專利名稱：利用RhlA和RhlB轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)環(huán)境污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物修復(fù)領(lǐng)域,涉及來自于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)中的鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶RhlA和RhlB基因序列表達(dá)載體的構(gòu)建，尤其涉及利用農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)將RhlA和RhlB基因轉(zhuǎn)化到植物中，從而促使植物對烷烴類有機(jī)物和有毒金屬污染的環(huán)境修復(fù)能力。
背景技術(shù)：
隨著工農(nóng)業(yè)的迅速發(fā)展和城市人口的劇增，環(huán)境污染問題日益突出。污染環(huán)境的修復(fù)已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點問題。在各種各樣的環(huán)境污染治理技術(shù)中，生物修復(fù)以其處理費(fèi)用低、操作簡單、處理效果，并且不易造成二次污染等特點而受到越來越多的關(guān)注。生物修復(fù)至今僅有30多年的研究歷史，但是20世紀(jì)80年代以后，一些生物修復(fù)技術(shù)已經(jīng)開始在污染環(huán)境治理中推廣應(yīng)用并取得了良好的效果。近年來，利用微生物、植物修復(fù)污染環(huán)境的生物修復(fù)技術(shù)成為研究的熱點。在利用微生物催化降解有機(jī)污染物，從而修復(fù)被污染環(huán)境的過程中，由于所使用的生物表面活性劑可以直接使用發(fā)酵液，能節(jié)省表面活性劑的分離提取和產(chǎn)品純化成本，因此，生物表面活性劑在現(xiàn)場生物修復(fù)有機(jī)污染場地的應(yīng)用潛力很大。國外對生物修復(fù)的研究大約起始于20世紀(jì)80年代初期，至今已有大量成功的工程實例。如Harvey等將銅綠假單胞菌生產(chǎn)的海藻糖脂，加入Exxon Valdez號油輪在阿拉斯加威廉王子海灣造成的原油泄漏污染的海水中，大大提高了原油的降解速度。這也是目前為止規(guī)模最大的實際應(yīng)用中最成功的現(xiàn)場生物修復(fù)。而在國內(nèi)還未見有將生物表面活性劑成功用于環(huán)境污染物治理方面的報道。許多化學(xué)合成表面活性劑由于難降解、有毒及在生態(tài)系統(tǒng)中的積累等性質(zhì)而破壞生態(tài)環(huán)境，相比之下，生物表面活性劑則由于易生物降解、對生態(tài)環(huán)境無毒等特性而更適合于環(huán)境工程中污染治理。如:在廢水處理工藝中可作為浮選捕收劑與帶電膠粒相吸以除去有毒金屬離子，修復(fù)受有機(jī)物和重金屬污染的場地等。生物表面活性劑是微生物在一定條件下培養(yǎng)時，在代謝過程中分泌的具有表面活性的代謝產(chǎn)物。與化學(xué)合成表面活性劑相比，生物表面活性劑具有許多獨特的屬性，如:結(jié)構(gòu)的多樣性、生物可降解性、廣泛的生物活性及對環(huán)境的溫和性等。由于化學(xué)合成表面活性劑受原材料、價格和產(chǎn)品性能等因素的影響，且在生產(chǎn)和使用過程中常會嚴(yán)重污染環(huán)境及危害人類健康。因此，隨著人類環(huán)保和健康意識的增強(qiáng)，近二十多年來，對生物表面活性劑的研究日益增多，發(fā)展很快，國外已就多種生物表面活性劑及其生產(chǎn)工藝申請了專利。植物修復(fù)技術(shù)以其安全、廉價等特點而成為國際環(huán)保產(chǎn)業(yè)的生長點。未來五年中，國際植物修復(fù)市場可以達(dá)到20多億美元。發(fā)達(dá)國家的植物修復(fù)技術(shù)已開始進(jìn)入商業(yè)化初期階段，已有近100家企業(yè)開始涉足植物修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。如美國已有10多項植物修復(fù)技術(shù)方面的專利，且已經(jīng)開 始進(jìn)行工程化應(yīng)用。目前，全國重金屬污染的耕地面積達(dá)2000萬hm2,約占耕地總面積的1/5，導(dǎo)致每年有1000萬t糧食的重金屬含量超標(biāo)，而且減產(chǎn)糧食1000萬t，兩者直接經(jīng)濟(jì)損失達(dá)200多億元。此外，我國還有大量工礦區(qū)土地和城市土地等非耕地受重金屬的污染。這些污染直接影響農(nóng)產(chǎn)品的衛(wèi)生品質(zhì)和地下水、地表水、大氣等環(huán)境質(zhì)量，對工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、居民生活和人類健康已造成巨大的危害。尤其是中國加入WTO之后，農(nóng)產(chǎn)品的重金屬超標(biāo)問題對為我國農(nóng)業(yè)的沖擊更大。因此，土壤重金屬污染的治理是我國當(dāng)前急需解決的任務(wù)。與傳統(tǒng)的化學(xué)和物理治理技術(shù)相比，植物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、簡便和無二次污染等優(yōu)點，不僅可以修復(fù)污染土壤，而且有可能通過資源化利用而取得一定經(jīng)濟(jì)效益因此是一項非常適合國情的實用技術(shù)，具有廣闊的應(yīng)用前景。鼠李糖脂是銅綠假單胞菌代謝的一種生物表面活性劑。研究表明，鼠李糖脂在環(huán)境污染修復(fù)中有著巨大的應(yīng)用潛力。(I)如促進(jìn)烷烴類物質(zhì)的降解。烷烴是石油的主要組成成分。在石油勘探、開米、運(yùn)輸、加工及儲存過程中， 不可避免地會有石油排入環(huán)境中而對土壤、地下水造成污染。為了提高烷烴的降解速率，加入生物表面活性劑能夠增強(qiáng)疏水性化合物的親水性和生物可降解性，增加微生物的數(shù)量，繼而提高烷烴的降解速率。Noordman等研究了不同類型表面活性劑對十六烷的降解作用，結(jié)果表明生物表面活性劑鼠李糖脂對十六烷的降解作用明顯優(yōu)于其他十四種化學(xué)合成表面活性劑。Rahman等發(fā)現(xiàn)分別添加0.1%和I %鼠李糖脂的堆制系統(tǒng)中，汽油污染土壤中碳?xì)浠衔锏慕到饴史謩e提高了 11.9% 45.2%和20.2% 48.3%。最近Rahman等在研究儲油罐底部泥狀沉積物與土壤混合堆制過程中正構(gòu)烷烴的降解情況時，也發(fā)現(xiàn)添加鼠李糖脂能顯著增加烷烴的降解率。(2)同時，鼠李糖脂也可以用于除去有毒金屬。由于有毒金屬在土壤環(huán)境中的污染過程具有隱蔽性、穩(wěn)定性及不可逆性等特點，因此，土壤中有毒金屬污染的修復(fù)一直是學(xué)術(shù)界的熱點研究課題。目前可以用玻璃化、固定化/穩(wěn)定化、熱處理等技術(shù)除去土壤中的重金屬。玻璃化處理技術(shù)可行，但是工程量大，費(fèi)用高；固定化過程具有可逆性，因此處理后還需要不間斷地監(jiān)測處理效果；而熱處理技術(shù)則只適用于除去易揮發(fā)的重金屬如Hg等。因此，低成本的生物學(xué)處理方法發(fā)展很快。近年來，人們開始利用對生態(tài)環(huán)境無毒的生物表面活性劑修復(fù)受重金屬污染土壤。Torrens等的實驗結(jié)果表明,添加鼠李糖脂使Cd的去除率提高了 8% 54%。Mulligan等分別使用三種不同的生物表面活性劑沖洗受重金屬CiuZn污染的沉積物。三種生物表面活性劑對重金屬的去除效果都不同:0.5%的鼠李糖脂對Cu的去除效果較好，去除率為65% ；4%的槐糖脂則對Zn的去除效果較好，為60% ;而莎梵婷對兩者均無多大效果，去除率僅為15%和6%。并研究了重金屬在沉積物中賦存形態(tài)量的變化，其中，鼠李糖脂和莎梵婷主要除去了有機(jī)結(jié)合態(tài)的Cu，槐糖脂主要除去了氧化物結(jié)合態(tài)和碳酸鹽結(jié)合態(tài)的Zn。這一研究結(jié)果也證實了用生物表面活性劑沖洗沉積物除去其中有毒金屬的方法是可行的。本項發(fā)明利用基因工程技術(shù)培育高效安全修復(fù)各種環(huán)境污染如有毒金屬及有機(jī)物污染的植物。本發(fā)明將來自于銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)中的鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶基因(RhlA和RhlB)轉(zhuǎn)化到植物中，提供植物對環(huán)境污染的修復(fù)能力，為烷烴類有機(jī)物和有毒金屬的環(huán)境污染修復(fù)提供了廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述利用植物修復(fù)環(huán)境污染(烷烴類物質(zhì)和有毒金屬)污染物(烷烴類物質(zhì)和重金屬)的問題，促使植物對其的降解，本發(fā)明的一個目的在于公開一種帶有微生物鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)基因序列的載體。本發(fā)明又一個目的在于公開一種帶有微生物鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)基因序列的載體構(gòu)建方法。本發(fā)明再一個目的在于公開一種利用農(nóng)桿菌將鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RH1B)基因轉(zhuǎn)入植物并促使降解烷烴類物質(zhì)和有毒金屬污染。本發(fā)明所述的帶有微生物鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RH1B)基因序列的載體通過以下方法構(gòu)建:1、鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)基因的合成根據(jù)Genbank登錄的銅綠假單胞菌鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶RhlA和RhlB亞基基因序列(Genbank N0.PSERHTR),具體合成方法參考:Ai_Sheng Xiong, Quan-Hong Yao, R1-HePeng,Xian Li，Hu1-Qin Fan，Zong-Ming Cheng and Yi Li，Nucleic AcidResearch,2004,32(12),98:l-10o化學(xué)合成的RhlA基因和RhlB基因表達(dá)盒的核苷酸及編碼的氨基酸序列見圖1和圖2。2、鼠李糖脂生物合成中2個基因的改造及融合基因構(gòu)建基因合成設(shè)計原則包括:按植物偏愛密碼子，避免基因中出現(xiàn)ATTTA等PolyA加尾信號，避免6個或更多的連續(xù)的A+T序列，避免5個或更多的G+C序列，G+C的比例40 60%，防止內(nèi)含子切割序列，減少基因內(nèi)部的兩級結(jié)構(gòu)hairpins，避免2、3位用CG和TA雙寡核苷酸(CG在植物中易造成甲基化)。合成基因所需要的引物見表I和表2，內(nèi)側(cè)的引物1.5pmol，外側(cè)的兩 個引物濃度為30pmol。PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物經(jīng)回收，克隆和測序。3、RhlA和RhlB亞基基因表達(dá)盒植物雙元載體構(gòu)建先將SRhlA表達(dá)單元的EcoRI+BamHI酶切片段插入到pcamBIA1301載體的相應(yīng)酶切點間，構(gòu)成載體pcamBIA1310 (SRhlA)。隨后再將SRhlB表達(dá)單元的BamHI+Hindlll酶切片段插入到pcamBIA1310 (SRhlA)載體的相應(yīng)酶切點間，最終構(gòu)成雙價基因植物表達(dá)載體pcamBIA1310(SRhlA+SRhlB)(見圖3)獲得RhlA和RhlB亞基基因表達(dá)盒植物雙元載體構(gòu)建。4、表達(dá)載體在上述步驟2之后，通過質(zhì)粒純化得到該表達(dá)載體。5、轉(zhuǎn)化植物本發(fā)明所述的利用農(nóng)桿菌將鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中方法的具體步驟為:本發(fā)明所述的利用農(nóng)桿菌將三苯甲烷還原酶表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中方法的具體步驟為:(I)載體的導(dǎo)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備-電擊法導(dǎo)入載體-培養(yǎng)(2)轉(zhuǎn)化植物農(nóng)桿菌蘸花法轉(zhuǎn)化將鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)基因轉(zhuǎn)化到擬南芥中的具體方法參考:Plant J.1998，16,735-743農(nóng)桿菌介導(dǎo)將鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)轉(zhuǎn)化到水稻中的具體方法參考:劉巧全，植物生理學(xué)報，1998，24 (3)，259-271
通過上述方法轉(zhuǎn)化的攜帶有鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)的植物能持續(xù)表達(dá)產(chǎn)生生物活化劑鼠李糖脂，并能促使植物參與烷烴類物質(zhì)和重金屬污染的降解，驗證了轉(zhuǎn)基因植物對烷烴類物質(zhì)和有毒金屬污染的降解功能。從而可以為植物修復(fù)烷烴類有機(jī)物物質(zhì)和有毒金屬環(huán)境污染提供有益的幫助。


圖1擴(kuò)增得到目的基因的片段(A)RhlA(B)RhlB圖2RhlA和RhlB雙價基因植物表達(dá)載體1301 (SRhlA+SRhlB)圖3轉(zhuǎn)基因擬南芥Gus染色圖片圖4轉(zhuǎn)基因擬南芥DNA抽提后的PCR電泳5轉(zhuǎn)基因擬南芥的RNA水平的鑒定圖6轉(zhuǎn)基因水稻Gus染色圖片圖7轉(zhuǎn)基因水稻DNA抽提后的PCR電泳8轉(zhuǎn)基因水稻的RNA水平的鑒定圖9轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥在不同鋁離子濃度下的生長情況圖10轉(zhuǎn)基因水稻和對照中花水稻與300 μ mol/L鋁離子脅迫下的生長情況
具體實施例方式以下結(jié)合附圖詳細(xì)描述本發(fā)明的技術(shù)方案。本發(fā)明實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍,其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。本發(fā)明所用的試劑若未經(jīng)說明,均購自西格瑪-奧德里奇(Sigma-Aldrich)公司。本發(fā)明中常規(guī)的分子生物學(xué)操作具體參見《分子克隆》(Molecular Cloning.2nded.Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)實施例1:銅綠假單胞菌鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶RhlA和RhlB亞基基因植物表達(dá)盒的化學(xué)合成根據(jù)Genbank登錄的銅綠假單胞菌鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶RhlA和RhlB亞基基因序列(Genbank N0.PSERHTR)，用本實驗室建立的基因化學(xué)合成技術(shù)(Xiong 2004)，在不改變RhlA和RhlB亞基基因編碼的氨基酸序列的前提下，按以下原則進(jìn)行合成基因編碼區(qū)的設(shè)計:(一)優(yōu)化基因密碼子，提高基因翻譯效率。(二)消除基因內(nèi)部的常用限制性內(nèi)切酶的識別位點，便于表達(dá)盒構(gòu)建。(三)消除逆向重復(fù)序列、莖環(huán)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄終止信號，使基因內(nèi)部的GC/AT均衡，提高RNA的穩(wěn)定性。(四)使基因編碼蛋白符合N端原則(Tobias 1991)，以提聞翻譯蛋白的穩(wěn)定性。(五)設(shè)計提聞基因5’端的自由能，以提聞基因翻譯起始效率。同時，分別在RhlA和RhlB亞基基因編碼區(qū)的上下游添加CAMV 35S+TMV Omega leadersequence和Nos終止子序列。最終設(shè)計并合成的RhlA基因植物表達(dá)盒(SRhlA)的長度為1639bp,其中 CAMV 35S+TMV Omega leader sequence 的長度為 498bp, RhlA 基因編碼區(qū)的長度為888bp，Nos終止子的長度253bp，為了便于隨后的遺傳操作，在SRhlA表達(dá)盒的兩側(cè)分別引入了 EcoRI和BamHI酶切點；RhlB基因植物表達(dá)盒(SRhlB)的長度為2032bp，其中CAMV 35S+TMV Omega leader sequence 的長度為 498bp，RhlB基因編碼區(qū)的長度為 1281bp， Nos終止子的長度253bp，在SRhlB表達(dá)盒的兩側(cè)分別引入了 BamHI和HindIII酶切點。兩 個合成的基因表達(dá)盒的序列分別見表I和表2。

實施例2:鼠李糖脂生物合成中2個基因的改造及融合基因構(gòu)建鼠李糖脂合成系統(tǒng)的2個基因的全合成設(shè)計及化學(xué)合成。序列的合成見表3和表
4。表3合成RhlA基因需要的引物，紅色表示正向引物，藍(lán)色表示反向引物，陰影部分
表示的是BamHI和SacI位點
權(quán)利要求
1.一種鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)植物表達(dá)載體，其特征在于分別在RhlA和RhlB亞基基因編碼區(qū)的上下游添加CAMV 35S+TMV Omega leader sequence和Nos終止子序列。最終設(shè)計并合成的RhlA基因植物表達(dá)盒(SRhlA)的長度為1639bp，其中CAMV 35S+TMVOmega leader sequence的長度為498bp, RhlA基因編碼區(qū)的長度為888bp, Nos終止子的長度253bp，為了便于隨后的遺傳操作，在SRhlA表達(dá)盒的兩側(cè)分別引入了 EcoRI和BamHI酶切點；RhlB基因植物表達(dá)盒(SRhlB)的長度為2032bp，其中CAMV 35S+TMV Omega leadersequence的長度為498bp，RhlB基因編碼區(qū)的長度為1281bp，Nos終止子的長度253bp，在SRhlB表達(dá)盒的兩側(cè)分別引入了 BamHI和HindIII酶切點。
2.一種鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)基因植物表達(dá)載體的用途，其特征在于將如權(quán)利要求2所述鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)基因植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到植物中，促使了其降解烷烴類物質(zhì)和有毒金屬的污染。本說明書中以酸性土壤中廣泛存在的鋁離子Al3+為功能分析案 例。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根據(jù)偏愛密碼子優(yōu)化合成并構(gòu)建了鼠李糖脂轉(zhuǎn)移酶(RhlA和RhlB)序列植物載體，進(jìn)行了農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)化的擬南芥植物能持續(xù)表達(dá)鼠李糖脂生物活化劑，并促使植物對烷烴類物質(zhì)和重金屬污染的降解，從而可以為植物修復(fù)烷烴類物質(zhì)和有毒金屬污染的環(huán)境提供有益的幫助。
文檔編號C12N15/66GK103146742SQ20111027115
公開日2013年6月12日 申請日期2011年9月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月5日
發(fā)明者薛永 申請人:無錫柏歐美地生物科技有限公司