專利名稱：強化酶促合成異槲皮苷的方法
技術領域：
本發(fā)明屬于酶法合成食品添加劑領域，具體涉及一種超聲波場致強化酶促合成異槲皮苷的方法。
背景技術：
現(xiàn)有技術異槲皮苷(Isoquercitrin)，即槲皮素-3-0- β -D-葡萄糖苷 (Quercetin-3-glucose)，在自然界中非常罕見，是一種具有顯著抗氧化性、抗腫瘤等生物活性的黃酮類高級食品添加劑和天然藥物有效成分，也是近年來國際上新型功能性食品添加劑 EMIQ (Enzymatically Modified Isoquercitrin)的合成原料(Toxicology, 2010， 268(3) :213-218)。專利CN 101985639 A以自然界分布廣泛、來源豐富的蘆丁為原料，經(jīng)糖苷酶催化水解反應制備異槲皮苷，建立了生物轉(zhuǎn)化蘆丁定向合成異槲皮苷的酶促水解工藝；酸水解制備異槲皮苷的水解溫度較高，酸類催化劑對設備腐蝕嚴重，并產(chǎn)生大量的酸性廢水，且蘆丁的水解過程中槲皮素和異槲皮苷共存，必須對水解產(chǎn)物采用分離手段才能獲得異槲皮苷 (African Journal of Biotechnology, 2011,10(8) : 1460-1466)。在此基礎上，酶促水解蘆丁被公認是制備異槲皮苷最有前景的方法，其中a_L-鼠李糖苷酶催化的酶促蘆丁定向水解反應是生產(chǎn)異槲皮苷的關鍵，也是提高酶法生產(chǎn)效率的重要途徑。因此，提高a_L-鼠李糖苷酶酶促反應的速度和強度是提高異槲皮苷轉(zhuǎn)化率、蘆丁原料利用率和生產(chǎn)效率的關鍵技術之一。大量的研究表明超聲波場致作用對酶的活性有影響，選擇適宜的超聲處理條件可提高酶促反應速度(Journal of Cleaner Production, 2008,16(5) :591-597)。超聲作用對于酶促反應的影響依賴于反應中酶的活性的變化，反應酶活力的表現(xiàn)必須依賴酶分子的構(gòu)象。超聲波場致作用提高酶活主要有兩方面的原因一方面超聲波產(chǎn)生的微流效應可促進底物迅速進入酶的催化部位及產(chǎn)物進入介質(zhì)，從而提高了酶的催化效率；另一方面， 超聲波的空化作用所產(chǎn)生的沖擊波改變了酶分子的空間構(gòu)象，從而改變了酶促反應的進程 (Ultrasonics Sonochemistry, 2011,18 (1) :303-309)。超聲波用于強化酶促反應份內(nèi)源酶和外源酶兩種類型(1)作用于內(nèi)源酶，如專利ZL 200610152149. 7和CN101696435 A公開了超聲強化內(nèi)源蒜氨酸酶促反應和水相酶促反應連續(xù)制備大蒜風味物質(zhì)的方法，有效提高了大蒜特征風味成分的產(chǎn)量；(2)作用于外源酶，如CN 101979642 A公開了超聲波輔助纖維素酶解過程的方法，較大地提高了秸稈纖維素酶解后還原糖的轉(zhuǎn)化率。目前生物合成異槲皮苷目前尚未實現(xiàn)工業(yè)化大規(guī)模應用，原因在于傳統(tǒng)以水為溶劑的反應體系中，蘆丁等大多天然糖苷底物的溶解性差，且α-L-鼠李糖苷酶的催化效率較低。因此，本專利在酶促合成異槲皮苷過程中采用超聲波場致強化，該方法操作簡便，反應條件溫和，產(chǎn)物得率高，對環(huán)境友好，從而可以克服傳統(tǒng)糖苷酶催化合成效率較低和底物溶解度較低的缺點，易于工業(yè)化生產(chǎn)高純度異槲皮苷，對推動其在醫(yī)藥、食品、化妝品等工業(yè)中的廣泛應用具有十分重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
技術問題針對現(xiàn)有技術中所述的不足，本發(fā)明提供了一種超聲波場致強化酶促合成異槲皮苷的方法。該方法在酶促合成異槲皮苷過程中采用超聲波場致強化，可大大提高異槲皮苷的合成效率。技術方案在10 150kHz范圍內(nèi)選定強度為不超過1. 5w/cm2的超聲波，1 60min/h連續(xù)作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系。以濃度為0. 01 lmol/L 磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH = 5 9的0. 01 lg/L的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比1 50%加入0. 1 100g/La -L-鼠李糖苷酶液，在10 60°C、50 200r/min 條件下振蕩反應1 48h。反應結(jié)束后HPLC檢測表明，超聲波場致強化酶促合成產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率要高于在相同條件下但未經(jīng)過超聲強化的方法。有益效果在酶促合成異槲皮苷的體系中采用超聲波場致強化，異槲皮苷的產(chǎn)物得率比未經(jīng)超聲強化的方法高，因此超聲波場致強化a -L-鼠李糖苷酶的酶促反應技術為異槲皮苷的生產(chǎn)提供了新的途徑。該方法反應條件溫和，對環(huán)境友好，易于工業(yè)化生產(chǎn)高純度異槲皮苷。此外，整個酶促反應工藝基本上無廢棄物產(chǎn)生，無環(huán)境污染，具有非常良好的工業(yè)化應用前景。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。本發(fā)明實施例中使用同時檢測蘆丁和異槲皮苷的測定方法為高效液相色譜法，色譜條件Alltima Cw Q50mmX 4. 6mm，5 μ m)，流動相0. 02%磷酸-乙腈(80 20, ν/ν)；檢測波長:360nm ；流速1. OmL/min ；進樣量20 μ L。其中，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率計算方法為
“初始蘆丁原料的摩爾量力α -L-鼠李糖苷酶液的制備參見專利CN 101985639 Α。實施例1選定頻率為10kHz、強度為0. lw/cm2的超聲波，lmin/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系。以0. 01mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制 PH = 5的0. 01g/L的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比加入0. lg/L α-L-鼠李糖苷酶液，在10°C條件下50r/min振蕩反應lh。反應結(jié)束后HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率比在相同條件下但未經(jīng)過超聲強化的方法提高了 0. 2%。實施例2
4
選定頻率為150kHz、強度為1. 5w/cm2的超聲波，60min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系。以lmol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制ρΗ =9的lg/L的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比50%加入lOOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在 60°C、200r/min條件下振蕩反應48h。反應結(jié)束后HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率比在相同條件下但未經(jīng)過超聲強化的方法提高了 2%。實施例3選定頻率為40kHz、強度為0. 28w/cm2的超聲波，10min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系。以0. 2mol/L磷酸氫二鈉-0. lmol/L檸檬酸緩沖液，配制PH = 7的0. 3g/L的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比5%加入lOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在40°C條件下120r/min振蕩反應20h。反應結(jié)束后HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率比在相同條件下但未經(jīng)過超聲強化的方法提高了 31%。實施例4選定頻率為40kHz、強度為0. 28w/cm2的超聲波，20min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系。以0. 2mol/L磷酸氫二鈉-0. lmol/L檸檬酸緩沖液，配制PH = 7的0. 3g/L的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比5%加入lOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在40°C條件下120r/min振蕩反應20h。反應結(jié)束后HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率比在相同條件下但未經(jīng)過超聲強化的方法提高了 40%。實施例5選定頻率為40kHz、強度為0. 28w/cm2的超聲波，30min/h作用于α -L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系。以0. 2mol/L磷酸氫二鈉-0. lmol/L檸檬酸緩沖液，配制PH = 7的0. 3g/L的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比5%加入lOg/La -L-鼠李糖苷酶液，在40°C條件下120r/min振蕩反應20h。反應結(jié)束后HPLC檢測，產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率比在相同條件下但未經(jīng)過超聲強化的方法提高了 53%。
權利要求
1.強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于對α-L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系施加超聲波場。
2.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于選取的超聲波頻率范圍為 10 150kHz O
3.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于選取的超聲波強度范圍為不超過1. 5w/cm2。
4.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于選取的超聲波作用時間范圍為1 60min/h。
5.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液濃度為0. 01 lmol/L。
6.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于配制蘆丁母液的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液PH值為5 9。
7.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于蘆丁母液的濃度為 0. 01 lg/L。
8.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于在蘆丁母液中按體積比 1 50%加入α -L-鼠李糖苷酶液。
9.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于在蘆丁母液中加入 α -L-鼠李糖苷酶液的濃度為0. 1 100g/L。
10.權利要求1所述強化酶促合成異槲皮苷的方法，其特征在于蘆丁酶促反應溫度范圍為10 60°C，振蕩轉(zhuǎn)速范圍為50 200r/min，反應時間范圍為1 48h。
全文摘要
強化酶促合成異槲皮苷的方法。該方法是在10～150kHz范圍內(nèi)選定強度為0～1.5w/cm2的超聲波，1～60min/h連續(xù)作用于α-L-鼠李糖苷酶催化水解蘆丁合成異槲皮苷的反應體系。以濃度為0.01～1mol/L磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，配制pH＝5～9的0.01～1g/L的蘆丁母液。在蘆丁母液中按體積比1～50％加入0.1～100g/L α-L-鼠李糖苷酶液，在10～60℃、50～200r/min條件下振蕩反應1～48h。本發(fā)明的優(yōu)點是超聲波場致強化酶促合成產(chǎn)物異槲皮苷的轉(zhuǎn)化率高于在相同條件下但未經(jīng)過超聲強化的方法，且操作簡便，條件溫和，可提高酶促反應的速度和強度。
文檔編號C12P19/60GK102286577SQ20111027030
公開日2011年12月21日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權日2011年9月14日
發(fā)明者吳福安, 張旭東, 王俊, 許晏 申請人:江蘇科技大學