專利名稱：氣單胞菌及在(R)-α-羥基苯乙酸生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及00-α-羥基苯乙酸，尤其是涉及一種豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviae B18及其在(R) - α -羥基苯乙酸生物不對稱轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
(R)-Ci-羥基苯乙酸是一種重要的藥物中間體，廣泛地應(yīng)用于多種藥物的合成，如青霉素、頭孢菌素、抗肥胖藥物、抗腫瘤制劑、光學(xué)純的氨基酸、輔酶Α、血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑等，還可以用來制成手性拆分試劑。目前，國際市場上光學(xué)活性的α-羥基苯乙酸需求量約以年均10%以上的速度增長，已成為重要的藥物與精細(xì)化工中間體。辛梅華(辛梅華，分析化學(xué)，2001,29 (8) :990)報道了色譜柱直接拆分制備α -羥基苯乙酸的方法，該方法具有簡便、快速、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點，但需采用手性分離介質(zhì)，并且處理量小、成本高，僅限于檢測及實驗室制備。Tanaka K (Tanaka K,. J Chem Research, 2002 (9) :446-447)利用手性拆分劑麻黃堿、二-甲基節(jié)胺、辛可寧以及苯甘氨酸丁酯等與α -羥基苯乙酸的兩種對映體形成非對映體鹽類增加物理性質(zhì)差異，然后結(jié)晶分離。但該法不僅存在產(chǎn)率低、手性拆分劑價格昂貴等缺點，而且拆分后的S對映體無法利用，對環(huán)境將造成較大的污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18。本發(fā)明的另一目的是提供豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeBW在(R) - α -羥基苯乙酸生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。所述豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18已于2010年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學(xué)院微生物研究所，該中心登記入冊編號為CGMCC No. 4382。所述豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18是以苯乙酮酸為底物，經(jīng)初篩、誘變及分離純化獲得，該菌株能選擇性轉(zhuǎn)化(R) - α -羥基苯乙酸。所述豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18的16SrRNA的序列如下所示
cgcctgcagtcgagcggcagcgggaaagtagcttgctacttttgccggcgagcggcggac60
gggtgagtaatgcctgggaaattgcccagtcgagggggataacagttggaaacgactgct120
aataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggaccttcgggccttgcgcgattggata180
tgcccaggtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagc240
tggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggag300
gcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagccatgcCgCgtgtgtg360
aagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggtcagtagctaatatc420
tgctgactgtgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcgg480
taatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtt540
ggataagttagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatttaaaactgtccag600
ctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctg660
gaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagc720
gtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttgg780
aggctgtgtccttgagacgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggag840
tacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat900
gtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtctggaatcctg960
tagagatacgggagtgccttcgggaatcagaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagct1020
cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgtcctttgttgcca1080
gcacgtaatggtgggaactcaagggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggat1140
gacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggcgcgtac1200
agagggctgcaagctagcgatagtgagcga3- C C CQ-Q-Q-Q-Q-gcgcgtcgtagtccggattg1260
gagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgc1320
ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcac1380
cagaagtagatagcttaaccttcggagggcgtact1415所述豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeBW在制備(R) - α -羥基苯乙酸中的應(yīng)用。所述制備(R)-α-羥基苯乙酸的方法為將豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18 接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，加入底物苯乙酮酸，催化底物苯乙酮酸中羰基的不對稱還原，然后從發(fā)酵液中分離純化反應(yīng)產(chǎn)物(R)-Q-羥基苯乙酸；所述底物苯乙酮酸的濃度可為5 165mmolο所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基為淀粉12. 81g，酪蛋白胨 12. 74g，KH2PO4 2. 97g，K2HPO4 1. 2g， MgSO4O. 15g, CaCl2 0. 125g, MnSO4 0. 015g, ZnSO4 0. Olg，定容至 1L，ρΗ7· 2 ；所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度濕重可為75 100g/L。所述豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18的接種量可按體積比4%的接種量轉(zhuǎn)接至轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基；所述不對稱還原的條件可為將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基于30 36°C，最好為32°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min的條件下，反應(yīng)時間為19h，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基pH7. 2，離心除去菌體，得(R) - α -羥基苯乙酸發(fā)酵液，調(diào)節(jié)PH為1.0，乙酸乙酯萃取，經(jīng)微波真空干燥得(R)-a-羥基苯乙酸； 所述微波真空干燥的條件可為微波功率5kW，干燥溫度為45°C，真空度為-0. 08MPa，干燥時間為Ih。本發(fā)明的顯著優(yōu)點是本發(fā)明所用的發(fā)酵工藝，不僅能獲得高純度的(R)-Ci-羥基苯乙酸，而且生產(chǎn)成本比現(xiàn)有的低廉，并且產(chǎn)物無需拆分，效率高、污染少，是一種具有廣泛應(yīng)用前景的生產(chǎn)方法，可以滿足迅速發(fā)展的醫(yī)藥工業(yè)的需要。
具體實施例方式該豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18在(R) - α -羥基苯乙酸不對稱轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用為制備( -α-羥基苯乙酸，所述制備方法步驟為將豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeBIS按體積比4%的接種量轉(zhuǎn)接至轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基，在轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基加底物苯乙酮酸，將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基于30 36°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min的條件下，反應(yīng)時間為19h，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基pH7. 2， 離心除去菌體，得(R)-a-羥基苯乙酸發(fā)酵液，調(diào)節(jié)PH為1，在微波功率5kW、干燥溫度為450C，真空度為-0. OSMPa的條件下，經(jīng)微波真空干燥Ih得純度為99. 5 %的(R) - α -羥基苯乙酸。其中( -α-羥基苯乙酸轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的制備方法為將淀粉12.81g，酪蛋白胨 12. 74g, ΚΗ2Ρ042· 97g, K2HPO4 1. 2g, MgSO4 0. 15g, CaCl2 0. 125g, MnSO4 0. 015g, ZnSO4 0. Olg，定容至 1L，pH7. 2。轉(zhuǎn)化的最佳溫度為32°C。轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度濕重為75 100g/L ；底物苯乙酮酸濃度為5 165mmol。實施例菌株的篩選取池塘底泥Ig懸浮于IOmL無菌水中，進(jìn)行梯度稀釋，取0.2mL稀釋液涂布于選擇性平板(含培養(yǎng)基=KH2PO4 lg, NaCl lg, K2HPO4 lg, MgSO4 0. 15g, CaCl2 0. 125g, MnSO4 0. 015g，ZnSO4 0. Olg，底物苯乙酮酸5mM,自來水定容至1L，ρΗ7· 2)。在選擇性平板中加入 50U/mL制霉菌素，32°C培養(yǎng)2 3天，觀察菌的生長情況，并將菌群劃線分離。用無菌牙簽挑取不同形態(tài)菌落，接入裝有2mL發(fā)酵培養(yǎng)基(淀粉12.81g，酪蛋白胨12.74g，KH2P04 2. 97g， K2HPO4L 2g, MgSO4O. 15g, CaCl2O. 125g, MnSO4O. 015g, ZnSO4O. Olg, pH7. 2)的試管內(nèi)，32°C， 200r/min搖床條件下培養(yǎng)19h，加入底物苯乙酮酸5mM，轉(zhuǎn)化20h，轉(zhuǎn)化后的發(fā)酵液IOOOOrpm 離心lOmin，離心收集菌株豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18。豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18 的 16S rRNA 的測定1)取ImL培養(yǎng)至對數(shù)生長期(約19h)的菌液于1. 5mL Eppendorf(EP)管中， 5000rpm冷凍離心5min，倒掉上清液，收集菌體.往沉淀的菌體中加入500 μ 1的TE緩沖液，
置于漩渦混合器上，使之重懸，離心洗滌，重復(fù)兩遍，去除上清。2)加入500 μ 1的溶菌酶(6mg · mL—1)重懸細(xì)胞，用剪掉尖頭的槍頭吹打混勻，于 37 °C水浴鍋水浴30 60miN。3)加入25 μ 1 10% SDS充分混勻，于55°C水浴鍋中保溫30min，再加入5 μ 1蛋白酶K充分搖勻，繼續(xù)水浴lh。加入等體積的酚/氯仿/異戊醇05 24 1)混勻后室溫放置 5 lOmin, 12000rpm 離心 IOmin04)吸取上清液，再用等體積的氯仿/異戊醇04 1)抽提兩次。5)吸取上清液，加入1/5體積的NaAc緩沖液(pH 5. 2)，輕輕搖勻，再加入等體積的異丙醇于_20°C冰箱中放置15 20min以沉淀DNA，IOOOOrpm離心^iin后去上清。6)沉淀用70%的乙醇洗滌兩次后空氣晾干以除去乙醇。最后將沉淀溶解于50μ 1 含500μ g/mL RNaseA的TE buffer中，于4°C溫度下置過夜后，置于_20°C保存?zhèn)溆谩?)使用上海生工生物工程有限公司的DNA基因組提純試劑盒提取該轉(zhuǎn)化菌株基因組DNA。16S rRNA基因序列的PCR反應(yīng)，以細(xì)菌基因組DNA為模板，選擇細(xì)菌16S rRNA 基因特異性引物，上游引物27F 5 ‘ -AGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘；下游引物1492R 5' -TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3‘，使用大連寶生生物工程公司的TaKaRa PCR相關(guān)試劑， 根據(jù)產(chǎn)品說明設(shè)置反應(yīng)條件為50mmol/LMgCl2、200ymol/LdNTP、正反引物各500pmol/L、 2. 5 μ Taq polymerase，94°C 變性 5min 后進(jìn)入循環(huán)，94 °C Imin — 55 °C 40s — 72 °C lmin, 共30個循環(huán)，最后72°C延伸lOmin。PCR儀為ABI公司的2720型。使用TaKaRa garose Gel DNAPurification Kit切膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收。16S rRNA基因序列測定采用ABI公司3730XL型DNA測序儀。以Forward Primer/Reverse Primer為引物，擴增獲得分子量約為1415bp的單一 DNA片段。將該序列提交NCBI進(jìn)行同源性比對，與氣單胞菌屬(Aeromonas caviae)的16S rRNA序列的同源性達(dá)到97%。確定所篩選的菌株屬于 Aeromonas caviae。因此將菌株命名為豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18。(R)-Q-羥基苯乙酸的手性生物轉(zhuǎn)化斜面各菌株分別接到各自的液體培養(yǎng)基中(酪蛋白胨10g，牛肉膏5g，麥芽糖10g， NaCl 2g，定容至lL，pH7.2)，搖瓶培養(yǎng)至對數(shù)生長期。移取1 % V/V種子液，置于50mL的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，在32°C，200r/min條件下振蕩培養(yǎng)IOh至較高菌濃(0D600約為1. 0)后，加入 ImM的苯乙酮酸作為誘導(dǎo)物，繼續(xù)培養(yǎng)證。以該培養(yǎng)液為種子培養(yǎng)液，按4%接種量接種至 300mL 的轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基(淀粉 12. 81g，酪蛋白胨 12. 74g，KH2P042. 97g, K2HPO4L 2g,MgSO4O. 15g， CaCl2O. 125g, MnSO4O. 015g, ZnSO4O. Olg,定容至 1L, pH7. 2)。在 32°C，200r/min 條件下振蕩培養(yǎng)19h。底物苯乙酮酸采用間歇流加補料，濃度維持在lOOmmol/L左右。產(chǎn)物( -α-羥基苯乙酸采用反相離子對高效液相色譜法測定，其中流動相為甲醇-25mmol/L磷酸緩沖液 (內(nèi)含 5mmol/L 庚烷磺酸鈉，ρΗ7· 0) (20 80，V/V)，檢測波長:220nm，流速:lmL/min，柱溫室溫，進(jìn)樣量20μ1。產(chǎn)物(R)-a-羥基苯乙酸的光學(xué)純度(e.e)采用毛細(xì)管電泳分析。電泳條件為緩沖液為含150g/L羥丙基-β-環(huán)糊精的lOOmmol/L Tris磷酸溶液(pH 7. 6)，分離電壓20kV ；分離柱溫20°C ；進(jìn)樣壓力3. 0 X IO3Pa,進(jìn)樣時間IOsec ；紫外檢測波長 214nm。標(biāo)準(zhǔn)樣品用超純水配制(Milli.-QII型超純水系統(tǒng))。毛細(xì)管預(yù)處理為每次使用前分別用超純水(13. 78 X IO4Pa)淋洗 5min、0. lmol/LNa0H(6. 89 X IO4Pa)淋洗 5min、超純水淋洗5min。每次進(jìn)樣前用超純水和緩沖液各淋洗:3min。反應(yīng)結(jié)束之后，將發(fā)酵液離心(12000rpm，IOmin)除去細(xì)胞，收集上清液250mL，用濃硫酸調(diào)節(jié)PH至1. 0，再用入乙酸乙酯萃取，合并萃取液，接著用無水硫酸鈉干燥，最后在微波功率5kW、干燥溫度為45°C，真空度為-0. OSMPa的條件下，經(jīng)微波真空干燥Ih獲得純度為99. 5 %的R) - α -羥基苯乙酸，產(chǎn)物(R) - α -羥基苯乙酸得率為49 %。
權(quán)利要求
1.豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18，其特征在于所述豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeBIS已于2010年11月30日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，該中心的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，該中心登記入冊編號為CGMCC No. 4382 ；所述豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18的16S rRNA的序列如下所示cgcctgcagtcgagcggcagcgggaaagtagcttgctacttttgccggcgagcggcggac60gggtgagtaatgcctgggaaattgcccagtcgagggggataacagttggaaacgactgct120aataccgcatacgccctacgggggaaagcaggggaccttcgggccttgcgcgattggata180tgcccaggtgggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccctagc240tggtctgagaggatgatcagccacactggaactgagacacggtccagactcctacgggag300gcagcagtggggaatattgcacaatgggggaaaccctgatgcagccatgcCgCgtgtgtg360aagaaggccttcgggttgtaaagcactttcagcgaggaggaaaggtcagtagctaatatc420tgctgactgtgacgttactcgcagaagaagcaccggctaactccgtgccagcagccgcgg480taatacggagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtt540ggataagttagatgtgaaagccccgggctcaacctgggaattgcatttaaaactgtccag600ctagagtcttgtagaggggggtagaattccaggtgtagcggtgaaatgcgtagagatctg660gaggaataccggtggcgaaggcggccccctggacaaagactgacgctcaggtgcgaaagc720gtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcgatttgg780aggctgtgtccttgagacgtggcttccggagctaacgcgttaaatcgaccgcctggggag840tacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat900gtggtttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctggccttgacatgtctggaatcctg960tagagatacgggagtgccttcgggaatcagaacacaggtgctgcatggctgtcgtcagct1020cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccctgtcctttgttgcca1080gcacgtaatggtgggaactcaagggagactgccggtgataaaccggaggaaggtggggat1140gacgtcaagtcatcatggcccttacggccagggctacacacgtgctacaatggcgcgtac1200agagggctgcaagctagcgatagtgagcgaatcccaaaaagcgcgtcgtagtccggattg1260gagtctgcaactcgactccatgaagtcggaatcgctagtaatcgcaaatcagaatgttgc1320ggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcac1380cagaagtagatagcttaaccttcggagggcgtact1415。
2.如權(quán)利要求1所述豚鼠氣單胞菌AeromonascaviaeBW在制備(R)-a-羥基苯乙酸中的應(yīng)用。
3.如權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述制備(R)-a-羥基苯乙酸的方法為將豚鼠氣單胞菌eromonas caviaeBIS接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，加入底物苯乙酮酸，催化底物苯乙酮酸中羰基的不對稱還原，然后從發(fā)酵液中分離純化反應(yīng)產(chǎn)物(R)-α -羥基苯乙酸。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述底物苯乙酮酸的濃度為5 165mmol；所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基可為淀粉 12. 81g，酪蛋白胨 12. 74g，KH2P042. 97g，K2HPO4L 2g，MgSO4O. 15g， CaCl2O. 125g, MnSO4O. 015g, ZnSO4O. Olg，定容至 1L, pH7. 2。
5.如權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，細(xì)胞濃度濕重為 75 100g/L。
6.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述豚鼠氣單胞菌AeromonascaViaeB18的接種量按體積比4%的接種量轉(zhuǎn)接至轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基。
7.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述不對稱還原的條件為轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的溫度30 36°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，反應(yīng)時間為19h，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基pH7. 2，離心除去菌體，得 (R) - α -羥基苯乙酸發(fā)酵液，調(diào)節(jié)ρΗ為1. 0，乙酸乙酯萃取，經(jīng)微波真空干燥得(R)-Ci-羥基苯乙酸。
8.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基的溫度為32°C。
9.如權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于所述微波真空干燥的條件為微波功率5kW，干燥溫度為45°C，真空度為-0. 08MPa，干燥時間為Ih。
全文摘要
氣單胞菌及在(R)-α-羥基苯乙酸生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，涉及(R)-α-羥基苯乙酸。提供一種豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18及其在(R)-α-羥基苯乙酸生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviaeB18是以苯乙酮酸為底物，經(jīng)初篩、誘變及分離純化獲得，該菌株能選擇性轉(zhuǎn)化(R)-α-羥基苯乙酸。將豚鼠氣單胞菌接入轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，加底物苯乙酮酸，催化底物苯乙酮酸中羰基的不對稱還原，然后從發(fā)酵液中分離純化反應(yīng)產(chǎn)物(R)-α-羥基苯乙酸。利用提供的菌株轉(zhuǎn)化(R)-α-羥基苯乙酸專一性強、產(chǎn)率高、工藝操作簡單、成本低廉、目標(biāo)產(chǎn)物容易分離。
文檔編號C12R1/01GK102321556SQ201110268308
公開日2012年1月18日 申請日期2011年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月9日
發(fā)明者關(guān)瑞章, 李忠琴 申請人:集美大學(xué)