專利名稱：抗結(jié)核分枝桿菌單克隆抗體及其識別的抗原表位和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及單克隆抗體，尤其涉及一種抗結(jié)核分枝桿菌CsdA單克隆抗體以及分泌該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發(fā)明還涉及與該單克隆抗體特異性結(jié)合的一個表位多肽以及它們的用途，本發(fā)明屬于抗結(jié)核分枝桿菌CsdA單克隆抗體領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
結(jié)核病是嚴重危害人類健康的重要傳染病，對公共衛(wèi)生安全造成了極大的威脅。 中國是結(jié)核病的高發(fā)國家，結(jié)核病人數(shù)居世界第二并有上升趨勢，結(jié)核病的防控不容樂觀。 全球耐藥結(jié)核病的發(fā)生率上升和廣泛傳播給結(jié)核病控制工作帶來了嚴重威脅，為了尋找新的作用靶點，尤其是一些功能特殊的蛋白質(zhì)(冷休克蛋白)是開發(fā)新藥物的重要途徑。冷休克蛋白(Cold shock protein, CSP)是廣泛存在于革蘭氏陽性菌和陰性菌中的應(yīng)激蛋白，在保護機體和幫助細胞適應(yīng)低溫環(huán)境方面起著重要的作用。CSP是RNA分子伴侶，其與細胞中的mRNA結(jié)合，穩(wěn)定mRNA，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達。在某些病原菌中，CSPs對于其致病、傳播以及應(yīng)對宿主免疫系統(tǒng)等起著重要的作用。有研究表明，CSP與生物被膜的形成有關(guān)，生物被膜對于許多致病菌(如銅綠假單胞菌等)的致病有著重要的作用，還發(fā)現(xiàn)冷休克蛋白是細菌低溫存活的關(guān)鍵蛋白，因而深入研究結(jié)核分枝桿菌冷休克蛋白的功能，能為抑制結(jié)核分枝桿菌生長提供新思路，并探索其與結(jié)核分枝桿菌致病和免疫方面的關(guān)系，可以便于尋找特異菌體抗原的靶向藥物從而實現(xiàn)結(jié)核病的預防與治療。Dead-box蛋白家族屬于冷休克蛋白家族中的一類蛋白，CsdA (cold-shock DEAD-box protein Α)屬于Dead-box蛋白家族非常重要的一個蛋白，常溫下表達量極低，而在低溫時會大量表達，具有RNA酶解旋活性，是核糖體結(jié)合蛋白，其功能與細胞分裂增殖有關(guān)。目前，最常用的方法是應(yīng)用基因敲除或者RNA干擾技術(shù)研究CsdA蛋白在結(jié)核分枝桿菌內(nèi)的作用機理，那么能否成功敲除CsdA基因或者RNAi成功，需要抗結(jié)核分枝桿菌CsdA單克隆抗體進行驗證，迄今為止，尚缺乏一種抗結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體。因此，制備抗CsdA單克隆抗體對于研究結(jié)核分枝桿菌的低溫存活機制具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一株分泌抗結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株。本發(fā)明的目的之二是提供一種抗結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體以及與該單克隆抗體特異性結(jié)合的一個表位多肽。本發(fā)明目的之三是提供所述單克隆抗體以及與該單克隆抗體特異性結(jié)合CsdA的表位多肽的用途。本發(fā)明上述目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的一株穩(wěn)定分泌抗結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株(A3GQ，其微生物保藏號是=CGMCC No. 5077 ；保藏時間為2011年7月22日；其分類命名是雜交瘤細胞株；保藏單位是中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。所述雜交瘤細胞株通過以下途徑制備得到用CsdA-his融合蛋白免疫BALB/c小鼠，取免疫的小鼠脾臟細胞和小鼠骨髓瘤SP2/0細胞經(jīng)融合、篩選、克隆、傳代和反復凍存、 復蘇后獲得小鼠雜交瘤細胞系，最終篩選出一株能穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株 A3G5。本發(fā)明進一步從雜交瘤細胞上清液中或從注射雜交瘤細胞的動物腹水中，獲得結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體。所述CsdA-his融合蛋白由以下方法獲得將含有結(jié)核分枝桿菌CsdA核苷酸序列的pEI^8a-CsdA質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，IPTG誘導下獲得低尿素濃度可溶的CsdA-his融合蛋白，對CsdA-his融合蛋白進行純化，得到所述的CsdA-his融合蛋白。本發(fā)明所述的 IPTG(Isopropyl-β -d-thiogalactopyranoside，異丙基-β -Dii 代半乳糖苷)可以誘導蛋白表達，能對乳糖操縱子產(chǎn)生極強的誘導效應(yīng)，是強誘導物。具體的，所述單克隆抗體由如下方法制備得到(1)免疫原的準備將pET-^a-CsdA載體轉(zhuǎn)化DE3大腸桿菌，在IPTG誘導下，分子量約64ku的CsdA以低尿素濃度可溶的形式存在。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實驗方案中，以低尿素濃度、加入去垢劑和咪唑梯度洗脫對融合蛋白進行了純化，并以純化過的蛋白作為抗原免疫小鼠；(2)動物免疫用上述純化過的CsdA融合蛋白免疫BALB/c小鼠。每只小鼠以 IOOug的量進行背部皮下注射，每兩周一次共三次，第四次加強免疫一次，3天后待融合，獲得免疫小鼠。(3)雜交瘤細胞系的建立取免疫小鼠的脾臟細胞作為能夠產(chǎn)生抗體的漿細胞， 與同系動物的骨髓瘤細胞(SP2/0)以聚乙二醇(PEG3500)介導進行融合。融合后細胞經(jīng) HAT培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)，以間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)篩選陽性克隆。用有限稀釋法對陽性孔的雜交瘤細胞進行克隆化培養(yǎng)直至克隆化細胞抗體陽性率為100%。將雜交瘤細胞經(jīng)體外連續(xù)傳代和反復凍存、復蘇，直到細胞系能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。(4)單克隆抗體的制備與純化將建系的雜交瘤細胞注射到經(jīng)石蠟油預處理的小鼠腹腔，誘生腹水。誘生的腹水用親和層析法獲得純化的單克隆抗體。單克隆抗體的反應(yīng)特異性試驗結(jié)果表明，本發(fā)明所制備的單克隆抗體是針對結(jié)核分枝桿菌CsdA的特異性的抗體，對結(jié)核分支桿菌CsdA具有反應(yīng)特異性。經(jīng)鑒定，該單克隆抗體Ig亞類為IgGl，輕鏈屬于κ型，命名為A3G5。本發(fā)明還涉及所述的單克隆抗體針對結(jié)核分枝桿菌CsdA的特異性肽段的篩選。 本發(fā)明利用12肽庫的噬菌體展示技術(shù)，利用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(elisa)對單克隆抗體的表位進行3輪淘選，進行滴度測定、陽性噬菌體克隆測序和競爭抑制試驗，最終證明所述單克隆抗體對seq id no. 1所示核苷酸序列的第1327-1353位核苷酸編碼的多肽具有特異性，所述多肽的氨基酸序列為cp印=Apdpplsrr(seq id no. 2)?？傊?，本發(fā)明提供了一種抗結(jié)核分枝桿菌CsdA單克隆抗體及產(chǎn)生該單克隆抗體的雜交瘤細胞株，本發(fā)明還提供了與所述單克隆抗體特異性結(jié)合CsdA的一個表位多肽，為進一步明確CsdA在結(jié)核分枝桿菌的作用機理提供了基礎(chǔ)，進而能為抑制結(jié)核分枝桿菌生長提供新思路，并探索其與結(jié)核分枝桿菌致病和免疫方面的關(guān)系，可以便于尋找特異菌體抗原的靶向藥物從而實現(xiàn)結(jié)核病的預防與治療。


圖 1 為 CsdA-his 融合蛋白誘導表達的 SDS-PAGE(PolyAcrylamide Gel Electrophoresis，聚丙烯酰胺凝膠)；1為空載體對照；2為未加IPTG誘導對照；3為重懸液超聲沉淀；4為重懸液超聲的上清。圖2為純化后CsdA-his融合蛋白的SDS-PAGE ； 1-4為純化的CsdA-his融合蛋白。圖3為抗結(jié)核分枝桿菌CsdA單抗純化后SDS-PAGE ； 1為純化的單克隆抗體。圖4為A3G5單克隆抗體經(jīng)ELISA方法進行亞型鑒定。圖5為免疫印跡雜交檢測A3G5單克隆抗體特異性的結(jié)果；1為誘導重組菌；2為誘導空質(zhì)粒菌。圖6噬菌體克隆ELISA檢測。圖7陽性克隆測序分析。圖8合成肽的競爭抑制試驗。圖9噬菌體克隆的競爭抑制試驗。圖10不同噬菌體克隆免疫小鼠血清與Cp印肽的反應(yīng)試驗。圖11不同噬菌體克隆免疫小鼠血清與Cp印肽的反應(yīng)試驗。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細節(jié)和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。實施例ICsdA原核表達載體的構(gòu)建以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組DNA為模板，采用PCR方法擴增出1690bp的 csdA(cold-shock Dead-box protein Α)基因，經(jīng)限制性酶(BamH I 和 Sal I)切后， 與pET28a載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，并經(jīng)酶切和PCR鑒定后獲得重組質(zhì)粒 pET28a-csdA。實施例2CsdA-his融合蛋白的表達與純化1、重組蛋白的誘導挑取含有pEDSa-CsdA質(zhì)粒的單克隆菌落，接種于5ml含有卡那青霉素的LB培養(yǎng)基，37°C 220rpm振蕩過夜。次日，以1 100稀釋到含卡那青霉素的500ml LB培養(yǎng)基中， 37°C培養(yǎng)至0D600約為0. 6，加入IPTG使其濃度為0. 2mM轉(zhuǎn)至16°C誘導20小時，離心收集沉淀。2、重組蛋白的純化1)用 12mL 重懸液(20mM Tis, 150mM NaCl)將沉淀懸起，超聲 30 分鐘，再 12000rpm 離心20分鐘，收集沉淀；2)用 12mL 溶解液(20mM Tris, 150mM NaCl，2M 尿素 0. 5% NP40)重懸沉淀并超聲 30分鐘，超清;
3)將樹脂混勻并取出2mL放入小瓶中，靜止沉淀后棄去乙醇。再用適量水洗樹脂。 再加入6mL溶解液(20mM Tris, 150mM NaCl，2M尿素，0. 5% NP4tl)懸起樹脂，重力沉降后排出上清；4)將超聲后液體12，OOOrpm離心20min，上清與上述3)中樹脂結(jié)合；5)低溫結(jié)合振蕩混勻30min，結(jié)合完畢后開始上柱；6)反復掛柱3次；7)用 30mL 洗雜液 1 (20mM Tris 150mM Nacl 2M 尿素 0. 5% NP40 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液體，每次清洗均需徹底懸浮樹脂，通過重力使其沉降；8)用 30mL 洗雜液 2 (20mM Tris 300mM Nacl 2M 尿素 0. 5% NP40 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液體；9)用 30mL 洗雜液 3 (20mM Tris 150mM Nacl 3M 尿素 0. 5% NP40 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液體；10)用 30mL 洗雜液 4 QOmM Tris 150mM Nacl 3M 尿素 0. 5% NP4tl 20mM 咪唑 pH = 8. 0)清洗柱子，收集排出的液體；11)用 5mL 洗脫液(20mM Tris 150mM Nacl 3M 尿素 0. 5% NP40 500mM 咪唑 pH = 8. 0)洗掉樹脂結(jié)合的蛋白；12)并以Iml每管分裝洗脫下的蛋白，并用分光光度計進行蛋白定量；13)用IOOml的純水過柱清洗；14)用20%乙醇過柱，并將其4°C保存。實施例3抗血清的制備將純化的CsdA-his融合蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混合并乳化后，皮下多點免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠，注射劑量為100μ g/只；共免疫三次，后兩次用等體積的弗氏不完全佐劑，免疫劑量也為IOOyg/只。第三次免疫后7天，尾部靜脈采血，分離血清作為陽性血清，并用不加佐劑的蛋白腹腔注射進行加強免疫，劑量也為IOOyg/只。實施例4單克隆抗體的制備1、飼養(yǎng)細胞鋪板在融合前一天，取一只無免疫的BALB/c小鼠，脫頸處死，并將其完全浸泡于75% 的酒精中約5min。用剪刀小心剪開腹部皮膚，但不要剪開腹膜。酒精棉球?qū)Ω鼓みM行消毒， 20ml的注射器吸取5ml HAT篩選培養(yǎng)基，小心推入小鼠腹腔，取飼養(yǎng)細胞，然后注入到培養(yǎng)皿中。再加入約36ml完全培養(yǎng)基混勻，用排槍加入四塊96孔培養(yǎng)板中，ΙΟΟμΙ/孔。觀察生長，防治污染。2、免疫后的脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合無菌條件下取出加強免疫的BALB/c小鼠脾臟，在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中洗掉結(jié)締組織。再將脾臟移入另一盛有基礎(chǔ)培養(yǎng)基中進行二次清洗，然后過100目鋼絲網(wǎng)，將其搗碎，將懸液轉(zhuǎn)入離心管中，IOOOrpm離心lOmin，用基礎(chǔ)培養(yǎng)液懸起脾細胞，進行計數(shù)。收集生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期的SP2/0細胞，進行計數(shù)。按比例為1 10的脾細胞和骨髓瘤細胞進行融合，轉(zhuǎn)速IOOOrpm進行7-lOmin的離心。輕輕震動離心管，使細胞輕微的懸浮起來，便于融合劑的滲入細胞之間。將離心管放入37°C水中，加入lmlPEG1450，不能過快，并邊滴邊搖晃離心管。靜止lmin，然后按著lmL/min、3mL/min，6mL/min速度分步滴加培養(yǎng)基，最后再慢慢滴加到45mL，起到徹底終止作用。IOOOrpm離心lOmin，吸盡上清，用37°C預熱準備好的含有20%胎牛兒血清的HAT選擇培養(yǎng)基，輕輕懸起沉淀細胞，并定容到40mL，然后轉(zhuǎn)移到高壓過的平皿中，按每孔100 μ L的量加入96孔細胞培養(yǎng)板中，放入細胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。HT培養(yǎng)基的配制方法將100倍濃縮的HT液體(Iml)放入含有20%胎牛兒血清的DMEM99ml液體培養(yǎng)基中。HAT培養(yǎng)基的配制方法將100倍濃縮的HAT液體(Iml)放入含有20%胎牛兒血清的DMEM99ml液體培養(yǎng)基中。3雜交瘤細胞的篩選用顯微鏡觀察融合后細胞的生長情況及時用固體NaOH顆粒清除污染的細胞。每3 天更換培養(yǎng)基一次，所用培養(yǎng)基根據(jù)換液時間而有所不同，在融合后的第3、6天用HAT培養(yǎng)基進行半換液，第9天改用HT培養(yǎng)基進行半換液，第12天用HT培養(yǎng)基進行全換液。當在 15天時融合的細胞形成小集落，大約達到板底面積的1/4時，取上清100 μ 1用于抗體水平的檢測。利用間接ELISA方法，對細胞分泌抗體的水平進行檢測。用移液器小心吹打陽性孔，使細胞混勻懸浮。然后取100 μ 1放入2mL的DMEM的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，充分混勻，進行計數(shù)。取約100個細胞的混合液，放入IOmlHT培養(yǎng)液中，并用100 μ 1的排槍吸到鋪有飼養(yǎng)層細胞的96孔板中。經(jīng)常觀察細胞生長狀態(tài)，培養(yǎng)液變黃進行換液，測ELISA值，篩選陽性單一雜交瘤細胞群。再用相同方法進行陽性雜交瘤細胞的克隆，最終篩選到一株能夠穩(wěn)定分泌抗結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株(A3GQ，其微生物保藏號是CGMCC No.5077。實施例5單克隆抗體的腹水的制備及純化取8-10周齡的BALB/c小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL/只，一周后接種生長狀態(tài)良好的單克隆雜交瘤細胞(A3G5)，大約0. 5X IO6個細胞，待一周左右，小鼠腹部會膨大影響其生理功能，抽取腹水，一只小鼠大約能抽5mL，離心取上清，分裝到1. 5ml的干凈的離心管里，-20°C備用。用飽和硫酸銨沉淀法將腹水進行初步提純，之后用ftOtein A親和層析法將其進一步純化，結(jié)核分枝桿菌CsdA單克隆抗體純化后的SDS-PAGE圖見圖2。該圖顯示了單克隆抗體的輕鏈和重鏈的電泳圖，單抗的純度很高。實驗例1抗結(jié)核分枝桿菌CsdA單克隆抗體A3G5效價及亞型鑒定用間接ELISA方法，檢測純化后單克隆抗體的效價為10萬以上(表1)。采用 Southern Biotech抗體亞類試劑盒對獲得的單抗A3G5進行單抗亞類進行鑒定，結(jié)果表明 單克隆抗體A3G5重鏈為IgGl，輕鏈是κ鏈，見圖4。表1為純化后的A3G5單克隆抗體ELISA方法檢測效價結(jié)果
稀釋度1:20001:40001:80001:16000 1_: 32000 1_: 64000 1: 1280001:256000A3G5 OD 值2. 462. 2121. 9211. 619 1331 1—.101 0.6760. 382實驗例2單克隆抗體的反應(yīng)特異性誘導重組菌和空質(zhì)粒菌，進行SDS-PAGE，半濕轉(zhuǎn)到NC膜上，分別用陽性雜交瘤細胞上清作為一抗進行western-blot分析，見圖5，說明該單克隆抗體是針對結(jié)核分枝桿菌 CsdA的特異性的抗體。
實驗例3陽性噬菌體的富集分析利用噬菌體展示隨機12肽庫Ph. D-12 按照說明書上所述的淘選方法，通過3輪噬菌體淘選，按照公式回收率(％)=(洗脫的噬菌體數(shù)/篩選加入的噬菌體數(shù))X100%， 計算出3輪試驗的回收率。經(jīng)過3輪淘選，第三輪的噬菌體的回收率OX10—2)為第一輪回收率(3.0X10_5)的670倍?？梢?，經(jīng)過淘選后，噬菌體得到顯著的富集，見表2。表權(quán)利要求
1.一株分泌抗結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其特征在于，其微生物保藏號是CGMCC No. 5077。
2.由權(quán)利要求1所述雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體。
3.權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在定位結(jié)核分枝桿菌中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求2所述單克隆抗體在制備檢測或診斷結(jié)核分枝桿菌CsdA試劑或藥物中的用途。
5.與權(quán)利要求2所述單克隆抗體特異性結(jié)合的一個表位多肽，其特征在于其氨基酸序列為SEQ ID No. 2所示。
6.權(quán)利要求5所述的表位多肽用于CsdA蛋白功能研究中的用途。
7.權(quán)利要求5所述的表位多肽在制備免疫干預治療結(jié)核病藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗結(jié)核分枝桿菌單克隆抗體及其所識別的抗原表位和用途。本發(fā)明提供了一株穩(wěn)定分泌抗結(jié)核分枝桿菌CsdA的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其微生物保藏號是CGMCCNo.5077。本發(fā)明進一步提供了由該雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體，該單克隆抗體對結(jié)核分支桿菌CsdA具有反應(yīng)特異性，是針對結(jié)核分枝桿菌CsdA的特異性的抗體。本發(fā)明還提供了與所述單克隆抗體特異性結(jié)合的一個表位多肽，為進一步明確CsdA在結(jié)核分枝桿菌的作用機理提供了基礎(chǔ)，進而能為抑制結(jié)核分枝桿菌生長提供新思路，便于尋找特異菌體抗原的靶向藥物從而實現(xiàn)結(jié)核病的預防與治療。
文檔編號C12N5/20GK102399751SQ20111026916
公開日2012年4月4日 申請日期2011年9月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月13日
發(fā)明者于申業(yè), 于秀婷, 劉思國, 劉慧芳, 司微, 朱婷, 王華南, 王秀梅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所