專利名稱：基于磁珠提取大豆及其深加工產(chǎn)品核酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用磁珠從植物及其植物源加工食品中提取并純化核酸的領(lǐng)域。 磁珠通過修飾之后可以與核酸特異性結(jié)合而從復雜的樣品中進行分離純化，通過洗脫使提取的核酸釋放到溶液中，實現(xiàn)核酸的快速分離提取，涉及核酸分離方法、試劑盒及在轉(zhuǎn)基因檢測中的應用。
背景技術(shù)：
核酸的提取與純化技術(shù)是生物化學與分子生物學的一項基本技術(shù)。隨著分子生物學技術(shù)廣泛應用于生物學，醫(yī)學，食品檢測及其相關(guān)領(lǐng)域，核酸的提取與純化技術(shù)也得到了進一步的發(fā)展。核酸在細胞中總是與各種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起，核酸提取主要是將核酸與蛋白、多糖、脂肪、酚類等生物分子物質(zhì)分離。大多數(shù)方法一般都包括細胞裂解，去除與核酸結(jié)合的物質(zhì)，沉淀核酸，去除鹽類、有機溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等步驟。傳統(tǒng)方法主要是CTAB法，離心柱法，試劑盒法。由于傳統(tǒng)方法步驟繁瑣，耗時，并且用有機溶劑，污染較大，易導致核酸降解；試劑盒法存在價格昂貴等缺點。本發(fā)明采用磁珠核酸提取方法，在操作過程中不含氯仿，苯酚等毒性大的有機溶劑，提取純化的核酸質(zhì)量好，滿足核酸后續(xù)研究的需求，提取步驟更為簡單，不需要多次離心，易于實現(xiàn)自動化，這些優(yōu)點及其特點使其具有代替其它方法的趨勢。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是利用磁性微球從大豆及其深加工產(chǎn)品中快速提取基因組DNA，以進行后續(xù)轉(zhuǎn)基因檢測。本發(fā)明以磁性微球為固相載體純化核酸的方法包括以下步驟(1)細胞裂解使用裂解液將樣品細胞裂解，以釋放其中的核酸，并離心取其中的上清液。(2)核酸純化將裂解上清液與binding buffer混合，再加入二氧化硅殼磁性微球。通過binding buffer對于DNA的排擠作用，使得磁性微球特異性地與DNA結(jié)合。磁分離之后棄去上清液，磁珠-DNA復合物得以保留，其余雜質(zhì)則除去。之后再用70%乙醇洗滌， 除去殘留雜質(zhì)。(3)核酸洗脫在磁珠-DNA復合物中加入TE溶液，DNA即可洗脫下來，以供后續(xù)生物檢測之用。本發(fā)明的優(yōu)點(1)不需使用有毒的有機溶劑，綠色環(huán)保，有利于操作人員的健康。(2)操作簡便，大大減少核酸純化時間，操作時間小于2h，有效防止長時間操作造成的核酸降解。(3)使用范圍廣泛，不僅適用于含有多酚、多糖的植物鮮品，還適用于含有較多PCR抑制劑、DNA片段嚴重斷裂的深加工食品。(4)具有自動化升級的潛力，可與磁珠分離設備配合，實現(xiàn)核酸提取的規(guī)?；?、集成化。


附圖1.為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。泳道左邊為大豆內(nèi)源Lectin基因產(chǎn)物，中間為外源35S基因產(chǎn)物，右邊為外源Nos基因產(chǎn)物。M:2000bp marker，1-7號泳道檢測樣品依次為陽性對照、大豆粉、豆腐、豆奶粉、豆腐、豆?jié){和空白對照。附圖2.為大豆內(nèi)源Lectin基因的熒光定量PCR的檢測附圖3.為大豆外源35S基因的熒光定量PCR的檢測附圖4.為大豆外源NOS基因的熒光定量PCR的檢測
具體實施例方式實施例1 以磁珠純化大豆及其深加工產(chǎn)品的核酸。
具體實施例方式以大豆及其大豆加工食品為例。1.稱取一定量的樣品于EP離心管中。2.加入適量的細胞裂解液，于65°C中30min，中間混勻3_4次。3. 12000rpm 離心 IOmin4.取適量上清液(注意不要吸到雜質(zhì)顆粒)于已經(jīng)用binding buffer分散好的二氧化硅-磁球中，形成DNA- 二氧化硅-磁球復合物。5.充分混勻后靜置IOmin。6.磁分離，棄去混合溶液。7. MM 4-6 ο8.用適量的70%乙醇溶液分散，洗去雜質(zhì)。9.磁分離，棄去液體。10.重復 8-9。11.室溫下充分晾干。
12.加入一定量的TE洗脫DNA，使DNA從DNA- 二氧化硅-磁球復合物脫離下來。13.磁分離，吸取液體，即得到DNA溶液，存放于4°C冰箱中備用。實施例2 以磁性微球純化大豆及其制品的DNA和熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分。按照實施例1中的具體實施方式
提取DNA，并且用于內(nèi)源基因檢測以及轉(zhuǎn)基因 35S，NOS成分的檢測，具體結(jié)果見

以及表一和表二。實施例3 本發(fā)明的磁珠純化法與其他DNA提取方法的比較。將本發(fā)明方法與傳統(tǒng)CTAB方法以及市售試劑盒做了對比，本發(fā)明方法可以達到下游DNA樣品的要求，實驗結(jié)果見表一、二。表一大豆熒光定量PCR檢測Ct值
權(quán)利要求
1.利用磁珠提取大豆及其深加工產(chǎn)品核酸的方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品細胞經(jīng)lysis buffer裂解之后離心取上層清液；(2)清液中加入binging buffer和二氧化硅殼磁珠，核酸在該環(huán)境下會與磁珠形成復合物。磁分離保留磁球使得核酸得到純化，再用70%洗滌出去殘留雜質(zhì)；C3)磁珠-核酸復合物中加入TE溶液，核酸即可洗脫下來。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用二氧化硅殼的磁珠快速提取純化核酸的方法，其特征在于以帶負電荷且具有磁性的二氧化硅殼磁珠為載體，直接與裂解液相互作用，帶負電的二氧化硅殼磁珠與在吸附劑環(huán)境下帶正電荷的核酸通過靜電作用形成復合物，在外磁場作用下與細胞裂解液進行分離，再通過洗脫液的作用將核酸從磁珠上洗脫下來，從而達到了對核酸的快速分離純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用二氧化硅殼的磁珠快速提取純化核酸的方法，其特征在于磁珠特異性地與核酸結(jié)合，而不與蛋白質(zhì)、多糖、多酚等雜質(zhì)結(jié)合，有利于樣品的轉(zhuǎn)基因成分檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用二氧化硅殼的磁珠快速提取純化核酸的方法，其特征在于使用范圍廣泛，不僅適用于含有多酚、多糖、高蛋白的植物鮮品，還適用于DNA片段嚴重斷裂的深加工食品。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用二氧化硅殼的磁珠快速提取純化核酸的應用，其特征在于提取的核酸來源于大豆及其多種深加工產(chǎn)品，應用于對其轉(zhuǎn)基因成分的PCR及 real-time PCR 檢測。
全文摘要
本發(fā)明提供一種應用二氧化硅殼磁珠提取大豆及其深加工產(chǎn)品核酸的方法。樣品經(jīng)過裂解液裂解，釋放核酸之后，再與binging buffer和二氧化硅殼磁性微球共同作用，核酸可與磁珠特異性地形成復合物，通過磁分離出去蛋白質(zhì)、多糖、多酚等雜質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸的分離純化。該方法不需使用有毒有害的有機溶劑，環(huán)境友好，操作簡便，比傳統(tǒng)提取方法提取的核酸純度更高，并具有自動化升級的潛力，可與磁珠分離設備配合，實現(xiàn)核酸提取的規(guī)?；?、集成化。
文檔編號C12N15/10GK102337260SQ20111027011
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者冉曉華, 王愛迪, 趙衛(wèi)東, 鄭文杰, 陳磊 申請人:天津出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心