專利名稱：一種酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種酸性P -葡聚糖酶P-Bglul6A及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
￠-葡聚糖是谷物類植物細胞壁的主要成分，在大麥、燕麥、小麥、水稻胚乳細胞壁中含量尤為豐富(Buliga et al. Carbohydr Res 1986,157:139-156)。3 -葡聚糖是由1200個以上吡喃型D-葡萄糖殘基以￠-1,4和1，3-糖苷鍵連接形成線型分子。￠-葡聚糖獨特的分子結(jié)構(gòu)使其能以高分子量的形式溶于水，且溶液粘度很高，給工業(yè)生產(chǎn)帶來諸多不便。如￠-葡聚糖在消化道中吸水膨脹黏連，使其成為限制麥類飼料營養(yǎng)成分有效利用的主要抗?fàn)I養(yǎng)因子。高分子量的大麥￠-葡聚糖可引起麥汁和啤酒粘度增加，致使麥汁過濾困難、得率降低，啤酒非生物性渾濁，影響啤酒的穩(wěn)定性和質(zhì)量。^ -葡聚糖酶可以將P -葡聚糖水解成為較小的聚合物，消除P -葡聚糖造成的負面影響，是飼料工業(yè)和啤酒行業(yè)中廣泛使用的一種酶。根據(jù)酶作用底物糖苷鍵的類型和機制，可將￠-葡聚糖酶分為0-1，3 (4)-葡聚 糖酶(EC 3.2. 1.6)、￠-1,4-葡聚糖酶(纖維素酶，EC 3. 2. 1.4), 3-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3. 2. I. 39), 3-1，3-1，4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3. 2. I. 73)等(McCarthy et al. Int J Biol Macromol. 2003,33 141-148 ；Boyce and Walsh. Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 76 :835-8412007)?！?葡聚糖酶廣泛的存在于植物和微生物中。微生物￠-葡聚糖酶因其具有活力高、成本低、來源穩(wěn)定、提取方便等優(yōu)點而成為3 -葡聚糖酶的重要來源?，F(xiàn)在人們主要從細菌如枯草芽孢桿菌或真菌如黑曲霉、木霉等微生物中提取3 -葡聚糖酶，而天然菌株產(chǎn)葡聚糖酶的量較低是限制其工業(yè)化生產(chǎn)的一個重要因素。1983年愛爾蘭學(xué)者首先從枯草芽抱桿菌中克隆到葡聚糖酶基因(Cantwell and McConnell, gene. 198323(2)211-219)。隨后，人們從許多微生物中克隆得到了 ￠-葡聚糖酶基因，并進行序列分析和異源表達。根據(jù)氨基酸序列的相似性，0-葡聚糖酶多屬于糖苷水解酶第1、5、7、9、12、16和45家族。第16家族的P -葡聚糖酶多來源于細菌，而真菌16家族P -葡聚糖酶則報道的很少。^ -葡聚糖酶是最早的應(yīng)用于飼料工業(yè)的酶類，主要來自芽孢桿菌的16家族 葡聚糖酶，其作用PH為中性限制了其在飼料中的應(yīng)用效果。飼料用￠-葡聚糖酶的作
用環(huán)境是動物的胃腸道，單胃動物的胃呈酸性，PH值在2. 0 3. 5。這就要求優(yōu)良的飼料用^ -葡聚糖酶的最適pH為酸性，而且在pH2. 0到6. 5這一范圍內(nèi)均能維持高活性，這樣酶的作用時間最長，能最高地發(fā)揮其效率。另外，動物胃腸道中分泌胃蛋白酶、胰蛋白酶等多種蛋白酶以消化食物，￠-葡聚糖酶本身就是一種蛋白質(zhì)，也有可能被這些蛋白酶降解而失去活性，這就要求飼料用￠-葡聚糖酶必需對動物胃腸道中的蛋白酶有一定的抗性。挖掘分離酸性、高比活、抗蛋白酶的性質(zhì)優(yōu)良的葡聚糖酶和葡聚糖酶基因，并實現(xiàn)葡聚糖酶的高效表達，仍然是提高3 -葡聚糖酶飼用效果、提高產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本的關(guān)鍵。
本發(fā)明從云南錫礦的酸性廢水中分離的Penicillium sp. WNl菌株中得到了一個新的￠-葡聚糖酶基因，編碼的￠-葡聚糖酶具有在酸性及偏中性的PH范圍有高活性及穩(wěn)定性、高比活、強的蛋白酶抗性、良好的熱穩(wěn)定性、容易發(fā)酵生產(chǎn)等特點。所有這些優(yōu)點都意味著本發(fā)明的新的￠-葡聚糖酶在飼料及食品等行業(yè)，與現(xiàn)有￠-葡聚糖酶相比，將會更有應(yīng)用價值。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種酸性P -葡聚糖酶P_Bglul6A。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述酸性￠-葡聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述酸性￠-葡聚糖酶基因的重組載體。
本發(fā)明的另一目的是提供包含上述酸性￠-葡聚糖酶的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供制備上述酸性￠-葡聚糖酶的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述酸性￠-葡聚糖酶的應(yīng)用。本發(fā)明分離篩選出一種生產(chǎn)上述酸性￠ -葡聚糖酶P_Bglul6A的青霉WNKPenicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 5131。本發(fā)明提供了一種P -葡聚糖酶P_Bglul6A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示RPSTLLQLA ALAGLSSAQT YTLYDDYPTG MDFFSKFSFFTVffVLFRDTD PTNGYVDYVN 60ENTAESAGLI YASGNATYVG VDSSNVASGS GRQSVRLTST ASYTHGLFVLDLAHMPGSVC120GSffPAFffTVG SNWPNNGEID IIEGVNQQSA NAMTLHTSEG CTINDSGFSGSLSTSNCffTE180APGQSNNAGC GIDATSSATY ⑶GFNSAGGG IYAMEWTCDY IQVFEFTHDSAPADLTSGSP240NPSTffGEPAA YFA⑶CDIDS HFTANQIVFD ITFCGDffAGN VffSSGTCSSLASTCNDYVQN300NPSAFSETYff LINSLKVYSS 320其中，該酶全長320個氨基酸和一個終止密碼子，N端18個氨基酸為其預(yù)測的信號肽序列 “MRPSTLLQLA ALAGLSSA”。因此，成熟的0 -葡聚糖酶P_Bglul6A的理論分子量為32. 4kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 QTYTLYDDYP TGMDFFSKFS FFTVffVLFRD TDPTNGYVDYVNENTAESAG LIYASGNATY 60VGVDSSNVAS GSGRQSVRLT STASYTHGLF VLDLAHMPGSVCGSffPAFffT VGSNWPNNGE 120IDIIEGVNQQ SANAMTLHTS EGCTINDSGF SGSLSTSNCff TEAPGQSNNAGCGIDATSSA180
TYGDGFNSAG GGIYAMEWTG DYIQVFEFTH DSAPADLTSG SPNPSTWGEPAAYFAGDCDI240DSHFTANQIV FDITFCGDWA GNVWSSGTCS SLASTCNDYV QNNPSAFSETYWLINSLKVY300SS302該酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A作用pH范圍廣，低于pH 7. 0時表現(xiàn)出水解活性，最適pH為5.0。在pH 4.0到5.5之間，酶活能達到最高酶活的70%以上，在pH3. 5到6. 0之間，酶活能達到最高酶活的40%以上；該酶最適作用溫度50-55°C。這種性質(zhì)的￠-葡聚糖酶未曾有過報道。
·
本發(fā)明提供了編碼上述￠-葡聚糖酶的基因p_bglul6A。該酶的全基因序列如SEQID NO. 3 所示atgcgtcctt cgactctcct tcaactggct gcgctcgccg gcttgagcag tgctcaaacc60tacactttgt acgacgacta cccaactggg atggacttct tctccaagtt cagctttttc120actgtatggg tgctcttccg cgtgtgtcat ctcaaatgag ctaacatttc ttctttcttc180aggataccga tcccaccaat ggctacgtcg attatgtcaa tgagaacact gccgaaagtg240ctggattgat atatgcgagt ggcaatgcta cttatgttgg tgttgattct tcaaatgtag300cctccggcag tggtcgtcag agcgtgcgtc tgaccagcac cgcttcttac acccatggct360tgttcgttct tgatctggct cacatgccag gttccgtttg tggttcttgg cctgccttgt420aagtcttccg aaaattgtga ggtagaatga tagatactaa tatctattag ctggaccgtt480ggaagcaact ggccgaacaa cggcgaaatc gatatcatcg aaggagtcaa tcagcaaagc540gccaatgcca tgaccctgca caccagcgag ggctgcacca tcaacgattc cggctttagt600ggttccctat cgacgagcaa ctgctggacc gaagccccag gccagagtaa caacgccggc660tgcggtattg atgcgacttc ctctgccacg tacggagatg gattcaacag cgccggtggc720ggcatctacg ctatggaatg gacaggcgac tacattcaag tctttgaatt cacccacgac780agcgctccgg ctgatctcac ttctggtagc cctaacccaa gtacctgggg cgaacctgcg840gcttactttg ctggtgactg cgatattgac tctcacttta ccgccaacca gatcgtacgt900taccccctac agtcatactt gtctagaaaa caattaacta atcatgtcca ggtctttgat960atcactttct gcggtgactg ggctggcaat gtttggagct caggtacctg ctccagcctg1020gctagtactt gcaatgacta cgtccagaac aacccttctg ccttttccga gacttattgg1080ctcatcaact ctctcaaggt ctactcaagc tag1113本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了這一酸性P -葡聚糖酶基p_bglul6A，DNA全序列分析結(jié)果表明，0 -葡聚糖酶P-Bglul6A的結(jié)構(gòu)基因全長1，113bp，含有3個內(nèi)含子，143-184bp，419-470bp，897-953bp 為其內(nèi)含子序列，cDNA 長 963bp，其 cDNA 序列如 SEQ IDNO. 4所示atgcgtcctt cgactctcct tcaactggct gcgctcgccg gcttgagcag tgctcaaacc60tacactttgt acgacgacta cccaactggg atggacttct tctccaagtt cagctttttc120actgtatggg tgctcttccg cgataccgat cccaccaatg gctacgtcga ttatgtcaat180gagaacactg ccgaaagtgc tggattgata tatgcgagtg gcaatgctac ttatgttggt240gttgattctt caaatgtagc ctccggcagt ggtcgtcaga gcgtgcgtct gaccagcacc300
gcttcttaca cccatggctt gttcgttctt gatctggctc acatgccagg ttccgtttgt 360ggttcttggc ctgccttctg gaccgttgga agcaactggc cgaacaacgg cgaaatcgat 420atcatcgaag gagtcaatca gcaaagcgcc aatgccatga ccctgcacac cagcgagggc 480tgcaccatca acgattccgg ctttagtggt tccctatcga cgagcaactg ctggaccgaa 540gccccaggcc agagtaacaa cgccggctgc ggtattgatg cgacttcctc tgccacgtac 600ggagatggat tcaacagcgc cggtggcggc atctacgcta tggaatggac aggcgactac 660attcaagtct ttgaattcac ccacgacagc gctccggctg atctcacttc tggtagccct 720·aacccaagta cctggggcga acctgcggct tactttgctg gtgactgcga tattgactct 780cactttaccg ccaaccagat cgtctttgat atcactttct gcggtgactg ggctggcaat 840gtttggagct caggtacctg ctccagcctg gctagtactt gcaatgacta cgtccagaac 900aacccttctg ccttttccga gacttattgg ctcatcaact ctctcaaggt ctactcaagc 960tag963其中，信號肽的堿基序列為“atgcgtccttcgactctcct tcaactggct gcgctcgccggcttgagcagtgct ”，所以編碼成熟P -葡聚糖酶P_Bglul6A蛋白的核苷酸序列全長909bp，如SEQ IDN0. 5 所示caaacctaca ctttgtacga cgactaccca actgggatgg acttcttctc caagttcagc 60tttttcactg tatgggtgct cttccgcgat accgatccca ccaatggcta cgtcgattat 120gtcaatgaga acactgccga aagtgctgga ttgatatatg cgagtggcaa tgctacttat 180gttggtgttg attcttcaaa tgtagcctcc ggcagtggtc gtcagagcgt gcgtctgacc 240agcaccgctt cttacaccca tggcttgttc gttcttgatc tggctcacat gccaggttcc 300gtttgtggtt cttggcctgc cttctggacc gttggaagca actggccgaa caacggcgaa 360atcgatatca tcgaaggagt caatcagcaa agcgccaatg ccatgaccct gcacaccagc 420gagggctgca ccatcaacga ttccggcttt agtggttccc tatcgacgag caactgctgg 480accgaagccc caggccagag taacaacgcc ggctgcggta ttgatgcgac ttcctctgcc 540acgtacggag atggattcaa cagcgccggt ggcggcatct acgctatgga atggacaggc 600gactacattc aagtctttga attcacccac gacagcgctc cggctgatct cacttctggt 660agccctaacc caagtacctg gggcgaacct gcggcttact ttgctggtga ctgcgatatt 720gactctcact ttaccgccaa ccagatcgtc tttgatatca ctttctgcgg tgactgggct 780ggcaatgttt ggagctcagg tacctgctcc agcctggcta gtacttgcaa tgactacgtc 840cagaacaacc cttctgcctt ttccgagact tattggctca tcaactctct caaggtctac 900tcaagctag909本發(fā)明還提供了包含上述￠-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重組載體，優(yōu)選為pPIC9-p_bglul6A。將本發(fā)明的P -葡聚糖酶基因p_bglul6A插入到表達載體合適的限制性酶切位點之間，使其核苷酸序列可操作的與表達調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個最優(yōu)選的實施方案，優(yōu)選為將3 -葡聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的SnaB I和NotI限制性酶切位點之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達質(zhì)粒。本發(fā)明還提供了包含上述￠-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重組菌株，優(yōu)選為畢赤酵母重組菌株。
本發(fā)明還提供了一種制備P -葡聚糖酶P-Bglul6A的方法，包括以下步驟I)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組P -葡聚糖酶P_Bglul6A的表達；以及3)回收并純化所表達的￠-葡聚糖酶P_Bglul6A。其中，所述宿主細胞為畢赤酵母細胞、啤酒酵母細胞或絲狀真菌細胞，優(yōu)選將重組酵母表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細胞Pichic pastoris,得到重組菌株。本發(fā)明還提供了上述￠-葡聚糖酶P-Bglul6A的應(yīng)用，優(yōu)選該酶在水解￠-葡聚糖以及其在飼料、食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一個新的￠-葡聚糖酶基因p-bglul6A，其編碼的P -葡聚糖酶P_Bglul6A具有高比活性，作用pH范圍廣(pH3. 5-6. 0)，良好的PH穩(wěn)定性和耐熱性，可應(yīng)用于飼料、釀造、釀酒、烘培等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)￠-葡聚糖酶。


圖I重組0 -葡聚糖酶P-Bglul6A的SDS-PAGE分析,M :低分子量蛋白質(zhì)Marker ；I :純化的￠-葡聚糖酶。圖2 P -葡聚糖酶P_Bglul6A的最適pH。圖3 P -葡聚糖酶P_Bglul6A的pH穩(wěn)定性。圖4P -葡聚糖酶P_Bglul6A作用的最適溫度。圖5 P -葡聚糖酶P_Bglul6A的熱穩(wěn)定性。本發(fā)明分離篩選出一種生產(chǎn)上述酸性P -葡聚糖酶P_Bglul6A的青霉WNKPenicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 5131。
具體實施例方式實驗材料及一般實驗方法I、菌株及載體大腸桿菌菌株(Escherichia coli) JM109、載體自全式金公司；畢赤酵母菌株(Pichia pastoris)GS115及pPIC9質(zhì)粒購自invitrogen公司。2、酶類及其它生化試劑工具酶包括限制性內(nèi)切酶、DNA連接酶、Taq酶購自TakaRa公司，DNA提取、純化、凝膠回收試劑盒購自天根生化公司，RNA提取試劑盒購自Promega公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自東洋紡公司(ReverTra Ace, T0Y0B0)。大麥葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基Penicillium sp. WNl 產(chǎn) P -葡聚糖酶誘導(dǎo)選擇培養(yǎng)基0. 2% MgSO4 7H20，0. I %KH2PO4,0. 1% CuSO4 5H20，0. 1% CaCl2,0. 5%蛋白胨，1%玉米芯粉，1%麩皮，pH5. O。標(biāo)準的分子操作技術(shù)如DNA提取、RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、凝膠電泳、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、酵母轉(zhuǎn)化均使用標(biāo)準技術(shù)(Sambrook 等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第3 版 2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression A Laboratory Manual(1990)；invitrogen酵母操作手冊)進行 。實施例I青霉Penicillium sp. WNl菌株的基因組DNA的分離本發(fā)明從云南錫礦的酸性廢水中分離的真菌WN1。根據(jù)形態(tài)及ITS序列鑒定為Penicillium屬，命名為WNl (Penicillium sp.)。該菌株于2011年8月11日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號為CGMCC No. 5131。將青霉WNl經(jīng)馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)后，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中((NH4)2SO4 5g/L，KH2PO4 lg/L, MgSO4 7H20 0. 5g/L, FeSO4 7H20 0. Olg/L, CaCl2 0. 2g/L,玉米芯粉 I %，麩皮1%，1.5%瓊脂糖，pH5.0)平板上，30°C培養(yǎng)5 6d，測定其產(chǎn)￠-葡聚糖酶的活性。經(jīng)測定該菌為高產(chǎn)￠-葡聚糖酶菌株。將馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，采用CTAB方法提取基因組DNA (Sambrook等人，Molecular Cloning, A Laboratory Manual (第 3 版 2001))。實施例2青霉Penicillium sp. WNl P -葡聚糖酶編碼基因的克隆根據(jù)糖苷水解酶第16家族P -葡聚糖酶的保守序列(CGTWPA和FCGDWAG)設(shè)計合成了簡并引物 GH16F :TGCGGTAYNTGGCCNGC 和 GH16R :CCGGCCCANTBNCCRCARAA，其中Y = C/T, R = A/G, B = G/C/T, N = A/T/G/C以Penicillium sp. WNl基因組DNA為模板，GH16F和GH16R為引物進行PCR擴增。PCR 反應(yīng)參數(shù)為95°C、5min ;94°C、30sec，49°C、30sec，72°C、lmin，30 個循環(huán)后；72°C、10min，4°C保溫。瓊脂糖電泳檢測。得到的長約580bp的片段，經(jīng)回收后與pEASY_T3載體相連并測序。得到保守區(qū)核苷酸序列588bp。為了得到編碼基因全長序列，根據(jù)測序得到的保守區(qū)核苷酸序列，利用TAIL-PCR擴增保守區(qū)兩側(cè)的序列。TAIL-PCR特異引物序列見表I。表I. 0 -葡聚糖酶基因p_bglul6A TAIL-PCR特異性引物
引物
引物
權(quán)利要求
1.一種酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2 所示。
2.—種酸性￠-葡聚糖酶基因p_bglul6A，其特征在于，編碼權(quán)利要求I所述的￠-葡聚糖酶 P_Bglul6A。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的酸性￠-葡聚糖酶基因p-bglul6A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3、4或5所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述酸性P-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9-p-bglul6A。
6.包含權(quán)利要求2或3所述P-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母。
8.一種制備酸性￠-葡聚糖酶P-Bglul6A的方法，其特征在于，包括以下步驟 1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細胞，得重組菌株； 2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A的表達；以及 3)回收并純化所表達的酸性P-葡聚糖酶P_Bglul6A。
9.權(quán)利要求I所述酸性P-葡聚糖酶P_Bglul6A的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新的酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A，其具有如SEQID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3、4或5所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A作用pH范圍廣(pH3.5-6.0)，最適pH5.0，最適溫度50-55℃，在酸性條件下具有良好的穩(wěn)定性和耐熱性，可應(yīng)用于飼料、釀造、釀酒、烘培等工業(yè)。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案可以實現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)β-葡聚糖酶。
文檔編號C12R1/80GK102978183SQ20111026259
公開日2013年3月20日 申請日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月6日
發(fā)明者張健康, 張王照, 朱世琴, 邵娜, 姜小偉, 董玲麗 申請人:北京衛(wèi)諾恩生物科技有限公司