專利名稱：亞甲藍光化學法滅活hcv病毒效果的檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種病毒滅活檢測方法，尤其涉及一種PCR技術(shù)檢測評價亞甲藍光化學法滅活HCV病毒效果的方法。
背景技術(shù)：
輸血是臨床上治療和搶救病人常用的醫(yī)療措施。近年來，隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷進步，血液及血液制品的安全性越來越受到人們的重視。輸血安全不僅是輸血醫(yī)學和臨床治療學追求的期望目標，也是采供血機構(gòu)和醫(yī)療機構(gòu)乃至社會各界共同關(guān)注的熱點和極端敏感的永恒課題。目前，已知有多種病毒可經(jīng)血液傳播，如HIV1/2、HTLVI/II、肝炎病毒HBV和HCV、·HDV和HEV、HAV、非甲 戊肝炎病毒(HGV、TTV, SENV)、CMV和EBV、小病毒B19和新克雅氏病毒等等，都有可能引起輸血后病毒性傳染病，其中尤其以脂質(zhì)包膜病毒如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和艾滋病毒(HIV)危害最大。目前認為提高血液安全性的措施主要是(I)合理的選擇獻血員、(2)嚴格的病毒篩選、(3)有效的病毒滅活技術(shù)。盡管目前血液檢查水平在不斷的提高，但是由于檢查“窗口期”的存在、以及病毒變異導致免疫反應(yīng)性的改變、免疫靜默感染、新型病毒和亞型變異株的出現(xiàn)等仍使輸血時刻存在著風險。采用有效的血液病毒滅活技術(shù)是保證輸血安全的重要措施之一，也是從根本上解決輸血傳播病毒風險的有效方法，多年來國外傳統(tǒng)病毒滅活方法為巴斯德液體濕熱滅活法、有機溶劑/洗滌劑法、干熱法、膜過濾法、低PH值孵放法等等，巴斯德液體濕熱滅活法主要用于人血白蛋白制品，有機溶劑/洗滌劑法可用于混合血漿，干熱法用于凍干制品，膜過濾法只有濾膜孔徑比病毒有效直徑更小時才能有效去除病毒，而且不能單獨使用。上述方法處理難度大、費用高，不能廣泛應(yīng)用于臨床用單袋血漿(如100 ml,200 ml)的病毒滅活。由于目前全國各地血站供臨床使用的血漿均為單人份血漿，其可能內(nèi)含的脂質(zhì)包膜病毒，對人體健康有潛在危害，為了克服此危害，必須對脂質(zhì)包膜病毒滅活，大量實驗數(shù)據(jù)證明，用亞甲蘭光化學處理血漿可完全滅活血漿內(nèi)所含的VSV和Sindbis病毒(這兩種病毒是國內(nèi)外公認的血液制品病毒滅活有效性的指示病毒，其中VSV作為RNA質(zhì)包膜病毒的模型病毒，Sindbis作為HCV的模型病毒，均為RNA脂質(zhì)包膜病毒)。光化學法主要是依靠光敏劑在光照下產(chǎn)生的單線態(tài)氧或自由基氧化損傷病毒的分子結(jié)構(gòu)，從而殺滅病毒，各種光敏劑的作用特點不盡相同，如補骨脂內(nèi)酯衍生物主要產(chǎn)生自由基(一類機制)，酞菁類光敏劑主要產(chǎn)生單線態(tài)氧(二類機制)，而酚噻嗪類光敏劑可能同時涉及兩類機制，例如單線態(tài)氧和光敏劑介導的自由基可能都參與了亞甲蘭(MB)光化學處理對病毒的滅活。亞甲藍(Methylene Blue Photochemistry, MB)光化學滅活血衆(zhòng)病毒是一種最安全、有效的適合于臨床用單袋血漿病毒滅活的方法，被認為是非常有發(fā)展前景的臨床應(yīng)用單人份血漿病毒滅活方法，早在1966年P(guān)ohl和Mohl發(fā)表了使用亞甲藍和光照滅活病毒血漿的臨床經(jīng)驗，自1993年起已在德國、瑞士等多個歐洲國家紅十字會輸血中心使用，并收到良好的臨床效果，2001年亞甲藍滅活病毒方法在上海血液中心研制成功之后，國內(nèi)大部分血液中心和中心血站已開展此項目。由于病毒滅活技術(shù)受到多種因素的影響，因此建立有效的病毒滅活驗證方法、直接而客觀的評價病毒滅活的有效性是病毒滅活工作的重要組成部分，也是確保滅活效果達到預期要求、保障血液和血液制品安全性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前多采用體外培養(yǎng)的細胞病變法或動物模型法來判斷病毒滅活效果，體外培養(yǎng)方法對實驗條件有著嚴格的要求，對細胞培養(yǎng)、病毒保存有著嚴格規(guī)范，操作繁瑣、實驗周期長，不利于在基層單位開展，并且因其基于在體外觀察病毒靶細胞病變的原理而難以評價其靶細胞無法在體外培養(yǎng)的病毒(如肝炎病毒)的滅活效果；雖然動物模型方法從生物整體水平評價病毒感染性方面具有優(yōu)勢，但是價格昂貴、實驗周期長，只適用于研究開發(fā)階段實驗，而且對多數(shù)人類致病病毒缺乏敏感的模型動物，不適合在常規(guī)工作中開展，因此建立更簡便易行、更經(jīng)濟、更有效的評價指標已成為病毒滅活工作急需解決的問題。核酸檢測技術(shù)是以檢測樣本內(nèi)病毒核酸的有無或含量多少進行病原學診斷的一種方法，是繼形態(tài)學、生物化學和免疫學診斷之后的第四代診斷檢測技術(shù)，靈敏度高、特異 性強，能夠采用定量檢測的方法進行質(zhì)量監(jiān)控，具有準確性高、檢測成本低、耗時少的優(yōu)點，已被用作病毒感染的常規(guī)診斷方法，其中PCR檢測是眾多核酸檢測技術(shù)中的經(jīng)典方法，因其簡便快速的特點，很容易被基層檢驗單位及血站所接受。在病毒滅活有效性評價工作中，病毒滅活質(zhì)控品的建立是至關(guān)重要的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種檢測評價亞甲藍光化學法滅活HCV病毒效果的方法，以辛德畢斯(Sindbis Virus，SV)病毒為質(zhì)控品，利用PCR技術(shù)擴增SV病毒基因特定區(qū)域，檢測亞甲藍光化學滅活處理效果，從分子水平對亞甲藍光化學病毒滅活效果進行質(zhì)量評價。本發(fā)明亞甲藍光化學法滅活HCV病毒效果的檢測方法，步驟如下
步驟1，將SV病毒加熱去除生物活性，使SV病毒失去毒性，不能致人體細胞病變,并使SV病毒核酸載量保持IO9以上；以去除生物活性的SV病毒作為質(zhì)控品；
步驟2，在相同條件下對血液和質(zhì)控品進行亞甲藍光化學滅活，PCR檢測質(zhì)控品亞甲藍光化學滅活前后病毒核酸量的變化，判斷病毒滅活效果，質(zhì)控品核酸損傷效果即為HCV病毒核酸損傷效果，即病毒滅活效果。上述方法中，首先將SV病毒加熱去除生物活性，具體為在56 °C進行孵育，使其核酸載量保持IO9以上；孵育時間優(yōu)選為2小時。上述的方法中，所述PCR檢測可以是長鏈PCR技術(shù)、實時熒光定量PCR技術(shù)檢測、或其它已知PCR技術(shù)進行檢測。其中，所述PCR檢測方法為針對SV病毒復制酶編碼區(qū)設(shè)計引物，對滅活前后的病毒進行PCR檢測，具體為針對SV病毒基因7548 7566片段設(shè)計下游引物，針SV病毒基因7383 7400、6540 6558、4839 4856、3519 3537、中的任意片段設(shè)計上游引物，對SV病毒cDNA進行PCR擴增。優(yōu)選地，所述引物如下
引物I序列I片段位置
下游引物 5’ -CTCTGATGGCTTGGATGC-3’_7548^7566
I游引物 I 丨5’-GACGAGCAAGACGAAGAC-3，卜383~7400
權(quán)利要求
1.一種亞甲藍光化學法滅活HCV病毒效果的檢測方法，其特征在于，步驟如下 步驟1，將SV病毒加熱去除生物活性，使SV病毒失去毒性，不能至人體細胞病變，并使SV病毒核酸載量保持IO9以上；以去除生物活性的SV病毒作為質(zhì)控品； 步驟2，在相同條件下對血液和質(zhì)控品進行亞甲藍光化學滅活，PCR檢測質(zhì)控品亞甲藍光化學滅活前后病毒核酸量的變化，判斷病毒滅活效果，質(zhì)控品核酸損傷效果即為HCV病毒滅活效果。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述SV病毒加熱至56°C孵育，去除生物活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述SV病毒孵育時間為2小時。
4.根據(jù)上述任意一項權(quán)利要求所述的方法，其特征在于，所述PCR檢測為長鏈PCR檢測或熒光定量PCR檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR檢測方法為針對SV病毒基因7548 7566片段設(shè)計下游引物，針SV病毒基因7383 7400、6540 6558、4839 4856、3519 3537中的任意片段設(shè)計上游引物，對SV病毒cDNA進行PCR擴增。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述下游引物如下5’ -CTCTGATGGCTTGGATGC-3’。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，針對7383 7400片段設(shè)計的上游藥物為5， -GACGAGCAAGACGAAGAC-3，。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，針對654(T6558片段設(shè)計的上游藥物為5， -AGACTGAAAGGCCCTAAGG-3，。
9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，針對4839 4856片段設(shè)計的上游藥物為5， -TGCCCGGTCGACCATAAC-3，。
10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，針對3519 3537片段設(shè)計的上游藥物為·5， -AACCGCAATCTTCCTCACG-3，。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于檢測評價亞甲藍光化學法病毒滅活效果的方法，以去除生物活性的SV病毒為質(zhì)控品，在相同條件下對質(zhì)控品和需要進行病毒滅活的血液或血液制品在相同條件下進行亞甲藍光化學病毒滅活。該方法對人體沒有病毒感染風險，可通過質(zhì)控品核酸損傷的程度反映HCV病毒感染性消失的情況。
文檔編號C12Q1/70GK102978294SQ20111026191
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者鄭嵐, 張博, 王迅, 黃宇聞, 莫琴, 錢開誠 申請人:上海市血液中心