專利名稱：高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
胞嘧啶核苷三磷酸(簡稱CTP)在體內(nèi)參與磷脂類(卵磷脂、腦磷脂、絲氨酸磷脂、 鞘磷脂等)的生物合成過程。磷脂類是神經(jīng)組織的重要成分，也是一種天然的脂肪乳化劑。 具有健全大腦和神經(jīng)組織，增強(qiáng)智力和記憶力并有促進(jìn)體內(nèi)膽固醇、脂肪的運輸從而防止堆積的作用。臨床上，CTP作為生化藥物用于治療腦外傷，神經(jīng)損傷所致的意識障礙。對腦震蕩、神經(jīng)官能癥、神經(jīng)損傷所致的意識障礙、脂肪肝等有顯著療效，另外在治療腦血管意外及其后遺癥；腦震蕩、外傷性昏迷、顱腦手術(shù)后功能障礙；腦血管硬化、老年性癡呆；外周神經(jīng)損傷；兒童腦發(fā)育不全等方面也有良好的效果。CTP合成主要有化學(xué)合成法、光合磷酸法、生物合成法三種。由于化學(xué)法合成所用試劑多、工藝復(fù)雜、條件要求高、反應(yīng)時間長等缺點，不大容易實現(xiàn)大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，CTP的合成從化學(xué)方法轉(zhuǎn)入了酶轉(zhuǎn)化研究。酶法即以三磷酸胞苷合成酶為酶源催化生產(chǎn)CTP。三磷酸胞苷合成酶 (E. C. 6. 3. 4. 2)在谷氨酰胺、ATP、GTP、Mg2+參與下，可催化UTP生成CTP、ADP和Pi，是CTP 生物合成的關(guān)鍵酶。因此，利用基因工程手段，克隆高活性的三磷酸胞苷合成酶基因，構(gòu)建工程菌株大量表達(dá)三磷酸胞苷合成酶，以UTP為原料一步生產(chǎn)CTP，是CTP高效合成的一條可行途徑。此途徑具有工藝簡單、條件溫和、周期短、副產(chǎn)物少等優(yōu)點，而且清潔無污染，能實現(xiàn)CTP生產(chǎn)過程的節(jié)能、降耗、減排。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌。本發(fā)明還要解決的技術(shù)問題是提供上述基因工程菌的構(gòu)建方法。本發(fā)明最后要解決的技術(shù)問題是提供上述基因工程菌在高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下一種高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，其分類命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)，該菌株已于2011年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院，中科院微生物研究所，郵編:100101，保藏編號為 CGMCC No. 5048。上述高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，它是包含三磷酸胞苷合成酶PyrG基因的大腸桿菌，所述三磷酸胞苷合成酶pyrG基因來源于谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
其中，所述的三磷酸胞苷合成酶pyrG基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，基因長度為1665bp，其編碼554個氨基酸和一個終止密碼子，所編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。上述高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中提取三磷酸胞苷合成酶 pyrG基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a-pyrG，將重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta， 然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到一株產(chǎn)酶量最高的菌株CGMCC No. 5048。上述高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌在高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶中的應(yīng)用。通過培養(yǎng)上述基因工程菌，利用IPTG或乳糖誘導(dǎo)基因工程菌中三磷酸胞苷合成酶基因PyrG的表達(dá)，收集菌體，超聲破碎細(xì)胞，得到的上清作為粗酶液。

有益效果本發(fā)明首次將谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032中三磷酸胞苷合成酶基因pyrG在大腸桿菌Rosetta中高效表達(dá)。重組的基因工程菌株能夠高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶基因pyrG，分泌表達(dá)三磷酸胞苷合成酶，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌，酶活為10U/mg ；乳糖自誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌，酶活為7U/mg。


書圖1為本發(fā)明的質(zhì)粒構(gòu)建圖。圖2為以谷氨酸棒桿菌基因組為模板PCR后的電泳圖。其中，第1道:maker2000， 第 10、11、12、13 道:ATCC13032pyrGo
具體實施例方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。實施例1 三磷酸胞苷合成酶基因pyrG的克隆。谷氨酸棒桿菌(Corynebacterinm glutamicum)ATCC13032由本實驗室保藏，培養(yǎng)基組成(g. L-1)如下酵母浸粉5g，胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，補(bǔ)蒸餾水至1L。將谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC13032接種于30mL培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)至對數(shù)生長期，使用基因組DNA提取試劑盒提取基因組。構(gòu)建表達(dá)載體所用的引物加設(shè)酶切位點，引物序列如下上游引物5’ CGGGATCCATGACCTCTAGTCGAAAAGTCCG3’5， GGAATTCCATATGATGACCTCTAGTCGAAAAGTCC3，下游引物(CRII-anti含 Hind III)為5’ GGAATTCCTAAGGGTGGACACGCAGCTCC3’5’ CCCAAGCTTCTAAGGGTGGACACGCAG3’所有引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。基因的PCR條件94°C變性5min，按如下參數(shù)循環(huán)30次94°C變性lmin，60°C退火50s，72°C延伸 1. 5min。最后 72°C延伸 IOmin
凝膠電泳分離純化PCR產(chǎn)物(圖1)并進(jìn)行膠回收。將膠回收產(chǎn)物連接到 PMD18-SimpleT-Vector,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于氨芐抗性平板。挑取LB平板上的單菌落，接種到裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，37°C， 220rpm下培養(yǎng)8-12小時。利用上海申能博彩有限公司的質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，并將菌液送南京金斯瑞生物科技有限公司測序。序列長度為1665bp，如SEQ ID No:l所示。實施例2 基因pyrG表達(dá)載體的構(gòu)建。根據(jù)獲得的pyrG基因的核苷酸序列(如SEQ ID No:l所示)設(shè)計表達(dá)引物，在引物的5，端和3，端分別引入NdeI和HindIII酶切位點，PCR擴(kuò)增，連接PMD18-Simple T-vector，構(gòu)建 PMD 18T_pyrG 重組質(zhì)粒。采用 NdeI 和 HindIII 雙酶切 PMD 18T_pyrG 重組質(zhì)粒和pET28a質(zhì)粒，連接酶切產(chǎn)物，獲得重組質(zhì)粒pET28a-pyrG， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。挑取單菌落，接種到裝有5mLLB液體培養(yǎng)基的50mL離心管中，37°C，220rpm下培養(yǎng)8_12小時。 提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和雙酶切篩選獲得含有pyrG基因的重組表達(dá)質(zhì)粒，并測序確認(rèn)重組質(zhì)粒的閱讀框正確。實施例3 表達(dá)谷氨酸棒桿菌ATCC13032pyrG基因的大腸桿菌工程菌株的構(gòu)建及蹄選。將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，挑取單菌落，接種5mL含有氯霉素和卡拉霉素的LB液體培養(yǎng)基中，370C，220rpm下培養(yǎng)12小時。提取質(zhì)粒，以質(zhì)粒為模板，PCR驗證。實施例4 =IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌。挑取重組菌大腸桿菌Rosetta(pET28a-pyrG)及含有pET28a空質(zhì)粒的對照菌大腸桿菌Rosetta(DE3)至含50mg/L卡拉霉素和20mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 220rpm培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到新鮮培養(yǎng)液中，37°C，220rpm培養(yǎng)至0D600 約為0.6時，加入IPTG至終濃度0. 8mM，30°C，220rpm，誘導(dǎo)表達(dá)6h后，8000rpm，4°C離心 5min，菌泥用200mM Tris-HCl (PH8. 0)重懸，超聲破碎細(xì)胞(功率200W，超聲3s，間歇4s，共 3min)，6500rpm，4°C離心5min，測定上清中的酶活。酶反應(yīng)體系包括3. Ommol/1尿嘧啶三核苷酸(UTP)、3. Ommol/1腺嘌呤三核苷酸 (ATP)、3. Ommol/1 鳥嘌呤三核苷酸(GTP)、35mmol/l tris-Hcl、10mmol/l Mgcl2、2mmol/l 谷氨酰胺，在pH6. 0 7. 5,20 30°C、150 300rpm條件下反應(yīng)15 30h，得到5，-三磷酸胞苷。30°C反應(yīng)60min，沸水中煮5min滅酶，離心，上清液過膜。HPLC檢測CTP的含量。酶活檢測方法(HPLC)江蘇淮陰漢邦科技有限公司Lichrospher C18[4. 6X250_，5um]色譜柱；流動相100%甲醇pH6. 6的磷酸三乙胺溶液；柱溫室溫； 檢測波長:260nm ；流速0. 8mL · mirT1 ；進(jìn)樣量20μ L。以下相同。酶活定義為在30°C下每分鐘生成1微摩爾CTP所需要的酶量定義為一個酶活單位 U。以下相同。經(jīng)檢測，重組菌大腸桿菌Rosetta (pET28a-pyrG)中pyrG的酶活為10U/mg，對照菌中PyrG的酶活為0. 74U/mg。實施例5 乳糖自誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌。挑取重組菌大腸桿菌Rosetta(pET28a-pyrG)及含有pET28a空質(zhì)粒的對照菌大腸桿菌Rosetta (DE3)至含50mg/L卡拉霉素和20mg/L氯霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C，220rpm培養(yǎng)過夜。然后按2%接種量分別接種到至含乳糖的LB液體培養(yǎng)基中，組成(g. L-1) 如下2g葡萄糖，3g乳糖，10gNaCl，15g胰蛋白胨。37°C，220rpm培養(yǎng)至3h。然后30°C， 220rpm,誘導(dǎo)表達(dá) 12h。8000rpm, 4°C離心 5min，收集菌泥，用 200mMTris_HCl (PH8. 0)重懸， 超聲破碎細(xì)胞(功率200W，超聲3s，間歇4s，共3min)，6500rpm, 4°C離心5min，測定上清中的酶活。經(jīng)檢測，重組菌大腸桿菌Rosetta(pET28a-pyrG)中pyrG的酶活為7U/mg，對照菌中P yrG的酶活為0. 89U/mg。
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，其分類命名為大腸埃希氏菌 (Escherichia coli)，該菌株已于2011年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 5048。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，它是包含三磷酸胞苷合成酶PyrG基因的大腸桿菌，所述三磷酸胞苷合成酶pyrG基因來源于谷氨酸棒桿菌 (Corynebacterium glutamicum)ATCC13032。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述的三磷酸胞苷合成酶pyrG基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
4.權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032中提取三磷酸胞苷合成酶PyrG基因，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒載體pET28a-pyrG，將重組質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta，然后進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，篩選得到一株產(chǎn)酶量最高的菌株CGMCC No. 5048。
5.權(quán)利要求1所述的高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌在高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶的基因工程菌，其分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)，該菌株已于2011年7月8日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No.5048。本發(fā)明還公開了上述基因工程菌的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明首次將谷氨酸棒桿菌ATCC13032中三磷酸胞苷合成酶基因pyrG在大腸桿菌Rosetta中高效表達(dá)。重組的基因工程菌株能夠高效表達(dá)三磷酸胞苷合成酶基因pyrG，分泌表達(dá)三磷酸胞苷合成酶，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌，酶活為10U/mg；乳糖自誘導(dǎo)表達(dá)重組大腸桿菌，酶活為7U/mg。
文檔編號C12N15/63GK102321564SQ20111026021
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者吳菁嵐, 應(yīng)漢杰, 李楠, 柏建新, 王艷, 許琳, 謝婧婧, 趙小迪, 陳勇, 陳曉春 申請人:南京工業(yè)大學(xué)