專利名稱：雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白(MP II)基因的克隆方法。
背景技術(shù)：
多毛類隸屬于環(huán)節(jié)動物門，是廣泛分布于海洋近岸和河口潮灘的優(yōu)勢底棲動物， 也是海洋生態(tài)系統(tǒng)能量流動和物質(zhì)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)。由于其具有體型大、生命周期長、行動緩慢、分布廣泛，對許多持久性污染物具有較強的耐受性和生物利用性，因此一直作為海洋沉積環(huán)境污染評價的指示生物和毒理研究的模型動物。如Bryan等發(fā)現(xiàn)雜色沙蠶i^ereis diversicolor)暴露于Cd2+192 h LC50達到100 mg/L，遠超過一般海洋無脊椎動物的耐受范圍(0. 1 10mg/L)。有研究表明，在沉積環(huán)境中，雜色沙蠶對鋅和鎘的耐受濃度分別可達到100 3000 μ g/g和0. 2 9. 3 μ g/g，體內(nèi)蓄積量亦可分別達到130 350 μ g/g和 0. 08 3. 6 μ g/g ο許多資料證實，幾乎所有脊椎動物和大多數(shù)無脊椎動物，經(jīng)重金屬誘導后均能合成大量金屬硫蛋白，參與細胞內(nèi)金屬水平的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)、重金屬解毒以及清除自由基等生物學功能。多毛類雜色沙蠶暴露于鎘后可形成金屬結(jié)合蛋白，分析表明，其是類似于血紅蛋白 (hemerythrin, Hr)或肌紅蛋白(myohemerythrin，Mhr)家族的呼吸蛋白，稱為MP II，主要承擔長期慢性重金屬暴露條件下的解毒作用，研究表明金屬結(jié)合蛋白不僅能夠與鎘相結(jié)合，還具有與鋅和銅結(jié)合的能力，具有明顯的抗菌活性。雙齒圍沙蠶iPerinereis aibuhitensis)在遼東灣潮間帶底棲生物中為優(yōu)勢種， 其金屬結(jié)合蛋白(MP II)基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中已有記載，該基因cDNA的序列全長 904個堿基，其中閱讀框為357個堿基，編碼119個氨基酸，3’端非翻譯區(qū)為463個堿基，5’ 端非翻譯區(qū)有81個堿基。所記載的序列如下
1ccaactgagtttaatcactaacttgagaaagcaattttaactttgtgactcgagttcagc61gcagctcagcacaccttcaagatgggttacgatattcctgaaccattcaagtgggacgag121tccttcaaggtcttctatgacatgctcgatgatgagcacaagcagatcttcaacgccatc181ttcgatgtctgcggtggaaacaacgctaacaacctcaagaagatgatcgaagttactgcc241aaccacttcaaggatgaggagggcatgatggtctctgccaagtatgccgacttcgactcc301cacaagaagaagcacgaggacttcttggccgtcatccgtggcctctctgctcccgtcccc361gacgacaagatcaagtacgccaaggaatggctcgtcaaccacatcaagggaaccgacttc421cagtacaagggcaagttgtaaacagcgcgccatgacgcaaagtgccacctagctgttagt481gtcgtttcagcgggcgagagtgacgctcctggtggtcaacagcaaaactaCgtgtCgttg541tgtgcaaaatgaatgactgtccctgttagtcagttgtcgtcaccctacgcagcgttttct601acacctggcagcttcgtgttaatttctcagccgattagtattaagaacttgccaagatta661tgagcaaaaactactcgcagaaaaactcatcaaaattcacggacagtttccttaagatca721gacaaaataagatcattataaacaggaccttaacatctggtgtcctttgtcacacttaag781 gtattatttc tctcgtcaat cacatcctaa caatgcaatg tatatattct acattgatta 841 attttggaat ttgtgaatct tgtgtgttac attttaataa actctgcttt tctaaaaaaa 901 aaaa 氨基酸序列描述
MGYDIPEPFKWDESFKVFYDMLDDEHKQIFNAIFDVCGGNNANNLKKMIEVTANHFKDEEGMMVSAKYADFDS HKKKHEDFLAVIRGLSAPVPDDKIKYAKEWLVNHIKGTDFQYKGKL
迄今為止，關(guān)于雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白(MP II)的研究主要還是集中于其蛋白水平的檢測和分析，還未有克隆基因的報道，以至于無法深入研究其功能特征、調(diào)節(jié)機理等，影響了雙齒圍沙蠶在環(huán)境保護中的廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是為了解決現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述技術(shù)問題，提供一種雙齒圍沙蠶雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法。本發(fā)明的技術(shù)解決方案是一種雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下列步驟進行
a.提取及純化雙齒圍沙蠶總RNA，合成cDNA第一鏈；
b.應(yīng)用一對引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)對雙齒圍沙蠶cDNA第一鏈進行擴增 所述正向引物 5 ‘ -CGAGTCCTTCCAGGTCTTC-3 ‘，
所述反向引物 5 ‘ -TCGGTCTTCTTCTTGTGGG-3 ‘；
c.應(yīng)用5' RACE PCR引物對聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物，進行5' RACE擴增，得到雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列；
所述 5 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -CATCCTTGAAGTGGTTGGCAGTA-3 ‘； 所述 5 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -CTTGAGGTTGTTAGCGTTGTTTC-3 ‘；
d.應(yīng)用3' RACE PCR引物對聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物，進行3' RACE擴增，得到雙齒圍沙蠶cDNA3 ‘端序列；
所述 3 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -TGGAAACAACGCTAACAACCTCA-3 ‘； 所述 3 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -ACCACTTCAAGGATGAGGAGGGC-3 ‘；
e.將雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列與雙齒圍沙蠶cDNA3‘端序列拼接，即獲得雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因。本發(fā)明首次從雙齒圍沙蠶中克隆到金屬結(jié)合蛋白(MP II)基因，可利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測雙齒圍沙蠶在受到重金屬等污染物脅迫下MP II基因表達的規(guī)律，為探討重金屬對雙齒圍沙蠶MP II基因調(diào)控的作用機理提供依據(jù)，亦為篩選海洋沉積環(huán)境污染早期生態(tài)風險預測的分子生物標志物奠定基礎(chǔ)，利于成本低、來源豐富的雙齒圍沙蠶在環(huán)境保護中廣泛應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明實施例雙齒圍沙蠶總RNA純化后的電泳圖。圖2為本發(fā)明實施例雙齒圍沙蠶MP II cDNA部分片段的擴增電泳圖。圖3為本發(fā)明實施例雙齒圍沙蠶MP II 3'端快速擴增片段的電泳圖。
圖4為本發(fā)明實施例雙齒圍沙蠶MP II 5'端快速擴增片段的電泳圖。
具體實施例方式實施例1
雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法如下 一.提取及純化雙齒圍沙蠶總RNA，合成cDNA第一鏈；
1.總RNA的提取及純化利用hvitrogen公司的Trizol。所提取及純化后的總RNA 電泳圖如圖1所示。其中，M為分子量標記，1-2為純化后的總RNA。2. cDNA 第一鏈合成利用 Takara RNA PCR Kit (AMV)Ver. 3. O 試劑盒，將下列試劑混合
Mgcl22μ 1IOX反轉(zhuǎn)錄緩沖液1 μ 1Rnase Free dH203. 75 μ 1dNTP1 μ 1RNA酶抑制劑0. 25 μ 1AMV反轉(zhuǎn)錄酶0. 5 μ 1接頭引物Oligo dT0. 5 μ 1總RNA1 μ 1總體積10 μ 1反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件30°C10分鐘，42 °C 30分鐘，99 °C 5分鐘，5°C 5分鐘終止反應(yīng)。 二.應(yīng)用一對引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)對雙齒圍沙蠶cDNA第一鏈進行擴增
根據(jù)已知近源物種雜色沙蠶(Afereil5 /i^r1SicWor )Cd結(jié)合蛋白(MP II )部分基因序列，設(shè)計并合成引物為
正向引物 5 ‘ -CGAGTCCTTCCAGGTCTTC-3 ‘， 反向引物 5 ‘ -TCGGTCTTCTTCTTGTGGG-3 ‘； 鏈式聚合酶反應(yīng)試劑與條件 將下列試劑混合
5 X PCR反應(yīng)緩沖液10 μ 1dH2028. 75 μ 1Ex TaqHS0. 25 μ 1正向引物0. 5 μ 1反向引物0. 5 μ 1
cDNA10 μ 1
總體積50 μ 1
PCR反應(yīng)條件為94°C變性2分鐘；然后30循環(huán)，94°C 30秒，49°C 30秒，72 °C 30秒； 72°C延伸10分鐘。 序列測定與同源檢索PCR產(chǎn)物送由寶生物工程(大連)有限公司測序，將所得序列與GenBank中的序列比較，兩者相同。所合成的cDNA第一鏈擴增電泳圖如圖2所示，其中， M 分子量標記，1-3為陰性對照，4-6為擴增的部分片段。
三.設(shè)計并合成5' RACE PCR引物，應(yīng)用5' RACE PCR引物對聚合酶鏈式反 應(yīng)產(chǎn)物(cDNA)，進行5' RACE擴增，得到雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列； 所述 5 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -CATCCTTGAAGTGGTTGGCAGTA-3 ‘； 所述 5 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -CTTGAGGTTGTTAGCGTTGTTTC-3 ‘； 以試劑盒提供的 5，RACE Outer PCR Primer 引物(5，-CATCCTTGAAGTGGTTGGCAGTA-3，) 和5’ RACE PCR正向引物作為ー對引物；
以試劑盒提供的 5，RACE Inner PCR Primer 引物(5，-CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCA GTCGATG-3’ )和5，RACE PCR反向引物作為ー對引物。 將下列反應(yīng)試劑混合在一起 Outer PCR反應(yīng)體系
cDNA2 u 1
IXcDNA Dilution Buffer II8 u 1
10XLA PCRBuffer II (Mg2+ Free)4 u 1
MgCl2 (25mM)3 u 1
LA Taq (5U/ml)0. 25 U 1
正向引物(IOpM)2 u 1
5' RACE Outer Primer (IOuM)2 u 1
dH2028. 75 u 1
總體積50 u 1 Inner PCR反應(yīng)體系
Outer PCR S應(yīng)液1 y 1
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Free)5 u 1
MgCl2 (25mM)5 u 1
dNTP (2. 5mM each)8 u 1
LA Taq (5U/ml)0. 5 U 1
反向引物(IOPM)2 u 1
5' RACE Inner Primer (10 u M)2 y 1
dH2026. 5 u 1
總體積50 u 1 5’端PCR反應(yīng)條件為
5'RACE Outer Primer和正向引物為ー對引物進行Outer PCR擴增，反應(yīng)條件94°C變 性3分鐘；然后30循環(huán)98°C 15秒，62°C 30秒，72°C 90秒；最后72°C延伸10分鐘。5’ RACE Inner Primer和反向引物為一對引物進行hner PCR擴增，反應(yīng)條件 94°C變性3分鐘；然后30循環(huán)98°C 15秒，58°C 30秒，72°C 70秒；最后72°C延伸10分鐘。序列測定與同源檢索5' RACE PCR產(chǎn)物送由寶生物工程(大連)有限公司測序， 將所得序列與GenBank中的序列比較，兩者相同。雙齒圍沙蠶cDNA5'端快速擴增片段的電泳圖如圖4所示。其中M 分子量標記，1為5'端擴增的片段，2為陰性對照。四.應(yīng)用3' RACE PCR引物對聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物(cDNA)，進行3' RACE擴增， 得到雙齒圍沙蠶cDNA3'端序列所述 3 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -TGGAAACAACGCTAACAACCTCA-3 ‘； 所述 3 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -ACCACTTCAAGGATGAGGAGGGC-3 ‘； 上述正向引物和試劑盒提供的3，RACE Outer Primer引物 (5，-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3，)作為一對引物，上述反向引物 (5，-ACCACTTCAAGGATGAGGAGGGC-3，)和試劑盒提供的 3，RACE Inner Primer 引物(5，-CGC GGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGC-3，)作為一對引物。
將下列反應(yīng)試劑混合在一起
Outer PCR反應(yīng)體系
cDNA2 μ 1
IXcDNA Dilution Buffer II8 μ 1
正向引物(ΙΟμΜ)2 μ 1
3' RACE Outer Primer(ΙΟμΜ) 2 μ 1
2X GC Buffer I25 μ 1
LA Taq (5 U/ml)0. 5μ 1
dH2010. 5 μ 1
總體積50 μ 1 Inner PCR反應(yīng)體系
Outer PCR 反應(yīng)液1 μ 1
dNTP (2. 5 mM each)8 μ 1
反向引物(ΙΟμΜ)2 μ 1
3' RACE Inner Primer(10 μ M) 2 μ 1
2X GC Buffer I25 μ 1
LA Taq (5 U/ml)0. 5μ 1
dH2011. 5μ 1
總體積50 μ 1
3，端PCR反應(yīng)條件為3，RACE Outer Primer和正向引物進行Outer PCR擴增，反應(yīng)條件94°C變性3分鐘；然后30循環(huán)94°C 30秒，62°C 30秒，72°C 90秒；最后72°C延伸10 分鐘。3' RACE Inner Primer和反向引物為引物進行hner PCR，反應(yīng)條件94°C變性3分鐘；然后30循環(huán)94°C 30秒，65°C 30秒，72°C 1分鐘；最后72°C延伸10分鐘。序列測定與同源檢索3’ RACE PCR產(chǎn)物送由寶生物工程(大連)有限公司測序，將所得序列與GenBank中的序列比較，兩者相同。雙齒圍沙蠶cDNA3'端快速擴增片段的電泳圖如圖3所示。其中M 分子量標記，1-2為3'端擴增的片段，3為陰性對照。五.將雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列與雙齒圍沙蠶cDNA3 ‘端序列拼接，即獲得雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因全長核苷酸序列。
權(quán)利要求
1. 一種雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法，其特征在于按下列步驟進行a.提取及純化雙齒圍沙蠶總RNA，合成cDNA第一鏈；b.應(yīng)用一對引物通過聚合酶鏈式反應(yīng)對雙齒圍沙蠶cDNA第一鏈進行擴增 所述正向引物 5 ‘ -CGAGTCCTTCCAGGTCTTC-3 ‘，所述反向引物 5 ‘ -TCGGTCTTCTTCTTGTGGG-3 ‘；c.應(yīng)用5'RACE PCR引物對聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物，進行5' RACE擴增，得到雙齒圍沙蠶cDNA5 ‘端序列；所述 5 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -CATCCTTGAAGTGGTTGGCAGTA-3 ‘； 所述 5 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -CTTGAGGTTGTTAGCGTTGTTTC-3 ‘；d.應(yīng)用3'RACE PCR引物對聚合酶鏈式反應(yīng)產(chǎn)物，進行3' RACE擴增，得到雙齒圍沙蠶cDNA3 ‘端序列；所述 3 ‘ RACE PCR 正向引物5 ‘ -TGGAAACAACGCTAACAACCTCA-3 ‘； 所述 3 ‘ RACE PCR 反向引物5 ‘ -ACCACTTCAAGGATGAGGAGGGC-3 ‘；e.將雙齒圍沙蠶cDNA5'端序列與雙齒圍沙蠶cDNA3‘端序列拼接，即獲得雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因。
全文摘要
本發(fā)明公開一種雙齒圍沙蠶金屬結(jié)合蛋白基因的克隆方法，是通過設(shè)計特異性片段擴增和RACE擴增的方法，從雙齒圍沙蠶體壁肌肉總RNA中克隆得到了雙齒圍沙蠶的金屬結(jié)合蛋白基因，可利用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測雙齒圍沙蠶在受到重金屬等污染物脅迫下MPⅡ基因表達的規(guī)律，為探討重金屬對雙齒圍沙蠶MPⅡ基因調(diào)控的作用機理提供依據(jù)，亦為篩選海洋沉積環(huán)境污染早期生態(tài)風險預測的分子生物標志物奠定基礎(chǔ)，利于成本低、來源豐富的雙齒圍沙蠶在環(huán)境保護中廣泛應(yīng)用。
文檔編號C12N15/10GK102304517SQ20111027116
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者何潔, 周一兵, 楊大佐, 王斌, 趙歡, 陳雪 申請人:大連海洋大學