專利名稱：用于指導鉑類藥物個體化治療的基因組合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，涉及一組用于指導鉬類藥物個體化治療的基因組合。
背景技術(shù)：
鉬類化療藥物(順鉬、卡鉬、奧沙利鉬等)是腫瘤化療領(lǐng)域的最常用藥物之一，其抗癌活性是通過在DNA雙鏈上形成共價交聯(lián)，并與DNA綁定形成鉬-DNA加合物，從而引起一系列細胞內(nèi)事件的發(fā)生，最終導致腫瘤細胞死亡。然而部分腫瘤細胞對鉬類藥物的敏感性差是導致化療失敗，病情進展的主要原因。因此，臨床醫(yī)生在使用鉬類藥物前，迫切需要一份對療效、耐藥性及預后具有前瞻性指導意義的信息。GSTPl屬于多功能II相代謝酶家族，能催化谷胱甘肽與多種毒性復合物(包括鉬類制劑)結(jié)合，形成低毒高水溶性物質(zhì)排出細胞外，達到促進藥物排泄而降低抗癌效果的作用。GSTPl外顯子5的第313位堿基存在A/G單核苷酸多態(tài)，導致其編碼的氨基酸發(fā)生 Ile-Val改變，顯著降低GSTPl的活性，從而使化療藥的清除率降低和藥物對腫瘤作用的時間延長。MRP2 :MRP2 (ABCC2)屬于多藥耐藥相關(guān)蛋白(multidrug resistance associated proteins, MRPs)家族，MRPs定位于細胞膜，是一類能量依賴性轉(zhuǎn)運蛋白，主要轉(zhuǎn)運疏水性、 不帶電荷分子或水溶性陰離子化合物。已經(jīng)證實MRP2與鉬類藥物的耐藥有關(guān)。MRP2表達增強時，順鉬-DNA復合物的形成減少，C2阻滯減少，細胞對鉬類的耐藥性增強；而當SNP導致MRP2發(fā)生氨基酸替換時，這一作用減弱，細胞對鉬類敏感性增強。另有研究表明，MRP2可能通過促進GSH結(jié)合的鉬離子排出細胞外，來增強腫瘤細胞對鉬類的耐藥性。MRP第10外顯子(G1249A)的突變使MRP2的功能降低，從而增加腫瘤患者對鉬類藥物的敏感性。XRCCl XRCCl (X-ray repair cross-complementing gene 1)是堿基切除修復系統(tǒng)(BER)和單鏈斷裂修復系統(tǒng)(ssBR)中的重要成分，參與順鉬或卡鉬引起的DNA損傷修復過程，其進化保守區(qū)有SNP，導致其編碼區(qū)密碼子194和399的取代改變，從而影響XRCCl蛋白的正常功能，改變DNA的修復能力。多項研究表明，在XRCCl Argl94Trp基因表達中，攜帶至少1個194Trp 等位基因患者化療有效率是攜帶野生基因型Arg/Arg患者的3倍；攜帶XRCCl 399Arg/Arg 基因型患者治療的有效率是Arg/Gln或Gln/Gln基因型者的2. 7倍；在聯(lián)合基因型中，既攜帶194 Arg/Trp又攜帶399 Arg/Arg基因型患者化療有效率進一步提高。ERCCl :ERCC1 (excision repair cross-complementation group 1)是核苷酸切除修復途徑的限速酶，在核酸損傷修復過程和凋亡過程中起著重要作用。ERCCl基因的表達產(chǎn)物與DNA修復酶缺乏互補基因F(XPF)形成緊密的異二聚體(ERCC1-XPF)，該二聚體具有識別損傷和5’端切除的雙重作用，在核苷酸切除修復中起到限速或調(diào)節(jié)的重要作用。ERCCl 的表達量直接影響DNA修復的生理過程。所有腫瘤細胞中都有ERCCl表達，而且表達水平差異很大。核苷酸切除修復(nucleotide excision repair, NER)是鉬類藥物耐藥的重要機制之一。臨床研究已證實ERCCl參與鉬類化療耐藥發(fā)生，其表達水平與多種癌癥鉬類化療療效和生存期呈負相關(guān)，既表達水平低的患者對鉬類藥物敏感，表達水平高的患者表現(xiàn)耐藥。ERCCl基因中118位密碼子CC野生型對鉬類藥物化療反應(yīng)性較好，有較好的預后。 ERCC1TT突變型會導致ERCCl蛋白表達水平增高，增強修復順鉬對DNA的損傷的能力，因此突變患者對鉬類藥物耐藥。ERCC2 著色性干皮病基因D (XPD) /切除修復交叉互補基因2 (ERCC2)是參與受損 DNA核苷酸切除修復(NER)過程的一種重要的酶，其活性直接影響鉬類藥物的化療效果。 ERCC2存在多個單核苷酸多態(tài)性(SNP)，312Asp/Asn和751Lys/Gln多態(tài)性比較常見。最常見的為第751位密碼子由賴氨酸(Lys)變?yōu)楣劝滨０?Gln)，此多態(tài)性影響奧沙利鉬(L-OHP) 的治療效果。研究顯示，C/C基因型病人緩解率明顯比C/A和A/A基因型病人高，C/C基因型病人對鉬類藥物敏感性更好。藥物代謝和效應(yīng)的個體化差異臨床上，由于個體基因型差異，患者對藥物敏感性的差異顯著。因此，在對腫瘤患者進行治療時，如果先對其相關(guān)基因位點進行檢測，再根據(jù)其基因突變情況用藥，以達到在正確的時間，給正確的患者，實施正確的個體優(yōu)化治療。通過檢測病人腫瘤組織中的 GSTPl，MRP2, XRCCl-Exon6, XRCCl-Exon 10, ERCCl，ERCC2 基因位點的突變情況，對擬采用鉬類藥物治療的病人進行藥物敏感性指導，可以使療效達到最大， 副作用降到最低?，F(xiàn)有臨床用藥方法的缺陷大量研究表明，由于個體基因型差異，患者對藥物敏感性的差異顯著。如醫(yī)生在用藥時未做藥物的靶標檢測，則可能導致用藥無(微)效、延誤最佳治療時機、毒副作用等現(xiàn)象發(fā)生。本發(fā)明的有益之處是(1)本發(fā)明的篩選方法是一種對人體無害的檢測方法；(2) 本發(fā)明通過檢測病人腫瘤組織中的 GSTPl，MRP2，XRCCl-Exon6，XRCCl-Exon 10，ERCCl，ERCC2 基因位點的突變情況，對擬采用鉬類藥物治療的病人進行藥物敏感指導，可以使療效達到最大，副作用降到最低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對目前腫瘤的治療過程中，鉬類藥物的療效在不同病人間的明顯差異，提供一種方便、快捷的輔助臨床醫(yī)生制定個體化用藥方案的基因組合及其應(yīng)用方法。本發(fā)明的目的是提供一組用于指導鉬類藥物個體化治療的基因組合，包括: GSTP1，MRP2, XRCCl-Exon6, XRCCl-Exon 10，ERCCl，ERCC2 基因。本發(fā)明的另一個目的是提供該基因組合在指導鉬類藥物個體化治療中的應(yīng)用。基于上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案針對上述基因的特異性位點設(shè)計引物，各基因引物序列如表1所示。表 權(quán)利要求
1.一組用于指導鉬類藥物個體化治療的基因組合，其特征在于該基因組合包含 GSTP1，MRP2, XRCCl-Exon6, XRCCl-Exon 10，ERCCl，ERCC2 基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因組合，其特征在于針對GSTPl位點設(shè)計的正向引物序列為CTGCTGTGTGGCAGTCTCTC(SEQ ID No. 1)，反向引物序列為CCGTTACTTGGCTGGTTGAT(SEQ ID No. 2)；針對MRP2位點設(shè)計的正向引物序列為GGGCAAAGAAGTGTGTGGAT (SEQ ID No. 3)，反向引物序列為AGGGTCCCAACTCTCTCCAT (SEQ ID No. 4)；針對 XRCCl_Exon6 位點設(shè)計的正向引物序列為:ATACTGACCTTGCGGGACCT (SEQ ID No. 5)，反向引物序列為 CAGCCTCCAGACCTCTCAAC(SEQ ID NO. 6)；針對 XRCCl-ExonlO 位點設(shè)計的正向引物序列為 TCCACTATGCTGCATGCTTT (SEQ ID No. 7)，反向引物序列為ATTGCCCAGCACAGGATAAG(SEQ ID NO. 8)；針對ERCCl位點設(shè)計的正向引物序列為TGAGCCAATTCAGCCACT (SEQ ID No. 9)，反向引物序列為TAGTTCCTCAGTTTCCCG(SEQ ID NO. 10)；針對ERCC2位點設(shè)計的正向引物序列為GATGGCCCGCTCTGGATT (SEQ ID No. 11)，反向引物序列為CCTGCGATTAAAGGCTGTGG (SEQ ID NO. 12)。
3.如權(quán)利要求2所述的引物序列在檢測其相應(yīng)的基因突變中的應(yīng)用。4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于檢測方法如下4. 1提取病人待測腫瘤組織基因組DNA ；
4.2以待測腫瘤組織基因組DNA為模板，用權(quán)利要求2所述的擴增引物進行PCR擴增；4. 3PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳分析；4.4PCR擴增產(chǎn)物測序。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4.2中PCR反應(yīng)體系每20 μ 1組成如下待測病人腫瘤組織基因組DNA 50 100ng，Taq酶0. 125 μ 1，上下游引物(10 μ Μ)各 1μ 1，dNTP (2. 5πιΜ)2μ 1，10XPCR 緩沖液(含 Mg2+) 2 μ 1，余下為無菌蒸餾水。
6.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4.2中用于檢測GSTPl的PCR擴增反應(yīng)條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸30sec，進行40個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
7.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4.2中用于檢測MRP2的PCR擴增反應(yīng)條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，64°C退火30sec，72°C延伸30sec，進行 40個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
8.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4.2中用于檢測XRCCl-EXOn6的 PCR擴增反應(yīng)條件是95°C預變性2min,隨后95°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸 30sec，進行40個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
9.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4.2中用于檢測XRCCl-ExonlO的 PCR擴增。反應(yīng)條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸 30sec，進行40個循環(huán)，最后72°C延伸7min，4°C保存。
10.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4.2中用于檢測ERCCl的PCR擴增反應(yīng)條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，58°C退火30sec，72°C延伸lmin，進行 40個循環(huán)，最后72°C延伸30seC，4°C保存。
11.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4.2中用于檢測ERCC2的PCR擴增反應(yīng)條件是95°C預變性2min，隨后95°C變性30sec，6(TC退火30sec，72°C延伸lmin，進行40個循環(huán)，最后72°C延伸30seC，4°C保存。
12.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟4. 4中測序PCR擴增的反應(yīng)條件為95°C預變性％iin，隨后95°C變性30sec，50°C退火15sec，進行35個循環(huán)，最后60°C延伸％iin，4°C保存。
全文摘要
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，提供一組用于指導鉑類藥物個體化治療的基因組合，包括GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2。本發(fā)明通過檢測病人腫瘤組織中的GSTP1，MRP2，XRCC1-Exon6，XRCC1-Exon10，ERCC1，ERCC2基因位點的突變情況，對擬采用鉑類藥物治療的病人進行藥物敏感指導，以使療效達到最大，副作用降到最低。
文檔編號C12N15/11GK102367438SQ20111026158
公開日2012年3月7日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者樓敬偉 申請人:上海寶藤生物醫(yī)藥科技有限公司