專利名稱：一種利用激流式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的工藝過程及控制方法
一種利用激流式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的工藝過程及控制方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于細(xì)胞工程技術(shù)，涉及動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)及生產(chǎn)重組蛋白藥物的工藝，具體涉及動(dòng)物細(xì)胞無血清高密度，高表達(dá)懸浮培養(yǎng)工藝過程控制方法。
背景技術(shù)：
動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)已成為生物制藥領(lǐng)域最重要的關(guān)鍵技術(shù)之一，并隨著重組治療性蛋白類藥物的廣泛應(yīng)用而迅速發(fā)展。目前工業(yè)化生產(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)重組蛋白治療藥物的主要方法是通過生物反應(yīng)器，在體外大規(guī)模高密度培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞、工程細(xì)胞、昆蟲細(xì)胞和微生物等，再通過相關(guān)的純化手段制備重組蛋白產(chǎn)品。
用于細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的生物反應(yīng)器有攪拌式生物反應(yīng)器，氣升式生物反應(yīng)器，中空纖維生物反應(yīng)器，固定床式生物反應(yīng)器，旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器，一次性生物反應(yīng)器。[SINGH Vijay. Disposable bioreactor for cell cumture using wave-1nduced agitation[J].Cytotechnology, 1999,30 :149-158. ] [2]SlivacI, Srcek V G, Ra(jo§ evic K, Kmetic I and Kniewald Z 2006Aujeszky’ sdisease virus production in disposable bioreact or[JJ.Biosc1. 31 :363-368.]攪拌式生物反應(yīng)器的最大優(yōu)點(diǎn)是能培養(yǎng)各種類型的動(dòng)物細(xì)胞，培養(yǎng)工藝容易放大，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，適合于工業(yè)化生產(chǎn)，在生物制品開發(fā)中潛力很大。但這種生物反應(yīng)器也有不足之處，即機(jī)械攪拌會(huì)產(chǎn)生高剪切力，對(duì)細(xì)胞造成某種程度上的損傷。氣升式生物反應(yīng)器能在通氣的同時(shí)，利用其獨(dú)特的回路循環(huán)裝置使液相達(dá)到循環(huán)。最常見的為管道或板柱內(nèi)循環(huán)氣升式生物反應(yīng)器。外循環(huán)氣升式反應(yīng)器，將下降管置于反應(yīng)器外部，可用于高細(xì)胞濃度灌注培養(yǎng)。缺點(diǎn)相對(duì)來說較少，主要是高密度培養(yǎng)時(shí)混合不夠均勻。中空纖維生物反應(yīng)器的主要組成部分是一充滿培養(yǎng)液的閉合管道，管道中插入半通透性的中空纖維。中空纖維為培養(yǎng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并運(yùn)走代謝廢物。但是細(xì)胞密度過高會(huì)妨礙氧的擴(kuò)散，使細(xì)胞的得氧量不同。同時(shí)，此反應(yīng)器中還存在著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物的濃度差，這就導(dǎo)致了細(xì)胞生長(zhǎng)的不均一性。[李寶香，郭德倫，張瑩三維細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)及相關(guān)儀器的進(jìn)展和應(yīng)用]填充床生物反應(yīng)器中填充了某種材料，作為固定細(xì)胞的載體，填料顆粒堆疊成床。培養(yǎng)液可以在床層中流動(dòng)。它沒有機(jī)械攪拌和氣泡，所以剪切力小，適合細(xì)胞培養(yǎng)。但該反應(yīng)器的最大缺點(diǎn)是混合效果差，傳質(zhì)、傳氧效率低。[動(dòng)植物細(xì)胞培養(yǎng)生物反應(yīng)器的研究進(jìn)展王志江，鄭裕國(guó)旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器(RCCS)主要由控制裝置和培養(yǎng)容器兩部分組成。培養(yǎng)容器主要由內(nèi)外兩個(gè)圓筒組成，內(nèi)、外筒可相對(duì)獨(dú)立地旋轉(zhuǎn)。 整個(gè)容器由電機(jī)驅(qū)動(dòng)沿水平軸旋轉(zhuǎn)，細(xì)胞顆粒在水平軸內(nèi)建立均質(zhì)的液體懸浮軌道。由于該系統(tǒng)無推進(jìn)器、空氣升液器、氣泡或攪拌器，細(xì)胞顆粒不與容器壁或任何其它易致傷的物體相碰，故幾乎沒有破壞性的剪切力。普通生物反應(yīng)器由于通過攪拌保持細(xì)胞的懸浮而產(chǎn)生的剪切力破壞了細(xì)胞間和細(xì)胞與基質(zhì)問的穩(wěn)定，使組織和細(xì)胞集中于自身的修復(fù)，而大大影響其生長(zhǎng)和其它的正常生理功能。由于有很好的物質(zhì)交換功能，細(xì)胞在RCCS中能以很高的密度生長(zhǎng)，其細(xì)胞的培養(yǎng)密度可達(dá)到108，故可快速大規(guī)模地培養(yǎng)細(xì)胞。此外，這種培養(yǎng)能提供本能的分化、高細(xì)胞增殖、低的細(xì)胞死亡率和增加細(xì)胞產(chǎn)物的分泌。[Fang A, Pierson D L. Mishra SK. etal. Growth of Streptomyces hygroscopicusinrotating wall bioreactor under simulated microgravity inhibits rapamycin production[J]. Appl Microbiol Biotecknol. 2000,54 :33.] 一次性生物反應(yīng)器是最近發(fā)展起來的新式反應(yīng)器， 由預(yù)先消毒的、可被FDA認(rèn)可的、對(duì)生物無害的聚乙烯塑料箱組成，箱中部分填充培養(yǎng)液并接種細(xì)胞，箱中其余部分是空氣。使用前箱體用r射線消毒，用后丟棄。特殊的開孔可進(jìn)行無菌加樣、取樣，而不必把生物反應(yīng)器置于層流罩中，裝置簡(jiǎn)單，易于操作，成本低，低剪切力，無空氣鼓泡減低了氣泡對(duì)細(xì)胞的損害，可用于培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞并十分適合生產(chǎn)病毒。此反應(yīng)器已經(jīng)成功懸浮培養(yǎng)重組NSO細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體；懸浮培養(yǎng)人293細(xì)胞生產(chǎn)腺病毒；用昆蟲sf 9細(xì)胞生產(chǎn)棒狀病毒；用微載體Cytodex 3培養(yǎng)人293細(xì)胞。[林福玉，陳昭烈等.大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的問題及對(duì)策.生物技術(shù)通報(bào).1999，1:32-35.]
本發(fā)明中激流式生物反應(yīng)器是一種全新概念的生物反應(yīng)器，激流式生物反應(yīng)器由控制系統(tǒng)、激流式振蕩器、細(xì)胞培養(yǎng)罐、一次性細(xì)胞培養(yǎng)袋、滅菌器、取樣器、儲(chǔ)液袋七大部分組成?；跓o鼓泡式新型傳氧機(jī)制，它通過激流式振蕩器機(jī)械搖動(dòng)產(chǎn)生激流而使培養(yǎng)液反復(fù)沖刷細(xì)胞培養(yǎng)袋內(nèi)表面的氧分子層，進(jìn)而使氧，二氧化碳等氣體分子層迅速溶解于培養(yǎng)液中，同時(shí)帶走排除代謝廢物，以滿足細(xì)胞正常生長(zhǎng)和代謝的需求。激流式反應(yīng)器采用具有世界專利的無鼓泡式傳氧技術(shù)，可支持懸浮細(xì)胞高密度培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)用塑料反應(yīng)袋采用符合生物安全性的專用生物EVA膜，經(jīng)過24kGy鈷60幅照滅菌，通過內(nèi)毒素殘留檢測(cè)，符合GMP生產(chǎn)條件的要求。培養(yǎng)液在菌塑料反應(yīng)袋中產(chǎn)生激流式的沖刷，袋子內(nèi)壁和培養(yǎng)液之間完成氧分的傳遞，從而達(dá)到高效的傳氧、傳質(zhì)和混合的目的。該系統(tǒng)無氣升裝置、鼓泡或攪拌器，使剪切力最小化。一次性培養(yǎng)袋使用后就拋棄，可避免交叉污染、縮短批間處理周期，無需清洗、消毒、驗(yàn)證，極大地提高工作效率。
動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)一般分為分批式(batch)、流加式(Fed-batch)、灌流式 (perfusion)三種操作模式 。當(dāng)前公開發(fā)表的生產(chǎn)工藝占有主流優(yōu)勢(shì)的是利用反應(yīng)器進(jìn)行的懸浮培養(yǎng)，工藝設(shè)計(jì)是流加或灌流培養(yǎng)[米力，陳志南，動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)生產(chǎn)蛋白的工藝選擇，中國(guó)生物工程雜志，2003，23 (7) :1.]。無血清培養(yǎng)是當(dāng)今細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域的一大趨勢(shì)。采用無血清培養(yǎng)可簡(jiǎn)化分離純化步驟，避免支原體、病毒污染造成的危害。[Anna F. Europa, Anshu Garnbhir, Peng-Cheng Fu, We1-Shou Hu. Multiple States with Distinct Cellular Metabolism in Contiuous Culture of mammalian Cells. Biotechnol Bioeng, 2000,67 (I) :25-34.]流加培養(yǎng)工藝是當(dāng)前動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)占有主流優(yōu)勢(shì)的培養(yǎng)工藝。在規(guī)?；牡鞍踪|(zhì)生產(chǎn)中選擇使用流加工藝(Fed-batch)的公司有，如美國(guó)的Genentech, IDEC, Medlmmune, Merck等。流加培養(yǎng)工藝中的關(guān)鍵技術(shù)是基礎(chǔ)培養(yǎng)液和流加濃縮營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)液的設(shè)計(jì)。1996年謝良志博士運(yùn)用化學(xué)計(jì)量法，根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞生長(zhǎng)的需求，設(shè)計(jì)定量添加濃縮的培養(yǎng)液。[Xie L Z, Wang D1. High cell density and high monoclonal antibody production medium design and rational control in a bioreactor. Biorechnol Bioeg,1996,51 :725-729.]

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了應(yīng)用一種激流式生物反應(yīng)器，一次性反應(yīng)袋，無血清懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞(細(xì)胞包括重組CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞等)生產(chǎn)重組蛋白的工藝控制方法。我們的優(yōu)點(diǎn)是該激流式細(xì)胞反應(yīng)器，成本低，操作控制簡(jiǎn)單，利于大規(guī)模擴(kuò)大生產(chǎn)。通過細(xì)胞反應(yīng)袋表面沖刷傳氧，只需通入一定量空氣(O.1 10L/min)和少量氧氣，即可維持培養(yǎng)體系中溶解氧20 80% ;培養(yǎng)過程中只需對(duì)pH、溶解氧、溫度進(jìn)行在線監(jiān)控；對(duì)細(xì)胞密度、活率、葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸含量，滲透壓進(jìn)行定時(shí)監(jiān)測(cè)，采用自動(dòng)控制系統(tǒng)進(jìn)行流加補(bǔ)料。采用連續(xù)流加基礎(chǔ)培養(yǎng)液的方法來提高細(xì)胞密度并擴(kuò)大培養(yǎng)體積，再通過降低細(xì)胞培養(yǎng)溫度和流加濃縮培養(yǎng)液來維持細(xì)胞密度和活率。如流程圖所示，進(jìn)行每一輪生產(chǎn)時(shí)，從一瓶工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞開始，在無血清培養(yǎng)液中懸浮培養(yǎng)，逐級(jí)擴(kuò)增傳代，在搖瓶擴(kuò)增細(xì)胞后， 接種至50L激流反應(yīng)器，再接種至300L反應(yīng)器進(jìn)行生產(chǎn)。生產(chǎn)期將持續(xù)7-21天，細(xì)胞密度 (6X IO6 2X 107cells/ml)，加入丁酸鈉等已提高重組蛋白的表達(dá)量。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，收獲液直接純化。
1.細(xì)胞培養(yǎng)過程描述
工作細(xì)胞庫(kù)細(xì)胞管從冷凍保存的液氮罐內(nèi)取出，在約37°C快速融化，無菌條件下將細(xì)胞移入含有無血清培養(yǎng)液的T25方瓶中，并逐級(jí)擴(kuò)增到T125方瓶。這個(gè)時(shí)候以及整個(gè)培養(yǎng)過程中的特定間隔，測(cè)量細(xì)胞密度和計(jì)算群體倍增水平(TOL)的樣品都在無菌的條件下取出。T方瓶在37±2°C培養(yǎng)，細(xì)胞保持懸浮，密度維持在O. 5X IO6 2X 106cells/ml,當(dāng)培養(yǎng)體積達(dá)到40ml將細(xì)胞移入搖瓶中，在37±2°C搖床中培養(yǎng)，(2 5天后)再以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度將細(xì)胞接入含有新鮮培養(yǎng)液的150ml搖瓶，(2 5天后)再以適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度將細(xì)胞接入含有新鮮培養(yǎng)液的3L搖瓶，在適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度(2 5天后)細(xì)胞接入6L搖瓶。 在適當(dāng)?shù)募?xì)胞生長(zhǎng)時(shí)期(2 5天后)，6L搖瓶細(xì)胞接入帶有氣體(02、C02和N2)控制系統(tǒng)的50L反應(yīng)器，50L反應(yīng)器擴(kuò)增至40L至50L體積，細(xì)胞密度維持在4X IO6 8X IO6Cells/ ml，用袋傳袋地方法直接接種300L反應(yīng)器，溫度控制在37±O. 2°C，通過控制塔用C02和碳酸鈉(堿)控制PH，用通入空氣恒流來保持反應(yīng)器內(nèi)正向壓力，用氧氣通氣量間隔時(shí)間來控制溶解氧含量高低。所有氣體通過O. 22 μ m或更小孔徑的膜過濾，葡萄糖要加入培養(yǎng)液中連續(xù)流加使糖含量保持在l_2g/L。并不斷擴(kuò)增培養(yǎng)體積，細(xì)胞達(dá)到較高密度O. 8 X IO6 2X107cells/ml,降溫30 35°C開始生產(chǎn)期培養(yǎng)，流加濃縮的培養(yǎng)液成分的培養(yǎng)液使細(xì)胞保持活率，當(dāng)細(xì)胞群體生長(zhǎng)處于衰退期且細(xì)胞活率在40 80%時(shí)，停止培養(yǎng)。
2.細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增的各步工藝參數(shù)包括
I)基礎(chǔ)無血清培養(yǎng)液中葡萄糖起始濃度為3 6g/L ;濃縮的表達(dá)無血清培養(yǎng)液葡萄糖起始濃度為40 60g/L ;培養(yǎng)過程中葡萄糖濃度控制為I 2g/L ；
2)無血清培養(yǎng)液中谷氨酰胺起始濃度為2 4mM/L ;培養(yǎng)過程中谷氨酰胺下限為 O. 5 1. 5mM/L ；
3)培養(yǎng)過程乳酸的最高上限為5 20mM/L ；
4)凍存管存放在液氮中。T方瓶培養(yǎng)條件37°C 5% C02培養(yǎng)箱。搖瓶培養(yǎng)條件 37°C搖床，轉(zhuǎn)速100 200rpm。收獲方式無菌放料。收獲時(shí)間細(xì)胞密度下降且活率在 40 80%時(shí)。
3.細(xì)胞培養(yǎng)原材料
所有生產(chǎn)原材料都必須按照GMP中規(guī)定 的程序，完成接收、鑒定、抽樣、檢驗(yàn)、測(cè)試和簽發(fā)。表I列出重組藥物細(xì)胞培養(yǎng)中所用原材料，必要的情況下相同材料也可以替代。
表I細(xì)胞培養(yǎng)原材料
權(quán)利要求
1.一種利用激流式生物反應(yīng)器動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟 (1).用激流式生物反應(yīng)器無血清懸浮培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞，起始接種細(xì)胞密度為O.5X106 4X106cells/ml ;根據(jù)細(xì)胞密度變化流加基礎(chǔ)培養(yǎng)液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)體積，使細(xì)胞密度維持在4X IO6 8X 106cellS/ml，當(dāng)培養(yǎng)體積擴(kuò)大到反應(yīng)器最大培養(yǎng)體積的1/2 3/4時(shí)，開始將溫度下降到30 35°C并流加濃縮培養(yǎng)液進(jìn)行表達(dá)。
(2).培養(yǎng)過程工藝參數(shù)針對(duì)不同的細(xì)胞株生長(zhǎng)代謝需求，通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞密度及活率，細(xì)胞溶液中滲透壓，以及葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸含量，來控制流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的速率。
(3).蛋白降溫表達(dá)過程中細(xì)胞由對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)入平臺(tái)期并維持7 21天，其產(chǎn)物濃度逐漸升高，當(dāng)細(xì)胞群體生長(zhǎng)處于衰退期且細(xì)胞活率在40 80%時(shí)，停止培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，此種方法可以用于重組蛋白的生產(chǎn)，包括單克隆抗體和融合蛋白等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中，使用的反應(yīng)器為激流式生物反應(yīng)器是指由控制塔、搖床、罐體、一次性塑料袋組成的反應(yīng)系統(tǒng)；其特征在于，該反應(yīng)器系統(tǒng)無氣升、鼓泡或攪拌器裝置，采用搖動(dòng)的培養(yǎng)方式，使剪切力最小化。使用的反應(yīng)容器為一次性塑料反應(yīng)袋，避免罐體清洗、滅菌等工作。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，所述的細(xì)胞包括重組CHO細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞等適合懸浮培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中，培養(yǎng)溫度36 37°C、PH6. 7 7. 4、搖床轉(zhuǎn)動(dòng)速度30 60rpm、溶氧濃度(空氣飽和度)為20 80%;所述控制流加營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的速率、培養(yǎng)溫度、DO、PH采用細(xì)胞反應(yīng)器控制系統(tǒng)進(jìn)行在線自動(dòng)控制。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中，培養(yǎng)過程中定時(shí)對(duì)細(xì)胞密度、活率、滲透壓、葡萄糖、氨、乳酸含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中，所述配制流加用于細(xì)胞擴(kuò)增的基礎(chǔ)培養(yǎng)液和流加用于蛋白表達(dá)的濃縮培養(yǎng)液采用商品化培養(yǎng)液干粉添加一些營(yíng)養(yǎng)成分和鹽、大豆水解物、生長(zhǎng)因子、重組人胰島素，該培養(yǎng)液不包含任何牛源或豬源成分。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，其中，所述培養(yǎng)反應(yīng)器中流加基礎(chǔ)培養(yǎng)液后，細(xì)胞密度達(dá)到4X106 lX107cells/ml，細(xì)胞培養(yǎng)體積可擴(kuò)增到50 300L，甚至更大體積；培養(yǎng)反應(yīng)器中結(jié)合流加濃縮表達(dá)培養(yǎng)液后，細(xì)胞密度可達(dá)到8X IO6 2X 107cells/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用激流式生物反應(yīng)器無血清培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)重組蛋白類藥物的工藝過程及控制方法。該工藝采用流加基礎(chǔ)培養(yǎng)液來提高細(xì)胞密度并擴(kuò)大細(xì)胞培養(yǎng)體積。通過降低培養(yǎng)溫度和流加濃縮的表達(dá)培養(yǎng)液來維持細(xì)胞密度和活率。從而高效、持續(xù)的獲得重組蛋白。工藝控制方法主要針對(duì)不同細(xì)胞株生長(zhǎng)代謝變化，對(duì)pH、溶解氧、溫度變化進(jìn)行在線監(jiān)測(cè)；對(duì)細(xì)胞密度、活率、培養(yǎng)體系中葡萄糖、谷氨酰胺、氨、乳酸、滲透壓進(jìn)行定時(shí)檢測(cè)。該方法特別適合大規(guī)模動(dòng)物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。具有操作控制簡(jiǎn)單，傳質(zhì)傳氧效率高，培養(yǎng)周期穩(wěn)定、批次間結(jié)果差異小、生產(chǎn)成本低、容易實(shí)現(xiàn)大體積、高密度等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12M1/36GK102994442SQ201110265840
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月8日
發(fā)明者張秀芹, 劉鐵成, 張雪亭, 王延濤, 楊威, 李會(huì)成 申請(qǐng)人:哈藥集團(tuán)技術(shù)中心