專(zhuān)利名稱(chēng)：以揚(yáng)麥16為受體的轉(zhuǎn)基因植株快速再生的培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植株快速再生的培育方法，尤其是一種以楊麥16為受體的轉(zhuǎn)基因植株快速再生的培育方法。
背景技術(shù)：
小麥?zhǔn)呛瘫究?Gramineae)小麥屬(Triticum) —年生或多年生草本植物，是世界性的重要糧食作物。全世界約有35% 40%的人口以小麥作為主要糧食(金善寶.中國(guó)小麥學(xué)[M].北京中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，1996:廣3.)。我國(guó)小麥?zhǔn)莾H此于水稻的第二大糧食作物，常年種植面積在2. 7X108hm2左右，占全國(guó)耕地面積的30%左右。用植物基因工程技術(shù)進(jìn)行小麥遺傳改良，提高小麥的產(chǎn)量、改善小麥的品質(zhì)、增強(qiáng)小麥的抗病蟲(chóng)和抗逆能力，是小麥遺傳育種的一個(gè)新的發(fā)展方向。揚(yáng)麥16 (原名揚(yáng)0-1沈)，系江蘇省里下河地區(qū)農(nóng)科所與國(guó)家小麥改良中心揚(yáng)州分中心，用“揚(yáng)91F138”和“揚(yáng)90-30”經(jīng)雜交育成的春性中熟高產(chǎn)多抗的小麥良種。2004年經(jīng)江蘇省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定通過(guò)，2005年在蘇州豐產(chǎn)示范方核產(chǎn)，平均產(chǎn)量4 687. 5 kg/hm2，較對(duì)照揚(yáng)158小麥增產(chǎn)337. 5 kg/hm2，增產(chǎn)7. 8%。經(jīng)多年多點(diǎn)試驗(yàn)示范種植，表現(xiàn)出高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、多抗、適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，是江蘇省近年來(lái)主要推廣的小麥優(yōu)良品種。植物基因工程技術(shù)可以按照需要，將不同物種來(lái)源的目的基因進(jìn)行人工重組和遺傳轉(zhuǎn)移，打破了物種間基因交流的界限；能夠克服遠(yuǎn)緣雜交造成的不結(jié)實(shí)、不育，充分利用基因資源，縮短育種周期。自1983年獲得第一株轉(zhuǎn)基因煙草以來(lái)，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展迅速。目前，幾乎所有的作物都開(kāi)展了轉(zhuǎn)基因研究，育種目標(biāo)涉及到高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病蟲(chóng)及抗逆境等諸多方面。大豆、玉米、油菜、棉花等轉(zhuǎn)基因作物已進(jìn)入商品化生產(chǎn)，取得了顯著的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，轉(zhuǎn)基因作物種植面積每年都以10%以上的速度遞增，由1996年的170萬(wàn)公頃增加到2007年的1.143億公頃(喻修道，徐兆師，陳明，李連城，馬有志.小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2010,43(8) :1539-1553)。由于受到轉(zhuǎn)基因技術(shù)的限制，小麥轉(zhuǎn)基因研究滯后于其它作物。小麥?zhǔn)亲詈笠粋€(gè)轉(zhuǎn)化成功的重要禾谷類(lèi)糧食作物，一方面由于小麥屬于六倍體作物，遺傳背景復(fù)雜，基因組相對(duì)較大(約16 000 Mb),是玉米的7倍，水稻的35倍；另一方面，小麥遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中DNA 導(dǎo)入頻率低且轉(zhuǎn)化后再生能力不高，有較強(qiáng)的基因型依賴(lài)性(喻修道，徐兆師，陳明，李連城，馬有志.小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究及其應(yīng)用.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)2010,43(8):1539-1553.)。直到1992年Vasil等將⑶S/Bar基因?qū)胄←溒贩NI^avon，并獲得了抗除草劑Basta的再生植株，才宣告世界上首例轉(zhuǎn)基因小麥的問(wèn)世。在國(guó)內(nèi)，Cheng等在1997年成功獲得可育的轉(zhuǎn)基因植株，1999年Xia等在中國(guó)首次報(bào)道獲得了穩(wěn)定胚性組織的轉(zhuǎn)基因小麥植株。此后小麥的轉(zhuǎn)基因研究發(fā)展很快，并取得了一定的成就，但與雙子葉植物相比，甚至與其他禾谷類(lèi)作物(如玉米和水稻)相比，仍然存在較大的差距(葉興國(guó)等，2000)。目前，小麥轉(zhuǎn)基因技術(shù)仍處于建立和優(yōu)化階段。其中一個(gè)重要的原因是缺乏有效的離體再生體系，小麥組織培養(yǎng)中植株再生率低和基因型依賴(lài)性強(qiáng)的問(wèn)題一直是限制轉(zhuǎn)基因成功及大幅度提高轉(zhuǎn)基因小麥數(shù)量的主要因素。目前轉(zhuǎn)基因小麥90%以上是用基因槍法獲得的。基因槍法轉(zhuǎn)化是將外源基因在Ca2+或亞精胺等作用下吸附在重金屬金或鎢粒子表面(直徑Ium左右)，制成DNA微彈，利用基因槍將微彈高速射入植物受體細(xì)胞，引起微彈上吸附的DNA分子整合到植物基因組中，然后通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)，再生植株，從而實(shí)現(xiàn)外源基因的遺傳轉(zhuǎn)化。在進(jìn)行基因槍轟擊后，小麥幼胚能否長(zhǎng)出胚性愈傷組織是轉(zhuǎn)基因小麥成苗的關(guān)鍵因素之一。因?yàn)樾←溣着咴诮?jīng)過(guò)基因槍轟擊后，組織會(huì)受到一定損傷，再生能力會(huì)大大下降，隨著基因型的不同，小麥自身的修復(fù)和抵御傷害的能力也有所不同。所以，選擇良好基因型的小麥幼胚作為轟擊對(duì)象是進(jìn)行基因槍遺傳轉(zhuǎn)化的首要條件。只有具有優(yōu)良基因型的轉(zhuǎn)基因小麥品種才具有廣闊的研究?jī)r(jià)值和生產(chǎn)價(jià)值?；驑尫ㄊ菓?yīng)用于單子葉植物最常用的遺傳轉(zhuǎn)化的方法，基因槍法可選用未成熟胚或未成熟胚誘發(fā)的愈傷組織作為靶組織?；驑尫☉?yīng)用于大麥、小麥、玉米、燕麥及水稻等，都獲得了轉(zhuǎn)基因植株?；驑尫ǐ@取轉(zhuǎn)基因植株通常需費(fèi)時(shí)10至15個(gè)月 (Gordon-Kamm, 1990;Vasil等，1992)。即使選用未成熟胚作為靶組織使得轉(zhuǎn)化方法得以改進(jìn)，但是轉(zhuǎn)基因植株的獲得仍需時(shí)4至6個(gè)月(Vasil等，1992，1993 ；Becker等，1994)。小麥轉(zhuǎn)基因植株再生的培育周期一般較長(zhǎng)，主要原因是在傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法中基因轉(zhuǎn)化操作以后，一般恢復(fù)培養(yǎng)2周的時(shí)間，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的大量增殖，而非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的大量增殖就導(dǎo)致所需篩選除掉非轉(zhuǎn)化細(xì)胞的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，一些研究采取恢復(fù)培養(yǎng)后，對(duì)愈傷組織進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)，在繼代培養(yǎng)的過(guò)程中添加篩選試劑，然后再進(jìn)行分化培養(yǎng)；一些研究采取恢復(fù)培養(yǎng)后，直接進(jìn)行分化培養(yǎng)，由于在基因轉(zhuǎn)化后，恢復(fù)培養(yǎng)的時(shí)間較長(zhǎng)(2周)，因此一般分化篩選2次以上，每次2周，時(shí)間在30天以上。在傳統(tǒng)方法中，一般的小麥生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，形成3-6條發(fā)育良好的根系，一般需要30天左右的時(shí)間，導(dǎo)致小麥轉(zhuǎn)基因植株再生的培育周期過(guò)長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)小麥轉(zhuǎn)基因植株獲得耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題，一般最少需要4-6 個(gè)月，提供一種以揚(yáng)麥16為受體的小麥快速轉(zhuǎn)基因方法。本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的一種以揚(yáng)麥16為受體的轉(zhuǎn)基因植株快速再生的培育方法，對(duì)轉(zhuǎn)基因后的愈傷組織進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)、分化篩選、生根培養(yǎng)，其特征在于包括基因轉(zhuǎn)化，以及對(duì)轉(zhuǎn)基因后的愈傷組織進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)、分化篩選和生根培養(yǎng)，其特征在于在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)同時(shí)導(dǎo)入bar基因或Hyg基因，在分化篩選培養(yǎng)基中添加與bar基因或Hyg 基因?qū)?yīng)的篩選試劑，在愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)后通過(guò)分化篩選培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織進(jìn)行一次分化篩選，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，使整個(gè)轉(zhuǎn)基因再生植株的培育縮短至45飛0天，具體方法是
a)將揚(yáng)麥16幼胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，在高滲培養(yǎng)基培育4-5小時(shí)， 進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)同時(shí)導(dǎo)入bar基因或Hyg基因，再在高滲培養(yǎng)基培育10-15小時(shí)，最終完成前期的基因轉(zhuǎn)化；
b)基因轉(zhuǎn)化后在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)移至分化篩選培養(yǎng)基；
c)在分化篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-20天，獲得轉(zhuǎn)基因再生幼苗；
d)再生幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)13-16天，形成發(fā)育良好的根系，獲得完整的轉(zhuǎn)基因再生植株；
所述的分化篩選培養(yǎng)基為V2MS培養(yǎng)基+1. 5 mg/L NAA +1.5 mg/L KT +20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝膠，PH調(diào)至6. 0 ；其中，V2MS培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)的含量減半；當(dāng)篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因時(shí)，分化篩選培養(yǎng)基中添加3 mg/L Basta ；當(dāng)篩選標(biāo)記基因?yàn)镠yg基因時(shí)，分化篩選培養(yǎng)基中添加25 mg/L的潮霉素；
所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+ 1 mg/L IAA+0. 5g/L麥芽提取物+20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝膠，PH調(diào)至6.0。在本發(fā)明中所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，具體配方為改良 MS 培養(yǎng)基 + 2-4 mg /L 2，4_D + l_2g/L VBl + 150mg/L 谷氨酰胺 +30g/L 蔗糖 + 3 g/ L植物凝膠，PH調(diào)至6. 0 ；其中，改良MS培養(yǎng)基是指添加MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和鐵鹽，而不添加MS基本培養(yǎng)基的有機(jī)物質(zhì)；植物凝膠為Wiytogel或Gelrite ；所述的高滲培養(yǎng)基為在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0. 2M山梨醇和0. 2M甘露醇，PH調(diào)至6. 0。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于以具有優(yōu)良的基因型小麥新品種楊麥16為受體，由于在愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)后通過(guò)分化篩選培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織進(jìn)行一次分化篩選大大縮短了轉(zhuǎn)基因植株再生培育過(guò)程中分化篩選的時(shí)間；由于分化篩選培養(yǎng)基中含有Basta或潮霉素溶液，可以根據(jù)需要篩選除掉不含有標(biāo)記基因bar基因或Hyg基因的非轉(zhuǎn)化愈傷組織或其分化的幼芽；由于生根培養(yǎng)基含有0. 5g/L的麥芽提取物，更有利于轉(zhuǎn)基因再生幼苗生根；由于基因轉(zhuǎn)化操作以后恢復(fù)培養(yǎng)1周即轉(zhuǎn)入分化篩選，恢復(fù)培養(yǎng)比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法時(shí)間縮短一半； 由于恢復(fù)培養(yǎng)僅為1周，使轉(zhuǎn)化細(xì)胞和非轉(zhuǎn)化細(xì)胞既有所增殖，但并未大量增殖，有益于在分化篩選時(shí)獲得較高頻率的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性苗；由于分化篩選僅為一次15天，較傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)化方法至少縮短15天以上的時(shí)間，本發(fā)明的綜合效果可以使整個(gè)轉(zhuǎn)基因再生植株的培育縮短至45飛0天，比傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因再生植株培育方法需要4至6個(gè)月的周期，具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢(shì)。外源基因的轉(zhuǎn)化頻率在1%左右，建立了一種快速的小麥轉(zhuǎn)基因方法。


圖1轉(zhuǎn)基因幼苗分化篩選圖； 圖2轉(zhuǎn)基因幼苗生根圖3在單子葉植物中高效表達(dá)的載體pAHC25-c/7r示意圖4轉(zhuǎn)基因再生植株的分子檢測(cè)圖；其中1-8為轉(zhuǎn)化后再生植株；9為陰性對(duì)照 (揚(yáng)麥 16) ；10 為陽(yáng)性對(duì)照(pAHC25-c/7r 質(zhì)粒)；11 為 DL2000 Marker。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1
供試受體小麥楊麥16的種子愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基
改良 MS 培養(yǎng)基 + 2-4 mg /L 2，4_D + l_2g/L VBl + 150mg/L 谷氨酰胺+30g/L 蔗糖+ 3 g/L植物凝膠，pH調(diào)至6. 0。其中改良MS是指添加MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和鐵鹽，而不添加MS 基本培養(yǎng)基的有機(jī)物質(zhì)；植物凝膠為Wiytogel或者Gelrite (下同)
供試取胚受體小麥楊麥16的種子于2010年8月底9月初播于盆中，此后每半月播一批，共4批。平均溫度低于15°C時(shí)，苗移入溫室。取開(kāi)花后12-14天的幼嫩種子，置于1升的燒杯中，用酒精含量為75%溶液浸泡1分鐘，用無(wú)菌水沖洗一次，再用升汞含量0. 1%的表面消毒液消毒20分鐘，用無(wú)菌水水洗六次。剝?nèi)mm大小的幼胚，盾片向上放置于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，一般每個(gè)培養(yǎng)皿放置100個(gè)胚。置于黑暗的條件下培養(yǎng)，溫度^TC。實(shí)施例2 髙滲培養(yǎng)基
在實(shí)施例1中的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0. 2M山梨醇和0. 2M甘露醇，PH調(diào)至6. 0。篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因。轉(zhuǎn)基因研究中，選擇合適的篩選標(biāo)記基因和適當(dāng)濃度的篩選試劑是轉(zhuǎn)基因成功的重要保證。迄今為止，轉(zhuǎn)基因研究中使用的選擇標(biāo)記基因有50多個(gè)，以卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因和草丁膦抗性基因應(yīng)用居多。除草劑Basta的有效成分為Wiosphinothricin (PPT)結(jié)構(gòu)類(lèi)似谷氨酸，能競(jìng)爭(zhēng)地抑制植物體內(nèi)谷氨酰胺合成酶的活性，導(dǎo)致細(xì)胞由于NH4+累積而中毒死亡。PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶(Phosphinothricin -acetyltransferase，PAT)可以使PPT乙?；钩輨┦Щ?。編碼PAT酶的bar基因是從細(xì)菌hygrocopicus中克隆出來(lái)的。轉(zhuǎn)化進(jìn)力ar基因的細(xì)胞、組織和植株具有抗除草劑Basta的特性?；驑尀锽io-Rad公司PDS-1000/He型基因槍?；蜣D(zhuǎn)化前4-6小時(shí)將培養(yǎng)5天的幼胚及形成的愈傷組織轉(zhuǎn)入髙滲培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)，溫度26 0C ο利用轟擊壓力IlOOpsi轟擊幼胚及幼胚形成的愈傷組織，金粉直徑為lMffl。每皿轟擊愈傷組織數(shù)60-80個(gè)，每皿轟擊一次。將轟擊后的幼胚或愈傷組織在高滲培養(yǎng)基中保留 16-20小時(shí)，然后再轉(zhuǎn)入愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗條件下恢復(fù)培養(yǎng)7天，溫度^TC。促進(jìn)被轟擊細(xì)胞和組織的恢復(fù)以及長(zhǎng)出新的愈傷組織，在此過(guò)程中，通過(guò)傳統(tǒng)的方法將外源基因(包括篩選標(biāo)記基因bar基因)整合進(jìn)受體的基因組中。具體實(shí)施時(shí)，篩選標(biāo)記基因也可以采用潮霉素抗性基因Hyg基因。轉(zhuǎn)化進(jìn)Hyg基因的細(xì)胞、組織和植株具有抗潮霉素的特性
實(shí)施例3
分化篩選培養(yǎng)基為V2MS培養(yǎng)基+1. 5 mg/L NAA +1.5 mg/L KT +20g/L蔗糖+ 3 g/ L植物凝膠+3 mg/L Basta, pH調(diào)至6. 0 (由于實(shí)施例1中的篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因，對(duì)應(yīng)的分化篩選培養(yǎng)基中就含有3 mg/L Basta，當(dāng)篩選標(biāo)記基因?yàn)镠yg基因時(shí)，分化篩選培養(yǎng)基中應(yīng)該用25 mg/L的潮霉素溶液替代本實(shí)施例中的3 mg/L Basta)。具體方法
實(shí)施例2中轟擊后的愈傷組織轉(zhuǎn)至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上恢復(fù)培養(yǎng)7天后，轉(zhuǎn)移到分化篩選培養(yǎng)基上，在分化篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-20天左右，即可獲得l-2cm高的轉(zhuǎn)基因再生幼芽(圖1)。實(shí)施例4 生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+ 1 mg/L IAA+0. 5g/L麥芽提取物+20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝膠，pH調(diào)至6.0 ；其中=IAMS培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)含量減半。
將實(shí)施例3形成的幼芽接種在生根培養(yǎng)基上，7天左右開(kāi)始有不定根萌發(fā)，15天左右平均每株根數(shù)可達(dá)到3飛條，形成小麥轉(zhuǎn)基因再生幼苗(圖2)。整個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的再生培育全過(guò)程，包括幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)、轟擊幼胚形成的愈傷組織、轉(zhuǎn)基因后的愈傷組織進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)、分化篩選、和幼苗生根培養(yǎng)，用時(shí)計(jì)45-60天。實(shí)施例5
將實(shí)施例4獲得使的具有3飛條根的幼苗移栽于由河沙、泥炭土和園土三者按體積比 1 1 1的比例配制的基質(zhì)中，采取穴盤(pán)移栽，半個(gè)月左右可獲得移栽成活的幼苗。移栽的成活率可以達(dá)到95%以上。移栽成活的幼苗即可移植于盆缽，進(jìn)行常規(guī)管理。實(shí)施例6
在幼苗移栽時(shí)，剪取部分葉片，提取基因組DNA (脫氧核糖核酸)，進(jìn)行分子檢測(cè)，分子檢測(cè)為陽(yáng)性的幼苗，確定為轉(zhuǎn)基因植株。分子檢測(cè)為PCR (聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))分析方法，PCR分析是指根據(jù)目的基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，提取待選轉(zhuǎn)基因小麥的基因組DNA，以此為模版對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 能擴(kuò)增出相應(yīng)基因片段的植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。發(fā)明人從辣椒的花粉中克隆獲得了一個(gè)高賴(lài)氨酸蛋白基因，該基因已在GenBank 注冊(cè)，登記序列號(hào)為EU367999 (孫曉波，2008)。以單子葉植物高效表達(dá)載體pAHC25載體作為基本載體加以改造構(gòu)建成在單子葉植物高效的表達(dá)載體的pAHC25-c/7r Γ圖3)。根據(jù)實(shí)施例1-5的方法，獲得轉(zhuǎn)化后的再生幼苗。在幼苗移栽時(shí)，剪取部分葉片，提取基因組 DNA。根據(jù)目的基因基因的序列設(shè)計(jì)特異引物。左端引物
5' -3' GCCGGATCCATGGGTTGTGGGGAATCAAAGCACGCAG 右端引物
5’ -3’ GCCCTGCAGTTAATCTGTTTTCAAATCTGTTGT
以待測(cè)幼苗的基因組DNA為模版對(duì)目的基因cflr基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出相應(yīng)基因片段的植株為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。在圖4中，1-8為轉(zhuǎn)化后再生植株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果，9為陰性對(duì)照受體揚(yáng)麥16 PCR擴(kuò)增結(jié)果，10為陽(yáng)性對(duì)照pAHC25-cflr質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果。11為 DL2000 Marker。3、4、5、7、8號(hào)植株能擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照pAHC25_c/7r質(zhì)粒相同的基因片段，確定為轉(zhuǎn)基因植株。1、2、6號(hào)植株與陰性對(duì)照受體揚(yáng)麥16 —樣不能擴(kuò)增出與陽(yáng)性對(duì)照 pAHC25-cflr質(zhì)粒相同的基因片段，確定為非轉(zhuǎn)基因植株。
權(quán)利要求
1.一種以揚(yáng)麥16為受體的轉(zhuǎn)基因植株快速再生的培育方法，包括基因轉(zhuǎn)化，以及對(duì)轉(zhuǎn)基因后的愈傷組織進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)、分化篩選和生根培養(yǎng)，其特征在于在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)同時(shí)導(dǎo)入bar基因或Hyg基因，在分化篩選培養(yǎng)基中添加與bar基因或Hyg基因?qū)?yīng)的篩選試劑，在愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)后通過(guò)分化篩選培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織進(jìn)行一次分化篩選，再轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，使整個(gè)轉(zhuǎn)基因再生植株的培育縮短至45飛0天，具體方法是a)將揚(yáng)麥16幼胚在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天，在高滲培養(yǎng)基上培育4-5小時(shí)，進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)同時(shí)導(dǎo)入bar基因或Hyg基因，再在高滲培養(yǎng)基上培育10-15小時(shí)，最終完成前期的基因轉(zhuǎn)化；b)基因轉(zhuǎn)化后在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，再轉(zhuǎn)移至分化篩選培養(yǎng)基；c)在分化篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)15-20天，獲得轉(zhuǎn)基因再生幼苗；d)再生幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上，培養(yǎng)13-16天，形成發(fā)育良好的根系，獲得完整的轉(zhuǎn)基因再生植株；所述的分化篩選培養(yǎng)基為V2MS培養(yǎng)基+1. 5 mg/L NAA +1.5 mg/L KT +20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝膠，PH調(diào)至6. 0 ；其中，V2MS培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、鐵鹽、有機(jī)物質(zhì)的含量減半；當(dāng)篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因時(shí)，分化篩選培養(yǎng)基中添加3 mg/L Basta ；當(dāng)篩選標(biāo)記基因?yàn)镠yg基因時(shí)，分化篩選培養(yǎng)基中添加25 mg/L的潮霉素；所述的生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基+ 1 mg/L IAA+0. 5g/L麥芽提取物+20g/L蔗糖+ 3 g/L植物凝膠，PH調(diào)至6.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以揚(yáng)麥16為受體的轉(zhuǎn)基因植株快速再生的培育方法，其特征在于所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為改良的MS培養(yǎng)基，具體配方為改良MS培養(yǎng)基+ 2-4 mg /L 2,4-D + l-2g/L VBl + 150mg/L 谷氨酰胺+30g/L 蔗糖 + 3 g/L 植物凝膠，PH 調(diào)至 6. 0 ；其中，改良MS培養(yǎng)基是指添加MS基本培養(yǎng)基的大量元素、微量元素和鐵鹽，而不添加 MS基本培養(yǎng)基的有機(jī)物質(zhì)；植物凝膠為Wiytogel或Gelrite ；所述的高滲培養(yǎng)基為在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0. 2M山梨醇和0. 2M甘露醇，PH 調(diào)至6.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種以揚(yáng)麥16為受體的轉(zhuǎn)基因植株快速再生的培育方法，對(duì)轉(zhuǎn)基因后的愈傷組織進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)、分化篩選、幼苗生根培養(yǎng)，其特征在于在進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化時(shí)同時(shí)導(dǎo)入bar基因或Hyg基因，在分化篩選培養(yǎng)基中添加與bar基因或Hyg基因?qū)?yīng)的篩選試劑，在愈傷組織恢復(fù)培養(yǎng)后通過(guò)分化篩選培養(yǎng)基對(duì)愈傷組織進(jìn)行一次分化篩選，分化的幼苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，使整個(gè)轉(zhuǎn)基因再生植株的培育縮短至45~60天，將在傳統(tǒng)的小麥轉(zhuǎn)基因方法中轉(zhuǎn)基因再生植株獲得時(shí)間由4-6個(gè)月，縮短至1個(gè)半月至2個(gè)月的時(shí)間，外源基因的轉(zhuǎn)化頻率在1%左右。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102321663SQ20111027112
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者余桂紅, 周淼平, 孫曉波, 張旭, 蔣蘇, 馬鴻翔 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院