專利名稱：強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于酶法合成食品添加劑領(lǐng)域，具體涉及一種強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)異槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖苷 (Quercetin-3-glucose)，是自然界中非常罕見的一種具有顯著的抗氧化性、抗腫瘤等生物活性的黃酮類化合物，是國(guó)際上各大醫(yī)藥食品公司競(jìng)相開發(fā)的高級(jí)食品添加劑、輔助藥物或藥物有效成分，也是國(guó)際上新型多功能食品添加劑EMIQ(EnZymatiCally Modified Isoquercitrin)的合成原料(Toxicology, 2010, 268 (3) :213-218)。專利CN 101985639A介紹了異槲皮苷的制備方法主要有提取法和水解法兩種 (1)異槲皮苷在自然界中的分布較少，其含量?jī)H有幾萬分之一甚至是十萬分之幾，直接從自然界植物中提取難以制備異槲皮苷；( 酸催化水解法的水解溫度較高，使用的酸對(duì)設(shè)備腐蝕嚴(yán)重，并產(chǎn)生大量的酸性廢水，且蘆丁的水解過程中槲皮素和異槲皮苷共存，必須對(duì)水解產(chǎn)物采用分離手段才能獲得異槲皮苷(African Journal of Biotechnology, 2011, 10(8) :1460-1466)。因此，以酶促水解蘆丁公認(rèn)是制備異槲皮苷的有效途徑。即，以自然界分布廣泛、來源豐富的蘆丁為原料，經(jīng)糖苷酶催化水解反應(yīng)制備異槲皮苷，建立生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷的酶促水解工藝是今后規(guī)?；苽洚愰纹ぼ盏奈ㄒ贿x擇。令人遺憾的是，生物合成異槲皮苷目前尚未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模應(yīng)用，原因在于蘆丁等大多天然糖苷底物溶解性差和α-L-鼠李糖苷酶活力較低等產(chǎn)業(yè)化難題。傳統(tǒng)以水為溶劑的中糖苷酶催化的活力十分有限，而非水相介質(zhì)具有顯著增強(qiáng)酶催化效率的能力 (Bioprocess and Biosystems Engineering. 2009,32(6) :765-772)，如在水為介質(zhì)的糖苷酶催化反應(yīng)體系中添加共溶劑(Cosolvent)、表面活性劑(Surfactant)等改變反應(yīng)介質(zhì)理化性質(zhì)的途徑來增強(qiáng)酶促合成異槲皮苷的效率，即介質(zhì)工程(Medium Engineering)手段改變反應(yīng)介質(zhì)與優(yōu)化反應(yīng)參數(shù)來強(qiáng)化異槲皮苷的生物合成過程。在糖苷酶催化反應(yīng)中，一般只有與酶分子緊密結(jié)合的一層左右的必需水 (Essential Water)分子對(duì)酶的催化活性是至關(guān)重要的。不同酶與必需水結(jié)合的緊密程度及所結(jié)合的必需水?dāng)?shù)量是不相同的，并且對(duì)產(chǎn)物產(chǎn)生一些影響。有些情況下，在反應(yīng)體系中加入適當(dāng)?shù)奶砑觿┐姹匦杷灿兄谔岣呙傅娜嵝?Flexibility)，從而提高酶的立體選擇性。特別是，添加適當(dāng)?shù)墓踩軇┗?和)表面活性劑的方法改變反應(yīng)介質(zhì)的理化性質(zhì)， 從而對(duì)酶促反應(yīng)過程進(jìn)行調(diào)控和強(qiáng)化。合適的共溶劑、表面活性劑添加到酶促反應(yīng)體系， 可以提高底物在反應(yīng)體系中的溶解度，也可以促使酶具有更加嚴(yán)密的構(gòu)型，具體表現(xiàn)在熱穩(wěn)定性的提高和對(duì)底物選擇性的增強(qiáng)(Journal of Molecular Catalysis B =Enzymatic, 1996,3-6(1) :201-211 ；Bioresource Technology,2011,102(3) :2890-2896)。因此，本專利在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑或表面活性劑來強(qiáng)化合成效率，該方法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物得率高，對(duì)環(huán)境友好，從而可以克服傳統(tǒng)糖苷酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點(diǎn)，易于工業(yè)化生產(chǎn)高純度異槲皮苷，為推動(dòng)其在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中的廣泛應(yīng)用具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中所述的不足，本發(fā)明提供了一種強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法。該方法在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑或表面活性劑，可大大強(qiáng)化合成效率。技術(shù)方案一種強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，包括酶促合成異槲皮苷的體系，該體系包括溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的蘆丁母液，蘆丁母液中含有α -L-鼠李糖苷酶液，上述體系中添加有共溶劑或表面活性劑，其中共溶劑的體積濃度為1 20%，表面活性劑的體積濃度為0. 01 10%。配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度為0. 01 lmol/L。配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液PH值為5 9。所述蘆丁母液的濃度為0. 01 lg/L。所述蘆丁母液中按體積比1 50%加入α -L-鼠李糖苷酶液。所述蘆丁母液中加入α -L-鼠李糖苷酶液的濃度為0. 1 100g/L。所述共溶劑包括醇類、酯類、酮類、鹵代烴和雜環(huán)化物，所述醇類為甲醇、乙醇或正丁醇，所述酯類為乙酸乙酯、乙酸丁酯或丙酸乙酯，所述酮類為丙酮或丁酮，所述鹵代烴為一氯甲烷、二氯甲烷或氯仿，所述雜環(huán)化物為四氫呋喃、二甲基亞砜、吡啶或呋喃。所述表面活性劑包括陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉，所述陽離子表面活性劑為季銨化物，所述兩性離子表面活性劑為卵磷脂、氨基酸型或甜菜堿型，所述非離子表面活性劑為脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯或?qū)凼?(氧乙烯)特-辛基酚。所述蘆丁酶促反應(yīng)溫度范圍為10 60°C，振蕩轉(zhuǎn)速范圍為50 200r/min，反應(yīng)時(shí)間范圍為1 48h。(1)在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑以0. 01 lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH = 5 9的0. 01 lg/L 的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比1 50%加入0. 1 100g/L α -L-鼠李糖苷酶液，加入共溶劑至體積濃度為1 20%，在10 60°C、50 200r/min條件下振蕩反應(yīng)1 48h。 反應(yīng)結(jié)束后，HPLC檢測(cè)結(jié)果表明共溶劑可大大強(qiáng)化酶活及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。(2)在酶促合成異槲皮苷的體系中添加表面活性劑以0. 01 lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH = 5 9的0. 01 lg/L 的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比1 50%加入0. 1 100g/L α -L-鼠李糖苷酶液，加入表面活性劑至濃度為0. 01 10%，在10 60°C、50 200r/min條件下振蕩反應(yīng)1 48h。反應(yīng)結(jié)束后，HPLC檢測(cè)結(jié)果表明表面活性劑可大大強(qiáng)化酶活及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率。有益效果在酶促合成異槲皮苷的體系中添加共溶劑或表面活性劑來強(qiáng)化合成效率，該方法反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物得率高，對(duì)環(huán)境友好，克服了傳統(tǒng)糖苷酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點(diǎn)，易于工業(yè)化生產(chǎn)高純度異槲皮苷。此外，整個(gè)酶促反應(yīng)工藝基本上無廢棄物產(chǎn)生，無環(huán)境污染，具有非常良好的工業(yè)化應(yīng)用前景，可以滿足迅速發(fā)展的醫(yī)藥工業(yè)和日化工業(yè)的需要。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。本發(fā)明實(shí)施例中使用同時(shí)檢測(cè)蘆丁和異槲皮苷的測(cè)定方法為高效液相色譜法，色譜條件Alltima Cw Q50mmX 4. 6mm，5 μ m)，流動(dòng)相0. 02%磷酸-乙腈(80 20, ν/ν)；檢測(cè)波長(zhǎng):360nm ；流速1. OmL/min ；進(jìn)樣量20 μ L。其中，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率計(jì)算方法為
權(quán)利要求
1.一種強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，包括酶促合成異槲皮苷的體系，該體系包括溶解于磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液的蘆丁母液，蘆丁母液中含有α -L-鼠李糖苷酶液，其特征在于上述體系中添加有共溶劑或表面活性劑，其中共溶劑的體積濃度為1 20%，表面活性劑的體積濃度為0. 01 10%。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度為0. 01 lmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液PH值為5 9。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于蘆丁母液的濃度為0. 01 lg/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于在蘆丁母液中按體積比1 50%加入α -L-鼠李糖苷酶液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于在蘆丁母液中加入α -L-鼠李糖苷酶液的濃度為0. 1 100g/L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于所述共溶劑包括醇類、酯類、酮類、鹵代烴和雜環(huán)化物，所述醇類為甲醇、乙醇或正丁醇，所述酯類為乙酸乙酯、乙酸丁酯或丙酸乙酯，所述酮類為丙酮或丁酮，所述鹵代烴為一氯甲烷、二氯甲烷或氯仿，所述雜環(huán)化物為四氫呋喃、二甲基亞砜、吡啶或呋喃。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于所述表面活性劑包括陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑、兩性離子表面活性劑或非離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑為硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉或十二烷基硫酸鈉，所述陽離子表面活性劑為季銨化物，所述兩性離子表面活性劑為卵磷脂、氨基酸型或甜菜堿型，所述非離子表面活性劑為脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦、聚山梨酯或?qū)凼?氧乙烯)特-辛基酚。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，其特征在于蘆丁酶促反應(yīng)溫度范圍為10 60°C，振蕩轉(zhuǎn)速范圍為50 200r/min，反應(yīng)時(shí)間范圍為1 48h。
全文摘要
強(qiáng)化酶法合成異槲皮苷的介質(zhì)工程方法，在反應(yīng)體系中添加共溶劑或表面活性劑改變反應(yīng)介質(zhì)的理化性質(zhì)，提高底物在反應(yīng)介質(zhì)中的溶解度，提高酶的熱穩(wěn)定性及其對(duì)底物的立體選擇性。該方法操作簡(jiǎn)便，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)物得率高，對(duì)環(huán)境友好，克服了傳統(tǒng)糖苷酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點(diǎn)，有利于工業(yè)化生產(chǎn)高純度異槲皮苷。
文檔編號(hào)C12P19/60GK102286576SQ20111026996
公開日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者吳福安, 張旭東, 王俊, 許晏 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)