專利名稱：微環(huán)dna基因載體組合物及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
微環(huán)DNA基因載體組合物及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因治療領(lǐng)域，尤其涉及一種微環(huán)DNA基因載體組合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是治療很多遺傳性、獲得性疾病最理想方法，目前已經(jīng)有很多臨床前實(shí)驗(yàn)成功的報(bào)道。然而，臨床上成功的例子卻鮮有報(bào)道。基因治療的核心是將治療載體送入靶細(xì)胞，但載體的構(gòu)建和投送方面，還有若干技術(shù)問題有待解決?；蛑委熭d體可分為兩類，即病毒載體和非病毒載體。病毒載體感染細(xì)胞的效率很高，但由于其免疫原性和插入性突變，容易引起嚴(yán)重的反應(yīng)，包括致癌、致命，因而難以被臨床接受；此外，制造成本高也是其應(yīng)用的一大障礙。非病毒載體較安全、經(jīng)濟(jì)、轉(zhuǎn)基因的大小無限制，相對(duì)于病毒載體具有一 定的優(yōu)勢(shì)，但目前還缺乏送入體內(nèi)細(xì)胞的有效手段。全球有超過三億五千萬人，中國有超過一億人，是乙型肝炎病毒(h印atitisBvirus, HBV)攜帶者。HBV可誘發(fā)肝衰竭、肝硬化及肝癌，導(dǎo)致感染者過早死亡。現(xiàn)有的治療藥物，包括核苷酸類藥物、干擾素等，療效不能持久，需經(jīng)?；蛎刻旖o藥，價(jià)格昂貴且副作用大，應(yīng)用范圍有很大限制。疫苗注射可有效預(yù)防乙肝病毒感染擴(kuò)散產(chǎn)生新帶毒者，但對(duì)己有帶毒者無效。此外，疫苗注射覆蓋不全，且有部份受注者不產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)，故每年仍有大量新病例產(chǎn)生。市場(chǎng)需要一種高效、安全、價(jià)廉、方便的新治療技術(shù)與產(chǎn)品。下面通過基因載體表達(dá)干擾RNA (interference RNA, RNAi)，治療HBV感染的研究現(xiàn)狀，來說明基因治療的巨大潛力和現(xiàn)有問題。RNAi是最近發(fā)現(xiàn)的、生物細(xì)胞內(nèi)的一種保守的分子機(jī)制，可將含有特定結(jié)構(gòu)的雙鏈 RNA (dsRNA)，包括小發(fā)夾 RNA (smalI hairpin RNA, shRNA)和微小 RNA (microRNA,miRNA)加工成20 30喊基的RNA,形成RNA誘導(dǎo)的靜默復(fù)合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC),通過與祀mRNA淬火鏈合(annealing),將其裂解或抑制其翻譯,達(dá)到阻止蛋白質(zhì)合成的目的。這是生物調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)過程、抵抗入侵病毒的普遍機(jī)制?？茖W(xué)家們正在做出巨大的努力，試圖把這個(gè)機(jī)制轉(zhuǎn)變成治療技術(shù)，治療各種疾病。已有很多成功的臨床前實(shí)驗(yàn)的報(bào)道，包括抗癌、抗病毒感染等。目前已經(jīng)有采用RNAi的方式，在體內(nèi)、體外抑制HBV病毒復(fù)制，并且具有較好的效果的報(bào)道(McCaffrey，2003)。但該技術(shù)還存在一些問題，因而難以應(yīng)用于臨床，主要包括合成的SiRNA在肝細(xì)胞內(nèi)的存留時(shí)間短，需反復(fù)給藥，成本高；用質(zhì)粒表達(dá)RNAi，在體外短期效果很好，但體內(nèi)投遞，效率不高，僅能到達(dá)少部分肝細(xì)胞，而HBV可存在于幾乎所有的肝細(xì)胞，因而療效不彰；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(plasmid)的骨架DNA成份(DNA復(fù)制起源，包括抗菌素抵抗基因等)，可抑制轉(zhuǎn)基因表達(dá)，使質(zhì)粒很快失去表達(dá)功能；病毒載體如AAV，肝細(xì)胞感染率很高，對(duì)HBV的抑制很完全(Li，2009)，但AAV載體可被宿主體內(nèi)抗體中和失效，或誘發(fā)可致命的宿主免疫反應(yīng)，同時(shí)病毒基因組插入性突變，潛藏著致癌的危險(xiǎn)。因此，發(fā)展安全、高效的載體技術(shù)，是實(shí)現(xiàn)用RNAi治療HBV感染的關(guān)鍵。除了RNAi,反義 RNA(antisense RNA)、誘傅 RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)也有強(qiáng)效的抗HBV復(fù)制的效果。但它們與RNAi —樣面臨著載體的構(gòu)筑和有效投送到靶細(xì)胞等問題。Chen 等發(fā)明的微環(huán) DNA (MC)技術(shù)(Chen, Z. Y. , et al. , Minicircle DNA vectorsdevoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expressionin vivo. Mol. Ther. , 2003.),有助于解決上述問題。MC是一個(gè)環(huán)狀表達(dá)盒子,不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA，可在體內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)高水平的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。在肝細(xì)胞內(nèi)，HBV病毒基因組也能形成環(huán)狀的DNA結(jié)構(gòu)，稱為共價(jià)鍵密閉環(huán)狀DNA(cccDNA)。導(dǎo)致HBV感染治療困難的關(guān)鍵，是cccDNA可在肝內(nèi)存在多年，且對(duì)幾乎所有藥物不敏感。MC在結(jié)構(gòu)、轉(zhuǎn)基因表達(dá)的持久性、細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)定性上，與HBV cccDNA相同，使MC成為安全、高效的理想載體。然而，MC也存在著投遞到體內(nèi)靶細(xì)胞效率不高的問題。仍以治療HBV感染為例，在正常的血循環(huán)途徑中，MC需要穿過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔才能進(jìn)入到人肝主質(zhì)細(xì)胞中，而傳統(tǒng)·的基因載體無法或很難穿過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔。

發(fā)明內(nèi)容基于此，有必要提供一種具有較高的投遞效率的微環(huán)DNA基因載體組合物。此外，還有必要提供一種上述微環(huán)DNA基因載體組合物的制備方法和應(yīng)用。一種微環(huán)DNA基因載體組合物，包括第一微環(huán)DNA基因載體和第二微環(huán)DNA基因載體；所述第一微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，所述第一微環(huán)DNA基因載體包括第一啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子；所述第二微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，所述第二微環(huán)DNA基因載體包括第二啟動(dòng)子和所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因；所述第一微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的基因成分和所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期，所述第二微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的組裝蛋白至少兩個(gè)星期，所述病毒的基因成分和所述病毒的組裝蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)組裝形成可以表達(dá)所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物并具有侵染性的重組病毒。優(yōu)選的，所述病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分為乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分；所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因?yàn)橐腋尾《净蚪M中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分。優(yōu)選的，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括5’包裝信號(hào)、3’包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域；所述啟動(dòng)子、所述5’包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子、所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域以及所述3’包裝信號(hào)依次連接。優(yōu)選的，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域；所述包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子以及所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域依次連接，所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域和包裝信號(hào)連接到一起，形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選的，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因采用變性碼序列替代。優(yōu)選的，所述第二微環(huán)DNA基因載體還包括表 達(dá)敲下DGCR8基因的RNAi的成分。優(yōu)選的，所述第一啟動(dòng)子為核心蛋白基因的啟動(dòng)子、第二型多聚酶基因啟動(dòng)子或第三型多聚酶基因啟動(dòng)子；所述第二啟動(dòng)子為第二型多聚酶基因啟動(dòng)子。優(yōu)選的，所述第一微環(huán)DNA基因載體為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，第二微環(huán)DNA基因載體為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。一種上述的微環(huán)DNA基因載體組合物的制備方法，包括如下步驟步驟一、提供具有重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)和重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒；步驟二、制備第一微環(huán)DNA基因載體；將第一啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分、用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子三種DNA成分按照先后順序依次插入到所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體；使用重組酶OC31處理所述含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體，重組后得到所述第一微環(huán)DNA基因載體；步驟三、制備第二微環(huán)DNA基因載體；將第二啟動(dòng)子和所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的成分按照先后順序依次插入到所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到含有所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因的載體；使用重組酶OC31處理含有所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因的載體，重組后得到所述第二微環(huán)DNA基因載體；步驟四、將所述第一微環(huán)DNA基因載體和所述第二微環(huán)DNA基因載體混合，得到所述微環(huán)DNA基因載體組合物。一種試劑盒，包括如上述的微環(huán)DNA基因載體組合物以及用于將所述微環(huán)DNA基因載體組合物送入靶細(xì)胞的工具。這種微環(huán)DNA基因載體組合物包括將病毒基因組中的負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分克隆到載體中，得到的重組的嵌合的第一微環(huán)DNA基因載體，以及將病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)病毒蛋白的DNA成分克隆到載體中，得到的重組的第二微環(huán)DNA基因載體。將這種微環(huán)DNA基因載體組合物送入靶細(xì)胞內(nèi)，第一微環(huán)DNA基因載體可以表達(dá)病毒的基因成分，第二微環(huán)DNA基因載體可以表達(dá)病毒的組裝蛋白，病毒的基因成分和病毒的組裝蛋白在靶細(xì)胞內(nèi)組裝形成可以表達(dá)所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物并具有侵染性的重組病毒。重組病毒可以穿過體內(nèi)的大部分微血管床屏障，例如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔，從而可以順利的感染到新的易感的靶細(xì)胞，具有較高的投遞效率。


圖I為一實(shí)施方式的第一微環(huán)DNA基因載體MC. CMV. Ther. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為制備微環(huán)DNA基因載體的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 (^C31的結(jié)構(gòu)示意圖。圖3為不帶有Ther.的空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4為一實(shí)施方式的第二微環(huán)DNA基因載體MC. UB. HBVprotein的結(jié)構(gòu)示意圖。圖5為微環(huán)DNA基因載體組合物送入到靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)和復(fù)制的機(jī)理生產(chǎn)重組乙肝病毒rHBV不意圖。圖6為MC. Ther. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖7A為將轉(zhuǎn)基因AntiHBV、轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子UB. AntiHBV和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子HI. AntiHBV分別插入到空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC的示意圖。圖7B為一實(shí)施方式的AntiHBV表達(dá)的抗乙肝病毒的miRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。圖7C為另一實(shí)施方式的AntiHBV表達(dá)的抗乙肝病毒的shRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。圖 8A 為將 AntiHBV 插入到 pMC. CMV. GeneLess. RC 后得到的 MC. CMV. AntiHBV. RC
的結(jié)構(gòu)示意圖。圖8B為RC. Cp. AntiHBV的結(jié)構(gòu)示意圖。圖9A 為將 UB. AntiHBV 插入到 pMC. CMV. GeneLess. RC 后得到的 MC. CMV.UB. AntiHBV. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖9B 為 RC. Cp. UB. AntiHBV 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IOA 為將 HL AntiHBV 插入到 pMC. CMV. GeneLess. RC 后得到的 MC. CMV.HI. AntiHBV. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IOB 為 RC. Cp. HI. AntiHBV 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IlA為MC. CMV. EGFP. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖IlB為RC. Cp. EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖12A 為 MC. CMV. UB. EGFP. RC 的結(jié)構(gòu)示意圖。圖12B為RC. Cp. UB. EGFP的結(jié)構(gòu)示意圖。圖13A為MC. CMV. hAAT. RC的結(jié)構(gòu)示意圖。圖13B為RC. Cp. hAAT的結(jié)構(gòu)示意圖。圖14A為多聚酶基因中的第一 SiRNA模范靶序列與相應(yīng)的變性碼序列編碼示意圖。圖14B為野生的多聚酶基因表達(dá)產(chǎn)生的mRNA與第一 siRNA序列互補(bǔ)淬合示意圖。圖14C為多聚酶基因中的第二 siRNA模范靶序列與相應(yīng)的變性碼序列編碼示意圖。圖14D為表面蛋白基因中的第三siRNA模范靶序列與相應(yīng)的變性碼序列編碼示意圖。圖15為結(jié)合變性編碼子技術(shù)制備得到的一實(shí)施方式的第二微環(huán)DNA基因載體MC. degHBVprotein的結(jié)構(gòu)不意圖。圖16為結(jié)合抗DGCR8技術(shù)制備得到的一實(shí)施方式的第二微環(huán)DNA基因載體MC. AntiDGCR8. HBVprotein 的結(jié)構(gòu)不意圖。圖17為結(jié)合抗DGCR8技術(shù)制備得到的另一實(shí)施方式的第二微環(huán)DNA基因載體MC. AntiDGCR8. degHBVprotein 的結(jié)構(gòu)不意圖。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)微環(huán)DNA基因載體組合物及其制備方法和應(yīng)用做進(jìn)一步的解釋說明。一實(shí)施方式的微環(huán)DNA基因載體組合物，包括第一微環(huán)DNA基因載體和第二微環(huán)DNA基因載體。第一微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，包括第一啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。第一微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的基因成分和所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期。 第二微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，包括第二啟動(dòng)子和所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因。第二微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的組裝蛋白至少兩個(gè)星期。當(dāng)這種微環(huán)DNA基因載體組合物被送入到靶細(xì)胞內(nèi)后，第一微環(huán)DNA基因載體可以所述病毒的基因成分，第二微環(huán)DNA基因載體可以表達(dá)所述病毒的組裝蛋白，所述病毒的基因成分和所述病毒的組裝蛋白可以在靶細(xì)胞內(nèi)組裝形成可以表達(dá)所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物并具有侵染性的重組病毒。重組病毒可以穿過體內(nèi)的大部分屏障，例如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔，從而可以順利的感染到新的細(xì)胞，具有較高的投遞效率。靶細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物體內(nèi)的肝主質(zhì)細(xì)胞(hepatocyte)，非肝主質(zhì)細(xì)胞(nonparenchymal hepatocyte)如肝的內(nèi)皮細(xì)胞、Kuffer細(xì)胞或其它器官的細(xì)胞。生產(chǎn)出來的重組病毒可以像野生的病毒一樣，穿過體內(nèi)的大部分微血管屏障，例如肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔，從而可以順利的感染到新的易感靶細(xì)胞，生產(chǎn)新的感染性的重組病毒，并且本身可以表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，從而長(zhǎng)期、有效的發(fā)揮作用，成為一種安全、高效、方便、經(jīng)濟(jì)的基因治療技術(shù)。治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物為蛋白質(zhì)或非編碼RNA (noncoding RNA)?？梢赃x擇僅為表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物基因的轉(zhuǎn)基因，也可以選擇帶有自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。非編碼RNA 可以為小發(fā)夾 RNA (smalI hairpin RNA, shRNA)、微小 RNA (micorRNA，miRNA)、反義 RNA(antissense RNA)、誘傅 RNA(decoy RNA)和核酶(ribozyme)中的至少一種。生產(chǎn)出來的重組病毒表達(dá)的蛋白質(zhì)可以為補(bǔ)充體內(nèi)功能有缺陷的蛋白，例如與病毒蛋白特異性結(jié)合的蛋白；表達(dá)的非編碼RNA可以與病毒的靶mRNA淬火鏈合(anneal ing)，將其裂解或抑制其翻譯，達(dá)到阻止蛋白質(zhì)的合成和病毒復(fù)制的目的。這種微環(huán)DNA基因載體組合物所包含的第一微環(huán)DNA基因載體和第二微環(huán)DNA基因載體均為雙鏈的DNA，可以通過如下方法制備步驟一、提供具有重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)(attB)和重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)(attP)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。步驟二、制備第一微環(huán)DNA基因載體。
將第一啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分、用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子三種DNA成分按照先后順序依次插入到標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到包含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體。使用重組酶OC31處理所述含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體，重組得到所述微環(huán)DNA基因載體。步驟三、制備第二微環(huán)DNA基因載體。將第二啟動(dòng)子和所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因按照先后順序依次插入到所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到含有所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的DNA成分的載體；使用重組酶OC31處理所述含有所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因的載體，重組后得到第二微環(huán)DNA基因載體。步驟四、將第一微環(huán)DNA基因載體和第二微環(huán)DNA基因載體混合，得到微環(huán)DNA基因載體組合物。 通過Chen 等的微環(huán) DNA 技術(shù)(Chen, Z. Y. , et al. , Minicircle DNA vectorsdevoid of bacteial DNA result in persistent and high level transgene expressionin vivo. Mol. Ther.，2003.)，制備得到第一微環(huán)DNA基因載體和第二微環(huán)DNA基因載體。第一微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，包括第一啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。第一微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的基因成分和治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期。第二微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，包括第二啟動(dòng)子和所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的成分。第二微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的組裝蛋白至少兩個(gè)星期。針對(duì)乙肝病毒(HBV)，介紹一實(shí)施方式的利用HBV基因的微環(huán)DNA基因載體組合物。本實(shí)施方式中所用的HBV的基因組為Galibert所報(bào)道的ayw菌株(Galibert,F. , et al. , Nucleotide sequence of the hepatitis B virus genome(suntype ayw)cloned in E. coli. Nature 1979. 281 :p. 646-650 ;GenBank 號(hào) V01640)作為模范序列，簡(jiǎn)稱ayw. Galibert，來自含有I. 2單位的HBV基因組的質(zhì)粒pTHBV2 (McCaffrey，A. P.，et al. , Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. NatureBiotechnology,2003. 21(6) :639))。根據(jù) Nassal(NASSAL, M. and A. RIEGER, A BulgedRegion of the Hepatitis B Virusrus RNA Encapsidation Signal Contains theReplication Origin for Discontinuous First-Strand DNA Synthesis. JOURNAL0FVIR0L0GY, 1996. 70(5) p. 2764-2773)的建議，DNA序列以核心蛋白基因啟始密碼ATG為5’端，前基因組RNA第一個(gè)堿基為第3100。本實(shí)施方式的微環(huán)DNA基因載體組合物中的第一微環(huán)DNA基因載體如圖I所示，包括巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子(cytomegalovirus immediate early promoter,CMV)、HBV基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子。HBV基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括5’包裝信號(hào)(Encapsulationsignal,Enc)、3’包裝信號(hào)(3，Enc)、第一增強(qiáng)子(Enhancer I,Enhl)以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域(Replication regulatory region, RCR),上述基因主要負(fù)責(zé)HBV的包裝、復(fù)制和表達(dá)。
轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子用于表達(dá)治療型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，可以記為Ther.(Therapeutic transgene) 。第一微環(huán)DNA基因載體包含的各種成分為依次連接的CMV、5’ Enc、Ther.、EnhURCR和3’ Enc，連接CMV和Enc的序列中存在固有的重組產(chǎn)物attR。本實(shí)施方式中第一啟動(dòng)子為CMV。在其他的實(shí)施方式中，第一啟動(dòng)子可以選擇啟動(dòng)子為核心蛋白基因的啟動(dòng)子(Cp)、第二型多聚酶基因啟動(dòng)子或第三型多聚酶基因啟動(dòng)子。第二型多聚酶基因啟動(dòng)子可以為CMV或UB(泛素基因的啟動(dòng)子)，第三型多聚酶基因啟動(dòng)子可以為HI。Hl啟動(dòng)子可得自 “pSilencer 3. 1-Hlneo，，質(zhì)粒(Applied Biosystem, Carlsbad, California, USA)。這種第一微環(huán)DNA基因載體可以記為MC. CMV. Ther. RC,統(tǒng)稱MCI。結(jié)合圖2和圖3，以CMV啟動(dòng)子為例，對(duì)MC. CMV. Ther. RC的制備方法進(jìn)行說明參照Chen等的微環(huán)DNA技術(shù),提供如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 4>C31。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 4>C31具有可誘導(dǎo)的重組酶OC31位點(diǎn)、可誘導(dǎo)的歸巢內(nèi)切酶(homingendonuclease)I-SceI位點(diǎn)、重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)(attB)、重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)(attP)以及多克隆位點(diǎn)MCS。將CMV、HBV基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分共三個(gè)DNA片段用標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆技術(shù)，依次插入到P2 0C31的多克隆位點(diǎn)中，三個(gè)DNA片段為(1)、CMV. Enc, CMV和5’Enc,相當(dāng)于 MC. 2013 的 16 712 共 697bp (Li SB 等，High expression of hepatitisB virus based vector with reporter gene in hepatitis B virus infection system.World J Gastroenterol 13(17) :2490,2007);⑵、Enh I,相當(dāng)于ayw. Galibert 的2264 2601 共 338bp ； (3)、RCR. Enc，病毒復(fù)制調(diào)控區(qū)和 3，Enc，相當(dāng)于 ayw. Galibert 的 2913 3182/1 20共290bp。RCR. Enc中包含第一、第二重復(fù)序列(DRl和DR2，圖中未顯示)，與DNA合成有關(guān)的序列￠(圖中未顯示)，第二增強(qiáng)子(Enh 2，圖中未顯示)，核心蛋白基因增強(qiáng)子以及前基因組RNA的3’包裝信號(hào)(3’ Enc)。上述操作完成后，得到如圖3所示的空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC，接著將Ther.插入到 5，Enc 下游，得到 pMC. CMV. Ther. RC。上述三個(gè)乙肝病毒DNA 片段均可從 pTHBV2 (McCaffrey, A. P. , et al. , Inhibitionof hepatitis B virus in mice by RNA interference. Nature Biotechnology,2003. 21(6) :639))中得到。得到pMC. CMV. Ther. RC后，可利用Chen等的微環(huán)DNA技術(shù)，attB和attP序列重組形成attR，最終得到MC. CMV. Ther. RC。本實(shí)施方式的微環(huán)DNA基因載體組合物中的第二微環(huán)DNA基因載體如圖4所示，包括泛素基因的啟動(dòng)子(UB)以及HBV基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分。HBV基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分為ayw. Galibert的I 2905共2905bp的序列。第二微環(huán)DNA基因載體包含的各種成分為依次連接的UB和ayw. Galibertl 2905,連接UB和ayw. Galibert I 2905的序列中存在固有的重組產(chǎn)物attR, ayw.Galibert I 2905的末端連接有bpA。本實(shí)施方式中第二啟動(dòng)子為UB。在其他的實(shí)施方式中，啟動(dòng)子可以選擇為其他種類的第二型多聚酶基因啟動(dòng)子，例如CMV。這種第二微環(huán)DNA基因載體可以記為MC. UB. HBVprotein,統(tǒng)稱MC2。
MC. UB. HBVprotein的制備方法與MC. CMV. Ther. RC類似，下面簡(jiǎn)單進(jìn)行說明參照Chen等的微環(huán)DNA技術(shù)，提供如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2<^C31。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 4>C31具有可誘導(dǎo)的重組酶OC31位點(diǎn)、可誘導(dǎo)的歸巢內(nèi)切酶(homing endonuclease)I-SceI位點(diǎn)、重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)(attB)、重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)(attP)以及多克隆位點(diǎn)。將UB和HBV基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分采用標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆技術(shù)，末端連接上豬生長(zhǎng)因子基因的poly A信號(hào)(記為bpA)后，插入到p2(tC31的多克隆位點(diǎn)中。HBV基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分為ayw. Galibert的I 2905共2905bp的序列。最后利用Chen等的微環(huán)DNA技術(shù)，attB和attP序列重組形成attR，最終得到MC. UB. HBVprotein?！C. CMV. Ther. RC和MC. UB. HBVprotein混合后，得到微環(huán)DNA基因載體組合物。下面結(jié)合圖5，對(duì)將微環(huán)DNA基因載體組合物送入到靶細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)和復(fù)制的機(jī)理進(jìn)行簡(jiǎn)單說明。本實(shí)施方式中，以肝竇內(nèi)皮細(xì)胞為靶細(xì)胞，rHBV穿過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔后，進(jìn)入感染了 HBV的肝主質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。將微環(huán)DNA基因載體組合物送入肝竇內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)，MC. CMV. Ther. RC和MC. UB.HBVprotein共同表達(dá)，組裝形成rHBV。具體過程為MC. CMV. Ther. RC先轉(zhuǎn)錄形成前基因組RNA(pgRNA), MC. UB. HBVprotein 表達(dá)核心蛋白、多聚酶(polymerase, pol)、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白。前基因組RNA與Po I —起，被核心蛋白包裝得到不成熟的病毒粒子(nucleocapsid)。接著,不成熟的病毒粒子中的前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄形成兩條DNA雙鏈,其中一條較長(zhǎng)負(fù)鏈已經(jīng)形成完整的開放式環(huán)狀，另一條長(zhǎng)度較短的正鏈，呈半環(huán)狀。最后不成熟的病毒顆粒被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)包裹，大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白被加入到病毒粒子中，形成治療性的、感染性的rHBV。rHBV的基因組是由兩條螺旋的DNA鏈圍成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中一條較長(zhǎng)負(fù)鏈已經(jīng)形成完整的開放式環(huán)狀，另一條長(zhǎng)度較短的正鏈，呈半環(huán)狀。rHBV可以穿過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔，從而進(jìn)入到感染了 HBV病毒的肝主質(zhì)細(xì)胞中，感染肝主質(zhì)細(xì)胞之后，rHBV的DNA鏈要以負(fù)鏈為模板，在DNA聚合酶的作用下延長(zhǎng)，最終形成完整的環(huán)狀。這時(shí)重組乙肝病毒基因組就形成了一個(gè)完全開放式的環(huán)狀的雙鏈DNA，經(jīng)過DNA重組成為重組共價(jià)鍵密閉環(huán)狀 DNA (recombined covalent closed circular, rcccDNA),具有野生乙肝病毒重組共價(jià)鍵密閉環(huán)狀DNA (covalent closed circular, cccDNA) 一樣的表達(dá)和復(fù)制功能。rcccDNA沒有CMV，可以記為MC. Ther. RC0 MC. Ther. RC中RCR和新形成的的Enc相連形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子(Cp)，加上上游Enhl，能夠長(zhǎng)期地、高水平地表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。MC. Ther. RC的結(jié)構(gòu)如圖6所示，包含的各種成分為依次連接的Enc、Ther.、Enhl和RCR，RCR和Enc連接到一起，形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子Cp，加上促進(jìn)子Enhl，從而能夠長(zhǎng)期表達(dá)高水平的、治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域?yàn)橐腋尾《净蚪M中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分。MC. Ther. RC中包括啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子，并且不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分。
因此，MC. Ther. RC為另一實(shí)施方式的MCI。MC. Ther. RC 可以通過將 MC. CMV. Ther. RC 和 MC. UB. HBVprotein 送入到哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞內(nèi)后提取得到；也可以通過將MC. CMV. Ther. RC送入感染了 HBV的肝主質(zhì)細(xì)胞中后提取得到；還可以采用類似于MC. CMV. Ther. RC的制備方法，采用基因重組的手段，將相關(guān)序列插入到p2<^C31的多克隆位點(diǎn)中后采用Chen等的微環(huán)DNA技術(shù)，大量制備含有attR的MC. Ther. RC。MC. Ther. RC與MC. UB. HBVprotein混合后，也可以得到具有治療功能的微環(huán)DNA基因載體組合物，將這種微環(huán)DNA基因載體組合物送入到肝內(nèi)皮細(xì)胞后，MC. Ther. RC在啟動(dòng)子Cp驅(qū)動(dòng)表達(dá)前基因組RNA。MC. UB. HBVprotein中啟動(dòng)子UB驅(qū)動(dòng)表達(dá)病毒蛋白，并將重組的HBV前基因組RNA包裝成治療性的、感染性的重組HBV(rHBV)。具體重組過程及rHBV中的基因組結(jié)構(gòu)與前述基本相同，在此不重復(fù)敘述。rHBV可以穿過肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔，從而進(jìn)入到感染了 HBV病毒的肝主質(zhì)細(xì)胞中，感染肝主質(zhì)細(xì)胞之后，rHBV的DNA鏈要以負(fù)鏈為模板，在DNA聚合酶的作用下延長(zhǎng)，最終形成完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(rcccDNA)，該結(jié)構(gòu)為MC. Ther. RC。MC. CMV. Ther. RC在表達(dá)前基因組RNA時(shí)，會(huì)導(dǎo)致CMV啟動(dòng)子和attR序列的丟失，從而其結(jié)構(gòu)中的5’Enc和3’Enc相連,形成新的Enc,而RCR和新形成的的Enc相連形成啟動(dòng)子Cp,再經(jīng)過后續(xù)的逆轉(zhuǎn)錄等過程,形成的rcccDNA為MC. Ther. RC。MC. Ther. RC在表達(dá)前基因組RNA時(shí)，并不會(huì)有序列的丟失，最后得到的rcccDNA為其本身。本實(shí)施方式中，Ther.為不帶有自身啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因AntiHBV，用于抑制HBV的復(fù)制，從而治療乙肝病毒感染。根據(jù)Ther.是否帶有自身啟動(dòng)子，以及啟動(dòng)子的種類，分別應(yīng)用到MC. CMV. Ther. RC和MC. Ther. RC中，可以得到不同實(shí)施方式的具體的MCI。AntiHBV 表達(dá)非編碼 RNA,可以為 shRNA、miRNA、antissense RNA、decoyRNA 和ribozyme中的至少一種。本實(shí)施方式中，AntiHBV表達(dá)miRNA，具體的信息見圖7B。下述各種載體中，如無特別說明，AntiHBV均表達(dá)如圖7B所示的miRNA。如圖7A所示，將轉(zhuǎn)基因AntiHBV、轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子UB. AntiHBV和轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子HI. AntiHBV分別插入到空白載體pMC. CMV. GeneLess. RC的5’Enc下游，再通過微環(huán)DNA技術(shù)，得到不同的MCI。如圖7B所示的本實(shí)施方式的AntiHBV表達(dá)的抗乙肝病毒的miRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)為RNAi兩種基本形式之一，加黑斜體部分為抗HBVsiRNA，引自Ely等(Ely, A. , T. Naidoo, and P. Arbuthnot, Efficient silencing of gene expression withmodular trimeric Pol II expression cassettes comprising microRNA shuttles.Nucleic Acids Research,2009. 37(13) :p.e91)。如圖7C所示的另一實(shí)施方式的AntiHBV抗乙肝病毒的shRNA的推測(cè)的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)為RNAi的另外一種基本形式。加黑斜體部分為抗HBVsiRNA，引自McCaffreyAP et al. (McCaffrey,A. P. ,et al. , Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNAinterference. Nature Biotechnology,2003. 21(6) :639))。如圖8A所示的MC. CMV. AntiHBV. RC,表達(dá)后得到的RC. Cp. AntiHBV如圖8B所示，RCR和Enc連接到一起，形成啟動(dòng)子Cp。這里對(duì)表達(dá)后得到的rcccDNA的命名進(jìn)行了些修改，以顯示出啟動(dòng)子，當(dāng)然這并不影響方案的實(shí)施。即前述的MC. Ther. RC在Ther.為具體的基因時(shí)，命名改變?yōu)镽C. Cp. Ther.，后面也沿用這樣的命名。如圖9A 所示的 MC. CMV. UB. AntiHBV. RC,表達(dá)后得到的 RC. UB. AntiHBV 如圖 9B 所
/Jn o如圖IOA 所示的 MC. CMV. HI. AntiHBV. RC，表達(dá)后得到的 RC. HI. AntiHBV 如圖 IOB所示。在其他的實(shí)施方式中，根據(jù)Ther.的不同，可以獲得具有不同功能的微環(huán)DNA基因載體組合物。第二微環(huán)DNA基因載體仍以MC. UB. HBVprotein為例。下面通過第一微環(huán)DNA 基因載體中Ther.的不同，來介紹不同功能的基因載體組合物?！獙?shí)施方式的用于表達(dá)報(bào)告基因的第一微環(huán)DNA基因載體,本實(shí)施方式中，報(bào)告基因?yàn)樵鰪?qiáng)型魚綠色熒光蛋白(EGFP)基因。根據(jù)EGFP基因自身是否帶有啟動(dòng)子，可以得到兩種類型的第一微環(huán)DNA基因載體。如圖IlA所示的第一微環(huán)DNA基因載體，EGFP基因自身不帶啟動(dòng)子，記為MC. CMV. EGFP. RC，由其衍生的rcccDNA如圖IlB所示，RCR和Enc連接到一起，形成啟動(dòng)子Cp。如圖12A所示的第一微環(huán)DNA基因載體，EGFP基因自身帶有啟動(dòng)子UB，記為MC. CMV. UB. EGFP. RC,表達(dá)后得到的RC. Cp. UB. EGFP如圖12B所示。本實(shí)施方式的第一微環(huán)DNA基因載體與MC. UB. HBVprotein混合后得到的微環(huán)DNA基因載體組合物能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重組形成具有表達(dá)EGFP基因功能的rHBV，且該rHBV可以穿過體內(nèi)包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔在內(nèi)的屏障。如圖13A所示的一實(shí)施方式的用于表達(dá)抗胰蛋白酶(humanalpha-lantitrypsin, hAAT)的第一微環(huán)DNA基因載體，記為MC. CMV. hAAT. RC。由其衍生的
13B所示，RCR和Enc連接到一起，形成啟動(dòng)子Cp。本實(shí)施方式的第一微環(huán)DNA基因載體與MC. UB. HBVprotein混合后得到的微環(huán)DNA基因載體組合物能夠在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)重組形成具有表達(dá)抗胰蛋白酶功能的rHBV，且該rHBV可以穿過體內(nèi)包括肝竇內(nèi)皮細(xì)胞孔在內(nèi)的屏障。微環(huán)DNA基因載體組合物在投遞到哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)后，還面臨著一個(gè)問題。當(dāng)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物為針對(duì)HBV病毒的非編碼RNAOioncoding RNA)時(shí)，具體到上述實(shí)施例中第一微環(huán)DNA基因載體的Ther.表達(dá)抗乙肝病毒的miRNA，該非編碼RNA產(chǎn)生的RNAi會(huì)破壞前基因組RNA和編碼病毒蛋白的mRNA，影響第二微環(huán)DNA基因載體的正常表達(dá)，最終導(dǎo)致rHBV無法正常形成。需要注意的是，當(dāng)治療型轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物為針對(duì)其他種類病毒的非編碼RNA時(shí)，由于RNAi的特異性，并不會(huì)影響到第二微環(huán)DNA基因載體的正常表達(dá)。另一個(gè)問題是，當(dāng)前基因組RNA含有shRNA或miRNA的結(jié)構(gòu)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的Drosha-Pasha/DGCR8復(fù)合物，會(huì)將它們從前基因組RNA分離，破壞前基因組RNA的完整性，不能被包裝成rHBV?；谏鲜隼碛?，我們開發(fā)了變性編碼子和敲下DGCR8兩種技術(shù)用于解決上述問題，以使得第二微環(huán)DNA基因載體可以正常表達(dá)。下面對(duì)變性編碼子和抗DGCR8兩種技術(shù)分別進(jìn)行介紹。變性編碼子技術(shù)通過采用編碼相同氨基酸序列的變性碼序列替換野生序列，而這種變性碼序列轉(zhuǎn)錄后得到的前基因組RNA和mRNA不會(huì)被RNAi特異性的識(shí)別，不會(huì)被第一微環(huán)DNA基因載體所表達(dá)非編碼RNA破壞，從而可以正常的表達(dá)HBV蛋白，最終完成rHBV的包裝。提供三個(gè)變性編碼子序列，分別如圖14A、圖14C和圖14D所示。如圖14A所示，多聚酶基因中的第一 siRNA模范靶序列(McCaffrey，A. P.，etal. ， Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference.NatureBiotechnology, 2003. 21(6) :639))與變性碼序列編碼相同的氨基酸序列，但是RNA序列卻不相同。如圖14B所示，野生的多聚酶基因表達(dá)產(chǎn)生的mRNA與第一 siRNA序列互補(bǔ)淬合，最終被裂解，從而無法表達(dá)多聚酶，導(dǎo)致rHBV病毒顆粒無法正常形成。而采用變性碼序列的mRNA無法與第一 siRNA序列互補(bǔ)淬合，從而可以順利的表達(dá)多聚酶，rHBV病毒顆?？梢皂樌男纬?。 如圖14C所示，多聚酶基因中的第二 siRNA模范靶序列(Ely，A.，T. Naidoo, andP. Arbuthnot,Effiicient silencing of gene expression with modular trimeric PolII expression cassettes comprising microRNA shuttles. Nucleic Acids Research，2009. 37(13) p. e91.)與變性碼序列編碼相同的氨基酸序列，但是RNA序列卻不相同。如圖14D所示，表面蛋白基因中的第三siRNA模范靶序列(McCaffrey, A. P.,et al. , Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference. NatureBiotechnology, 2003. 21(6) :639))與變性碼序列編碼相同的氨基酸序列，但是RNA序列卻不相同。采用上述變性碼序列替代相應(yīng)的野生序列，可以得到結(jié)合變性編碼子技術(shù)制備的第二微環(huán)DNA基因載體。下面提供一實(shí)施方式的結(jié)合變性編碼子技術(shù)的第二微環(huán)DNA基因載體。首先，將多聚酶基因中的第一 siRNA模范靶序列和第二 siRNA模范靶序列用相應(yīng)的變性碼序列替換，記為degPol。將大表面蛋白基因的中第三siRNA模范靶序列用相應(yīng)的變性碼序列替換，記為deg. LHBsAgo將小表面蛋白基因中第三siRNA模范靶序列用相應(yīng)的變性碼序列替換，記為deg. sHBsAgo隨后,用來自parcoviruses的自我裂解的多酞2A連接核心蛋白的基因(Core gene, C)以及上述三個(gè)基因片段，成為融合基因。然后，將啟動(dòng)子UB、融合基因、豬生長(zhǎng)因子基因的poly A信號(hào)依次插p20C31的多克隆位點(diǎn)。最后利用Chen等的微環(huán)DNA技術(shù)，制得如圖15所示的結(jié)合變性編碼子技術(shù)的第二微環(huán)DNA基因載體，記為 MC. degHBVprotein。其中，核心蛋白的基因(C)為ayw. Galibert的第I 552個(gè)堿基對(duì)，多聚酶的基因?yàn)閍yw. Galibert的第407 2897個(gè)堿基對(duì)，2A來自parcoviruses的自我裂解多酞，大表面蛋白的基因?yàn)閍yw. Galibert的第948 2118個(gè)喊基對(duì)，小表面蛋白基因?yàn)閍yw. Galibert的第1437 2118個(gè)堿基對(duì)。接下來對(duì)敲下DGCR8技術(shù)進(jìn)行介紹。本實(shí)施方式中，采用將表達(dá)敲下DGCR8基因的RNAi的成分連接到第二微環(huán)DNA基因載體中，實(shí)現(xiàn)對(duì)DGCR8基因的敲除。參與將pri-miRNA加工成siRNA的細(xì)胞成分包括蛋白質(zhì)Drosha、Pasha(又名DGCR8)和 Dicer 等。Drosha-Pasha 復(fù)合體負(fù)責(zé)將 miRNA UpriiiRNA 上切下，再由 Dicer等加工成RNAi。含有miRNA的前基因組RNA相當(dāng)于pri-miRNA。用siRNA技術(shù)敲下DGCR8，使細(xì)胞內(nèi)不含或僅含極低水平的DGCR8，帶有miRNA的大部分前基因組RNA，便可保持完整，被包裝成rHBV。如圖16所示的一實(shí)施方式的第二微環(huán)DNA基因載體，與MC. UB. HBVprotein的區(qū)別僅在于bpA后面所連接的Hl啟動(dòng)子以及siRNA. DGCR8序列，記為MC. AntiDGCR8.HBVprotein。siRNA. DGCR8 序列為抗 DGCR8 的 siRNA 表達(dá)盒子，以 DGCR8mRNA(GeneBankNM_022720) 526 548 作為模范靶子，構(gòu)建 pMC. Anti. DGCR8protein，其靶序列為 “ccc tgctgagga ccc ctt caa C”。表達(dá)抗DGCR8的shRNA包括終止子的合成DNA序列為“gttg aagggg tcc tea gca ggg CTTCGAA ccc tgc tga gga ccc ctt caa c TTTTT”,加底線的序列TTTTT為啟動(dòng)子Hl的終止信號(hào)。MC. AntiDGCR8. HBVprotein表達(dá)合成的抗DGCR8dlsiRNA序列為 “g uug aag ggg ucc tea gca ggg' MC. AntiDGCR8. HBVprotein 的制備方法與 MC. UB. HBVprotein 基本相同，具體為參照Chen等的微環(huán)DNA技術(shù),提供如圖2所示的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 4>C31。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒p2 4>C31具有可誘導(dǎo)的重組酶￠^31位點(diǎn)、可誘導(dǎo)的歸巢內(nèi)切酶(homing endonuclease) I-SceI位點(diǎn)、重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)(attB)、重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)(attP)以及多克隆位點(diǎn)。將UB和HBV基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的成分采用標(biāo)準(zhǔn)DNA克隆技術(shù)，末端連接上豬生長(zhǎng)因子基因的polyA信號(hào)(記為bpA)后，插入至IJ p2(j5C31的多克隆位點(diǎn)中。再將Hl啟動(dòng)子和siRNA. DGCR8序列融合后插入到polyA信號(hào)下游的PspOMl酶切點(diǎn)。最后利用Chen等的微環(huán)DNA技術(shù),attB和attP 序列重組形成 attR,最終得到 MC. AntiDGCR8. HBVprotein。如圖17所示的一實(shí)施方式的第二微環(huán)DNA基因載體，與MC. degHBVprotein的區(qū)別僅在于bpA后面所連接的Hl啟動(dòng)子以及siRNA. DGCR8序列，記為MC. AntiDGCR8.degHBVprotein。MC. AntiDGCR8. degHBVprotein的制備方法參照前述可以輕易得出，在此不再重復(fù)敘述。本發(fā)明還提供一種試劑盒，包括如上所述的微環(huán)DNA基因載體組合物以及用于將該微環(huán)DNA基因載體組合物送入靶細(xì)胞的工具。在一般的實(shí)施例中，可以選擇用脂質(zhì)體(Lipofectamine)與微環(huán)DNA基因載體組合物混合，將微環(huán)DNA基因載體組合物送入靶細(xì)胞。下面通過具體的實(shí)驗(yàn)，來驗(yàn)證上述制備的微環(huán)DNA基因載體組合物的功能。I、測(cè)定第一、第二微環(huán)DNA基因載體表達(dá)蛋白質(zhì)的功能。實(shí)驗(yàn)分成五組(I) ,MC. UB. HBVprotein (圖 4)(2) > MC. degHBVprotein (圖 15)(3)、MC. AntiDGCR8. degHBVprotein (圖 I3A)(4)、MC. CMV. hAAT. RC (圖 16)(5)、無處理組。選擇微環(huán)DNA基因載體,每種5 ii g,與Lipofectamine形成復(fù)合物,感染人肝癌細(xì)胞株huh7 ;無處理組未進(jìn)行任何處理。48小時(shí)后，用ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)第I 3組細(xì)胞，表達(dá)相當(dāng)水平的HBV表面抗原(HBsAG)，而第4、5組陰性；相反，只有第4組細(xì)胞hAAT陽性，而其它組都陰性。Northern blot檢測(cè)，以pTHBV2中的ayw. Galibert序列為探針,發(fā)現(xiàn)第I組細(xì)胞，表達(dá)各種乙肝病毒mRNA，包括核心蛋白/pol、大表面抗原、小表面抗原mRNA ;第2、3組，沒有2. 9kb的核心蛋白/pol mRNA,而見0. 5kb和2. 5kb的mRNA，相當(dāng)于核心蛋白和多聚酶mRNA ;第4、5組陰性。結(jié)果表明，這些第一、第二微環(huán)DNA基因載體能按設(shè)計(jì)，表達(dá)相關(guān)的蛋白或mRNA。Lipofectamine 2000 是美國 Invitrogen 的產(chǎn)品(Carlsbad, California, USA)。2、測(cè)定第一、第二微環(huán)DNA基因載體表達(dá)EGFP的功能。實(shí)驗(yàn)分成五組(l)MC. CMV. EGFP. RC (圖 11A)
(2) MC. CMV. UB. EGFP. RC (圖 12A)(3) RC. Cp. UB. EGFP (圖 12B)(4) MC. CMV. hAAT. RC (圖 13A)(5) Lipofactamin 對(duì)照組選擇微環(huán)DNA基因載體，每種5 ii g,加上Lipofactamin后，轉(zhuǎn)染huh7細(xì)胞；Lipofactamin對(duì)照組僅用Lipofectamine處理。48小時(shí)后,用突光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，第1、2、3組，10%以上的細(xì)胞，表達(dá)相當(dāng)高水平的魚綠色熒光蛋白，而第4、5組陰性。結(jié)果表明，第一、第二微環(huán)DNA基因載體能按照設(shè)計(jì)，表達(dá)魚綠色熒光基因。3、測(cè)定各種微環(huán)DNA基因載體組合物的復(fù)制功能。實(shí)驗(yàn)分成五組(I)、MC. CMV. EGFP. RC (圖 11A)加 MC. UB. HBVprotein (圖 4)(2)、MC. CMV. UB. EGFP. RC (圖 12A)力口 MC. UB. HBVprotein (圖 4)(3、MC. CMV. hAAT. RC 圖 13A)力口 MC. UB. HBVprotein (圖 4)(4)、僅有 MC. UB. HBVprotein (圖 4)。這里用體內(nèi)加體外雙重實(shí)驗(yàn)方法來測(cè)定。首先，第I 3組，每組兩種微環(huán)DNA基因載體，每種4 y g，一起與2mL的生理鹽水混合，按照標(biāo)準(zhǔn)程序，通過尾靜脈高壓注入小鼠月干臟(Zhang, G. , V. Budker, and J. A. Wolff, High levels of foreign gene expressionin hepatocytes after tail vein injections of naked plasmidDNA. Hum Gene Ther,1999. 10(10) p. 1735-7.) ’第4組僅注MC. UB. HBVprotein。每組三只雌性小鼠，品種為B和T淋巴細(xì)胞缺乏的N0D/SI⑶，10周大。48小時(shí)后，收集小鼠血清，加入6井的人肝細(xì)胞原代培養(yǎng)，每井100微升。24小時(shí)后，用顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，第1、2組，10%以上的細(xì)胞表達(dá)顯著的魚綠色熒光，而第3、4組陰性。將這些細(xì)胞收集，制備總DNA，用PCR和Southern blot的方法,檢測(cè)載體DNA EGF P,發(fā)現(xiàn)第1、2組陽性,并有rcccDNA形成,而第3、4組陰性。這些結(jié)果表明，MC. CMV. EGFP. RC和MC. CMV. UB. EGFP. RC中的HBV病毒DNA成分，賦予這兩個(gè)MC. Report. RC表達(dá)、復(fù)制的功能，使它們能在小鼠肝內(nèi)表達(dá)病毒前基因組RNA，被MC. UB. HBVprotein所表達(dá)的病毒蛋白包裝病毒顆粒，被排入血循環(huán)，并能感染原代培養(yǎng)的人肝細(xì)胞，表達(dá)報(bào)告基因，形成重組共價(jià)鍵密閉環(huán)狀DNA (rcccDNA)。4、測(cè)定各種微環(huán)DNA基因載體組合物抗乙肝病毒的功能。實(shí)驗(yàn)分成6組(I)、MC. CMV. AntiHBV. RC (圖 8A)、MC. UB. HBVprotein (圖 4)加 MC. CMV. hAAT.RC (圖 13A)(2)、MC. CMV. AntiHBV. RC (圖 8A)、MC. degHBVprotein (圖 15)加 MC. CMV. hAAT.RC (圖 13A)(3)、MC. CMV. AntiHBV. RC (圖 8A)、MC. AntiDGCR8. degHBVprotein (圖 17)加MC. CMV. hAAT. RC (圖 13A)(4)、RC. Cp. UB. EGFP (圖 12B)、MC. UB. HBVprotein (圖 4)加 MC. CMV. hAAT. RC (圖13A)(5)、RC. Cp. UB. EGFP (圖 12B)、MC. degHBVprotein (圖 15)加 MC. CMV. hAAT. RC (圖·13A)(6)、RC. Cp. UB. EGFP (圖 12B)、MC. AntiDGCR8. degHBVprotein (圖 17)加 MC. CMV.hAAT. RC (圖 13A)。第I、2和3組的AntiHBV序列，能表達(dá)抗乙肝病毒的治療性miRNA (如圖7B所示)；第4、5、6組中，用表達(dá)EGFP的載體代替抗乙肝的MC. RC，作為對(duì)照組。為了測(cè)定它們抗HBV功能，將每組三種DNA，每種5微克，與2毫升生理鹽水混合后，用標(biāo)準(zhǔn)尾靜脈注高壓射法，注入小鼠肝內(nèi)。每組3只雌性小鼠，品種為B和T淋巴細(xì)胞缺乏的N0D/SI⑶，10周大。48小時(shí)后，用ELISA測(cè)定血中的hAAT、HBsAg的水平，用qPCR測(cè)定血中HBV DNA的含量。所有6個(gè)組，都表達(dá)相似水平的hAAT，證明尾靜脈注高壓射DNA的均勻性。第I 3組，血中的HBsAg水平顯著低于第4 6組，而第4 6組之間，沒有顯著差別；血中HBV DNA,第I組最低，第2組稍高，第3組最高，第4 6組陰性。這些結(jié)果證明了這個(gè)AntiHBV序列的抗HBV的治療作用，以及變性編碼子與敲下DGCR8對(duì)表達(dá)病毒包裝蛋白功能的保護(hù)作用。第I組的病毒包裝蛋白mRNA，被siRNA與DGCR8 (Pasha)兩重性破壞，故血中只有微量的HBsAg與rHBV DNA，變性編碼子使病毒mRNA不被siRNA破壞，而敲下DGCR8進(jìn)一步保護(hù)病毒mRNA，不被Drosha/Pasha復(fù)合體破壞,有疊加保護(hù)作用。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的一種或幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1.一種微環(huán)DNA基因載體組合物,其特征在于,包括第一微環(huán)DNA基因載體和第二微環(huán)DNA基因載體； 所述第一微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，所述第一微環(huán)DNA基因載體包括第一啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分以及用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子； 所述第二微環(huán)DNA基因載體不含標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中能關(guān)閉轉(zhuǎn)基因表達(dá)的骨架DNA成分，所述第二微環(huán)DNA基因載體包括第二啟動(dòng)子和所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因； 所述第一微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的基因成分和所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物至少兩個(gè)星期，所述第二微環(huán)DNA基因載體可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定的、高通量的表達(dá)所述病毒的組裝蛋白至少兩個(gè)星期，所述病毒的基因成分和所述病毒的組裝蛋白可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)組裝形成可以表達(dá)所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物并具有侵染性的重組病毒。
2.如權(quán)利要求I所述的微環(huán)DNA基因載體組合物，其特征在于，所述病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分為乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分； 所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因?yàn)橐腋尾《净蚪M中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因。
3.如權(quán)利要求2所述的微環(huán)DNA基因載體組合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括5’包裝信號(hào)、3’包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域； 所述啟動(dòng)子、所述5’包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子、所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域以及所述3’包裝信號(hào)依次連接。
4.如權(quán)利要求2所述的微環(huán)DNA基因載體組合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分包括包裝信號(hào)、第一增強(qiáng)子以及病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域； 所述包裝信號(hào)、所述轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子、所述第一增強(qiáng)子以及所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域依次連接，所述病毒復(fù)制調(diào)節(jié)區(qū)域和包裝信號(hào)連接到一起，形成核心蛋白基因的啟動(dòng)子。
5.如權(quán)利要求2所述的微環(huán)DNA基因載體組合物，其特征在于，所述乙肝病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)多聚酶、核心蛋白、大表面蛋白、中表面蛋白和小表面蛋白的基因采用變性碼序列替代。
6.如權(quán)利要求2所述的微環(huán)DNA基因載體組合物，其特征在于，所述第二微環(huán)DNA基因載體還包括表達(dá)敲下DGCR8基因的RNAi的成分。
7.如權(quán)利要求I所述的微環(huán)DNA基因載體組合物，其特征在于，所述第一啟動(dòng)子為核心蛋白基因的啟動(dòng)子、第二型多聚酶基因啟動(dòng)子或第三型多聚酶基因啟動(dòng)子； 所述第二啟動(dòng)子為第二型多聚酶基因啟動(dòng)子。
8.如權(quán)利要求I所述的微環(huán)DNA基因載體組合物，其特征在于，所述第一微環(huán)DNA基因載體為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，第二微環(huán)DNA基因載體為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)。
9.一種權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的微環(huán)DNA基因載體組合物的制備方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一、提供具有重組酶OC31的細(xì)菌DNA附著點(diǎn)和重組酶OC31的噬菌體DNA附著點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒； 步驟二、制備第一微環(huán)DNA基因載體；將第一啟動(dòng)子、病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的成分、用于表達(dá)治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子三種DNA成分按照先后順序依次插入到所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克 隆位點(diǎn)中，得到含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體；使用重組酶OC31處理所述含有轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒子的載體，重組后得到所述第一微環(huán)DNA基因載體； 步驟三、制備第二微環(huán)DNA基因載體；將第二啟動(dòng)子和所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因按照先后順序依次插入到所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，得到含有所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因的載體；使用重組酶OC31處理含有所述病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)所述病毒的組裝蛋白的基因的載體，重組后得到所述第二微環(huán)DNA基因載體； 步驟四、將所述第一微環(huán)DNA基因載體和所述第二微環(huán)DNA基因載體混合，得到所述微環(huán)DNA基因載體組合物。
10.一種試劑盒，其特征在于，包括如權(quán)利要求I 8中任一項(xiàng)所述的微環(huán)DNA基因載體組合物以及用于將所述微環(huán)DNA基因載體組合物送入靶細(xì)胞的工具。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微環(huán)DNA基因載體組合物，包括將病毒基因組中負(fù)責(zé)基因表達(dá)和病毒復(fù)制的DNA成分、轉(zhuǎn)基因克隆到載體中，得到的第一微環(huán)DNA基因載體，以及將病毒基因組中負(fù)責(zé)表達(dá)病毒組裝蛋白質(zhì)基因克隆到載體中，得到的第二微環(huán)DNA基因載體。將這種微環(huán)DNA基因載體組合物送入靶細(xì)胞內(nèi)，第一微環(huán)DNA基因載體可以表達(dá)前基因組RNA，第二微環(huán)DNA基因載體可以表達(dá)組裝蛋白，將前基因組RNA組裝形成可以表達(dá)所述治療性轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物并具有侵染性的重組病毒。重組病毒可以穿過體內(nèi)的大部分微血管床屏障，例如肝竇狀隙內(nèi)皮細(xì)胞孔，從而可以順利的感染新的易感細(xì)胞，具有較高的投遞效率。本發(fā)明還提供上述微環(huán)DNA基因載體組合物的應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N15/63GK102978226SQ20111026113
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日 公開號(hào)201110261136.發(fā)明者陳志英, 何成宜 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院