專利名稱：高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)PX-95菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)學(xué)及生活領(lǐng)域，尤其涉及一株高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸(PHB) 的蘇云金芽孢桿菌及其用途。
背景技術(shù)：
伴隨生產(chǎn)力的極大發(fā)展，塑料行業(yè)發(fā)展迅猛，由于其成本低、使用方便、易發(fā)展新的性能等特點已經(jīng)深入到社會生活的各個方面。但就目前所使用的塑料而言，都是不可降解的、一次性的，在自然環(huán)境中降解的速度非常緩慢，通常需要20(Γ400年。為解決“白色污染”問題，國務(wù)院辦公廳下發(fā)了《關(guān)于限制生產(chǎn)銷售使用塑料購袋的通知》。自2008年6月 1日起，在超市、商場、集貿(mào)市場等商品零售場所實行塑料購物袋有償使用制度，一律不得免費提供塑料購物袋。但調(diào)查表明，在“限制”執(zhí)行的初始階段，塑料袋的使用有所下降，而后又有所反彈，“白色污染”仍是有增無減，因此要從根本上解決污染問題，就要從塑料的可降解性方面著手。生物可降解塑料是指在使用過程中能保持與普通不降解塑料相似的力學(xué)強(qiáng)度和材料性能，使用后在自然環(huán)境中通過微生物的作用，在一定時間內(nèi)可以降解成co2、H2O或其它無毒副產(chǎn)物的聚合物。一般分為三類①微生物合成型(如聚羥基脂肪酸酯)、②天然高分子型(如淀粉、纖維素、木質(zhì)素和甲殼素等)和③合成高分子型(如聚乳酸、聚乙烯醇、聚丁二酸等)。其中微生物合成的聚羥基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoates，PHA)正是在這種情況下發(fā)展起來的一類高分子材料，微生物發(fā)酵生產(chǎn)有產(chǎn)量高、周期短、污染小、可循環(huán)等優(yōu)點，具有比其它生物可降解塑料更大的發(fā)展?jié)摿?。目前，微生物合成出的PHA約有40種， 聚- β -羥基丁酸(PHB)是其中的典型代表。聚- β -羥基丁酸(？017-0-1^(11~0巧13肚7儀切，？冊)是微生物在碳、氮等營養(yǎng)失衡的條件下合成的碳源與能源的高分子儲存物(分子量50000-1000000)。作為微生物合成的可降解材料，PHB除了具有與化學(xué)合成高分子相似的理化性質(zhì)外，還具有一般化學(xué)合成高分子所沒有的性質(zhì)如光學(xué)活性、低透氧性、抗紫外輻射、生物可降解性、生物相容性、壓電性和抗凝血性等，在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。如在醫(yī)療領(lǐng)域，PHB可以作為藥物基質(zhì)植入人體，以控制藥物的釋放且最終降解產(chǎn)物為β-羥基丁酸， 沒有任何毒副作用。因此，國外的許多公司和科研機(jī)構(gòu)紛紛開展可降解塑料的研發(fā)工作。但是由于其生產(chǎn)菌的產(chǎn)量不高，生產(chǎn)菌在生長過程中所消耗的原料價格較高，天然產(chǎn)物的機(jī)械性能差等缺點影響了其使用。近年來，有大量的學(xué)者對此進(jìn)行研究并取得了很大的進(jìn)展。目前，降低PHB生產(chǎn)成本主要途徑有兩條一是通過微生物菌種培育如菌株篩選、大腸桿菌重組技術(shù)、誘變等提高菌體中PHB的含量，從而使提取PHB成本降低；二是通過降低培養(yǎng)基原料的成本，使PHB生產(chǎn)成本降低
發(fā)明內(nèi)容
為了解決生產(chǎn)菌的產(chǎn)量不高的技術(shù)缺陷，本發(fā)明的一個目的是提供一株高產(chǎn)聚-β -羥基丁酸(PHB)蘇云金芽孢桿菌UaciBm thuringiensis) !-^菌株，本發(fā)明的另外一個目的是提供采用上述菌株制備聚-β -羥基丁酸的方法。為了實現(xiàn)上述第一個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
高產(chǎn)聚-β -羥基丁酸的蘇云金芽孢桿菌(Macillus thuringiensis )PX_95菌株，該菌株保藏編號為；CCTCC NO: M2011298，保藏地為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日為2011 年8月24日。本發(fā)明所涉及的蘇云金芽孢桿菌(Macillus thuringiensis) !-^菌株菌落扁平呈白色，無光澤，表面較粗糙；革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀，有芽孢，芽孢囊無明顯膨脹，菌體大小約為(1. 1-1.2) X (3.2-5.5) μ m ；衣鞘薄而無色，有粘性，游離的單菌體常附在外邊，側(cè)生鞭毛，單菌能活躍運動；異染顆粒有且較大，占菌體的1/3，菌體內(nèi)PHB顆粒較多，有的占菌體的3/4。本發(fā)明所涉及的蘇云金芽孢桿菌UaciBm Aariz^im1Si1S)PX_95菌株篩選自花生地土壤。采用梯度稀釋法獲得純菌種，根據(jù)形態(tài)特征、生理生化特征、16S rDNA序列及擴(kuò)增^jrB基因的方法鑒定為蘇云金芽孢桿菌UaciBm thuringiensis、。16S rDNA電泳和測序分析結(jié)果表明，其長度為1398 bp，與蘇云金芽孢桿菌UaciBm thuringiensis^kl 蠟樣芽孢桿菌UaciBm ce/^As)均具有高度同源性(達(dá)99%，)，進(jìn)一步采用擴(kuò)增gyr BCDNA 促旋酶B亞單位)基因的方法將其鑒定為蘇云金芽孢桿菌(feciBm thuringiensis),該菌株的16S rDNA基因序列已在GeneBank的登錄，登錄號為JN182235。為了實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案
上述的蘇云金芽孢桿菌(Mcillus thuringiensis ) PX-95菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)聚-β-羥基丁酸。一種聚-β-羥基丁酸的生產(chǎn)方法，該方法包括以下的步驟
1)將冷凍保藏的蘇云金芽孢桿菌(Macillusthuringiensis) PX-95菌株接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)；
2)取2 IOmL轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)作種子液；
3)再以洲 10%的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度25 34 °C，搖床速度160 200 r/min,起始pH為7. 5 8. 0的條件下培養(yǎng)45 50 h，即可得到含PHB的菌體的發(fā)酵液。本發(fā)明PX-95菌株具有高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸(PHB)、生長速度快、容易培養(yǎng)等多種優(yōu)良特性。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，聚-β-羥基丁酸產(chǎn)量最高可達(dá)10 g/ L以上，菌體干重達(dá)13 g/L 15 g/L，PHB含量約占菌體干重的66 % 76 %，屬于高產(chǎn)PHB 的菌株。因此，本發(fā)明提供的菌株可用于聚- β -羥基丁酸(PHB)工業(yè)化生產(chǎn)菌株。


圖1為蘇云金芽孢桿菌ΡΧ-95菌株在顯微鏡下菌體形態(tài)特征(100Χ)。圖2為蘇云金芽孢桿菌ΡΧ-95菌株在顯微鏡下芽孢(右)形態(tài)特征(100Χ)。圖3為基于16s rDNA基因序列建立的芽孢桿菌屬系統(tǒng)發(fā)育樹。圖4為蘇云金芽孢桿菌PX-95菌體中提取純化制備的PHB粉末。
圖5為蘇云金芽孢桿菌PX-95菌體中提取純化制備的PHB薄膜。圖6為蘇云金芽孢桿菌PX-95菌體中提取的PHB紫外吸收光譜圖。圖7為蘇云金芽孢桿菌PX-95菌體中提取的PHB核磁碳譜。圖8為蘇云金芽孢桿菌PX-95菌體中提取的PHB氫(右)譜圖。生物材料保藏說明
蘇云金芽孢桿菌UaciBm thuringiensis) PX-95菌株，該菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址湖北省武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，保藏時間 2011 年 8 月 24 日，保藏號為CCTCC NO: M2011298。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明具體實施方式
做一個詳細(xì)的說明。實施例1高產(chǎn)聚- β -羥基丁酸(PHB)蘇云金芽孢桿菌ΡΧ-95菌株的分離篩選
(一)培養(yǎng)基
牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L， PH7-7.2;用于菌種分離；
牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基牛肉膏3 g/L、蛋白胨10 g/L, NaCl 5 g/L, pH7_7. 2 ； 液體篩選培養(yǎng)基蔗糖 10 g/L、牛肉膏 5 g/L、MgSO4. 7H20 0.2 g/L、CaCl2O. 05 g/ L、FeCl3 0. 01 g/L、K2HPO4 0. 04 g/L、KH2PO4 0. 03 g/L、NaH2PO4. 2H20 0. 05 g/L、H3BO3 0. 005 g/L, pH7. 8 ；
液體發(fā)酵培養(yǎng)基蔗糖 50 g/L、牛肉膏 20 g/L、MgSO4. 7H20 0.2 g/L、CaCl2O. 05 g/ L、FeCl3 0. 01 g/L、K2HPO4 0. 04 g/L、KH2PO4 0. 03 g/L、NaH2PO4. 2H20 0. 05 g/L、H3BO3 0.005 g/L，pH7.8。(二)方法
采用梯度稀釋分離法。取土樣1.0 g，加9 mL無菌水稀釋，80 °C水浴15 min后，進(jìn)行 10_"10_4梯度稀釋，取10_2濃度稀釋液100 μ L涂布于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，28 °C培養(yǎng)M h。挑取圓形乳白色單菌落，進(jìn)一步分離、純化后，獲得純菌株，編號保存。用蘇丹黑染色法初步定性篩選產(chǎn)生PHB菌株，挑取初篩獲得的純菌株單菌落接種于150 mL錐形瓶(含30 mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基)中，在溫度30 °C，搖床速度180 r/ min，培養(yǎng)12 h用作發(fā)酵種子。按6 %比例轉(zhuǎn)接于250 mL錐形瓶(含50 mL液體篩選培養(yǎng)基)中，按上述條件培養(yǎng)48 h用于PHB的定量分析。綜合比較，篩選高產(chǎn)PHB原始菌株。菌液與50 %甘油1:1于-20 °C冰箱中保存，備用。用牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基進(jìn)行菌種活化傳代，菌株每4 w轉(zhuǎn)接一次；菌種使用之前需先活化。對選出的菌株依據(jù)形態(tài)學(xué)、生理生化和16S rDNA基因序列等鑒定。PX-95菌株菌落扁平呈白色，無光澤，表面較粗糙。革蘭氏染色呈陽性，菌體桿狀， 有芽孢，芽孢囊無明顯膨脹，菌體大小約為(1. 1-1.2) X (3.2-5.5) ym (附圖1、圖2)；衣鞘薄而無色，有粘性，游離的單菌體常附在外邊，側(cè)生鞭毛，單菌能活躍運動；異染顆粒有且較大，占菌體的1/3，菌體內(nèi)PHB顆粒較多，有的占菌體的3/4。16S rDNA電泳和測序分析結(jié)果表明，其長度為1398 bp,與蘇云金芽孢桿菌 (.Bacillus thuringiensis)以及蠟樣芽孢桿菌UaciB^s carets)均具有高度同源性(達(dá)99%，附圖3)，進(jìn)一步采用擴(kuò)增gyr B (DNA促旋酶B亞單位)基因的方法將其鑒定為蘇云金芽孢桿菌UaciB^s iAtfri/^ieasis )，該菌株的16S rDNA序列已在GeneBank的登錄，登錄號為JN182235。該菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，30°C 10 d條件下，經(jīng)15代連續(xù)培養(yǎng)，其培養(yǎng)特征、形態(tài)特征和PHB產(chǎn)量均無明顯變化，表明該菌株的生物性狀基本穩(wěn)定。實施例2蘇云金芽孢桿菌UaciB^s iAtfri/^ieasis) PX-95菌株用于PHB合成的方法
(一)菌株蘇云金芽孢桿菌UaciB^sthuringiensis) Vl-^b菌株
(二)方法
保存于的-20 °C下的甘油菌1.5mL接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(50 mL),30 °C搖床 180 r/min培養(yǎng)9. 5 h(0D600 0. 6)活化后，取5 mL轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基(100 mL)，相同條件培養(yǎng)1.5 h (0D600 0.6)作種子液；再以6 %的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)液，在30 °C，搖床速度180 r/min，起始pH為7. 8的條件下培養(yǎng)48 h。即可得到含菌體干重約13 g/L 15 g/L，PHB 8 g/L 10 g/L (干重)的發(fā)酵液，PHB含量約占菌體干重的66 % 76 %。PHB提取和定性分析將搖瓶所得發(fā)酵液12000 r/min離心5 min,收集菌體。無菌水洗滌3次后再用丙酮、無水乙醇充分洗滌1次，之后加氯仿于60 °C下抽提PHB 60 min, 過濾后將PHB提取液用無水乙醇沉淀法可得到白色沉淀，即為PHB粗品，然后再用丙酮、無水乙醇各清洗3次，再用熱氯仿溶解，最后60 ！烘干，可得白色粉末或薄膜狀PHB(附圖4、 圖5)。PHB在濃硫酸作用下解聚成巴豆酸，在200 nm^280 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描分析初步定性，提取物的濃硫酸處理產(chǎn)物在235 nm處有最大吸收峰值，這與文獻(xiàn)報道的 PHB標(biāo)準(zhǔn)品降解和脫水產(chǎn)物-巴豆酸(反-2- 丁烯酸)的最大吸收峰值完全一致(附圖6)； 進(jìn)一步定性分析采用核磁共振法。從蘇云金芽孢桿菌PX-95菌體中提取所得的PHB經(jīng)溶劑氘代氯仿(CDCl3)溶解進(jìn)行核磁共振分析，碳譜(14C-NMR)和氫譜(1H-NMR)圖如圖7、圖8所不。從碳譜(14C-NMR)圖碳骨架結(jié)構(gòu)分析可知在76. 705 ppm、77. 024 ppm和77. 343 ppm處的吸收峰由溶劑⑶Cl3中的C元素產(chǎn)生，此外的4個吸收峰分別位于19. 759 ppm、 40.790 ppm、67. 612 ppm和169.143 ppm，它們分別代表聚β -羥基丁酸中的4組碳原子， 相應(yīng)的分別是一CH3, -CH2, — CH, 一COO—基團(tuán)中的碳原子。從氫譜(1H-NMR)圖可知在7. 270 ppm處的吸收峰是由溶劑⑶Cl3的D元素產(chǎn)生， 而聚β-羥基丁酸中的3個基團(tuán)一 CH3, -CH2, 一CH中的氫原子的吸收峰分別為(1.245 ppm> 1. 269 ppm> 1. 285 ppm), (2. 448 ppm、2· 463 ppm、2· 487 ppm、2· 502 ppm、2. 581 ppm、 2. 599 ppm、2. 620 ppm、2. 638 ppm) ； (5. 235 ppm、5. 251 ppm、5. 267 ppm、5. 283 ppm、5. 299 ppm),與PHB標(biāo)準(zhǔn)品核磁共振圖譜一致。碳元素和氫元素數(shù)目及元素遷移情況與一 [―0—CH (CH3) —CH2-CO—]—n結(jié)構(gòu)相一致，并且圖譜整齊無異質(zhì)雜峰出現(xiàn)(附圖7、圖8)，表明從蘇云金芽孢桿菌PX-95菌株提取所得的PHB純度很高。
權(quán)利要求
1.高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸的蘇云金芽孢桿菌、BaciIlus thuringiensis) PX-95菌株， 該菌株保藏編號為；CCTCC NO: M201U98，保藏地為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日為 2011年8月24日。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘇云金芽孢桿菌UaciBmthuringiensis) !-^菌株用于發(fā)酵生產(chǎn)聚-β-羥基丁酸。
3.—種聚羥基丁酸的生產(chǎn)方法，其特征在于該方法包括以下的步驟1)將冷凍保藏的蘇云金芽孢桿菌(Macillusthuringiensis) PX-95菌株接入牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，活化培養(yǎng)；2)取2 IOmL轉(zhuǎn)接于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，相同條件培養(yǎng)作種子液；3)再以洲 10%的接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在溫度25 34 °C，搖床速度160 200 r/min，起始pH為7. 5 8. 0的條件下培養(yǎng)45 50 h，即可得到含PHB的菌體的發(fā)酵液。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)醫(yī)學(xué)及生活領(lǐng)域，尤其涉及一株高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸(PHB)的蘇云金芽孢桿菌及其用途。高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)PX-95菌株，該菌株保藏編號為；CCTCCNO:M2011298，保藏地為中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日為2011年8月24日。本發(fā)明PX-95菌株具有高產(chǎn)聚-β-羥基丁酸(PHB)、生長速度快、容易培養(yǎng)等多種優(yōu)良特性。通過液體發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件優(yōu)化后，聚-β-羥基丁酸產(chǎn)量最高可達(dá)10g/L以上，菌體干重達(dá)13g/L~15g/L，PHB含量約占菌體干重的66%~76%，屬于高產(chǎn)PHB的菌株。
文檔編號C12R1/07GK102373166SQ201110259510
公開日2012年3月14日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者宋迤明, 董夏夢, 蔣冬花 申請人:浙江師范大學(xué)