌反應(yīng)4h，再加入0. 2份鏈蛋白酶K，于溫度40°C攪拌反應(yīng)證，然后調(diào)節(jié)溶液pH至6. 6 ；加入0. 3份過(guò)氧化氫滅酶活，再以200目紗布進(jìn)行過(guò)濾，將濾液于-60°C進(jìn)行冷凍干燥36h，再粉碎至粒度0. 1 0. 2mm，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品。 其平均分子量為280kDa，氨基含量為0. OSmmol氨基/g蛋白粉，等電位為7. 5。
權(quán)利要求
1.化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特征在于該方法包括以下步驟，并按重量份數(shù)計(jì)為(1)將100份制革下腳料粉碎到粒度0.1 0. 5mm,加入到400 800份水中，于溫度40 60°C浸泡0. 5 4. Oh,加入1 5份化學(xué)試劑，于溫度40 60°C攪拌反應(yīng)0. 5 4. Oh,再加入0. 2 0. 8份蛋白酶，于溫度40 70°C攪拌反應(yīng)2 6h，然后調(diào)節(jié)溶液pH至 6-8 ；(2)對(duì)步驟(1)反應(yīng)后的物料進(jìn)行酶滅活處理，然后過(guò)濾；(3)將步驟O)中濾液進(jìn)行干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品；得到的產(chǎn)品分別為具有平均分子量1 5kDa，10 50kDa或100 300kDa的工業(yè)蛋白粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特征在于所述制革下腳料為未經(jīng)鉻鞣制的邊角余料，包括牛皮、羊皮和豬皮。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特征在于所述化學(xué)試劑為氫氧化鈉、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸銨、鹽酸或硫酸中的任一種。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特征在于所述蛋白酶為1398蛋白酶、2709蛋白酶、Alcalase、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶、Neutral, 537蛋白酶、木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、蛋白酶K、鏈酶蛋白酶或胃蛋白酶中的任一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特征在于所述酶滅活處理為在溫度100°C攪拌5 IOmin或加入0. 01 0. 5份過(guò)氧化氫在溫度30 60°C攪拌5 IOmin。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特征在于所述干燥方式為噴霧干燥、熱風(fēng)干燥或冷凍干燥中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了化學(xué)與酶協(xié)同水解制革下腳料生產(chǎn)工業(yè)蛋白粉的方法，其特點(diǎn)是該方法包括以下步驟步驟1)將100重量份制革下腳料粉碎到粒度0.1～0.5mm，加入到400～800重量份水中，于溫度40～60℃浸泡0.5～4.0h，加入1～5重量份化學(xué)試劑，于溫度40～60℃攪拌反應(yīng)0.5～4.0h，再加入0.2～0.8重量份蛋白酶，于溫度40～70℃攪拌反應(yīng)2～6h，然后調(diào)節(jié)溶液pH至6-8；2)對(duì)步驟1)反應(yīng)后的物料進(jìn)行酶滅活處理，酶滅活處理為在溫度100℃攪拌5～10min或加入0.01～0.5份過(guò)氧化氫在溫度30～60℃攪拌5～10min，然后過(guò)濾；3)將步驟2)中濾液進(jìn)行干燥，獲得工業(yè)蛋白粉產(chǎn)品；得到的產(chǎn)品分別為具有平均分子量1～5kDa，10～50kDa或100～300kDa的工業(yè)蛋白粉。
文檔編號(hào)C12P21/06GK102321718SQ201110257618
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月2日
發(fā)明者崔敏, 廖學(xué)品, 張文華, 石碧, 遲原龍 申請(qǐng)人:四川大學(xué)