專利名稱：用腸桿菌科的細(xì)菌產(chǎn)生l-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生L-氨基酸的方法，更具體地涉及有助于此發(fā)酵的基因。 這些基因可用于改進(jìn)L-氨基酸的生產(chǎn)，例如，L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生產(chǎn)。
背景技術(shù)：
傳統(tǒng)上，利用由天然來(lái)源獲得的微生物菌株或其突變體通過(guò)發(fā)酵方法工業(yè)化生產(chǎn) L-氨基酸。通常，修飾所述微生物以提高L-氨基酸的產(chǎn)品收率(production yield)。已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了許多提高L-氨基酸產(chǎn)品收率的技術(shù)，包括用重組DNA轉(zhuǎn)化微生物(參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利4，278，76 。其它提高產(chǎn)品收率的技術(shù)包括增加涉及氨基酸生物合成的酶的活性和/或使目標(biāo)酶對(duì)所得L-氨基酸的反饋抑制脫敏(desensitize)(參見(jiàn)，例如，WO 95/16042 或美國(guó)專利 4，346，170,5, 661，012 和 6，040，160)。用于通過(guò)發(fā)酵生產(chǎn)L-蘇氨酸的菌株是已知的，包括涉及L-蘇氨酸生物合成的酶的活性增加的菌株(美國(guó)專禾U 5，175，107,5,661,012,5, 705, 371和5，939，307 ；EP 0219027)、對(duì)化學(xué)品如L-蘇氨酸及其類似物有抗性的菌株(W001/14525A1、EP 301572A2、 美國(guó)專利5，376，538)、具有對(duì)生產(chǎn)的L-氨基酸或其副產(chǎn)物的反饋抑制脫敏的目標(biāo)酶的菌株(美國(guó)專利5，175，107和5，661，012)、以及具有失活的蘇氨酸降解酶的菌株(美國(guó)專利 5，939，307 和 6，297，031)。目前，已知的生產(chǎn)蘇氨酸的菌株VKPM B-3996(美國(guó)專利5，175，107和5，705，371) 是最好的已知的蘇氨酸生產(chǎn)菌之一。為構(gòu)建菌株VKPM B-3996，如下所述，將幾個(gè)突變和質(zhì)粒導(dǎo)入到親本菌株大腸桿菌K-12(VKPM B-7)中。突變的thrA基因(突變thrA442)編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其對(duì)蘇氨酸的反饋抑制有抗性。突變的ilvA基因(突變 ilvA442)編碼活性降低的蘇氨酸脫氨酶，其導(dǎo)致異亮氨酸生物合成速率降低和異亮氨酸饑餓的滲漏表型。在包含ilvA442突變的細(xì)菌中，thrABC操縱子的轉(zhuǎn)錄不被異亮氨酸所抑制，因此對(duì)于蘇氨酸生產(chǎn)是非常有效的。編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因的失活阻止蘇氨酸降解。將蔗糖同化的遺傳定子(genetic determinant) (scrKYABR基因)轉(zhuǎn)移到所述菌株。 為增加控制蘇氨酸生物合成的基因的表達(dá)，將包含突變的蘇氨酸操縱子thrA442BC的質(zhì)粒 PVIC40導(dǎo)入中間菌株TDH6中。在菌株發(fā)酵期間累積的L-蘇氨酸的量能夠多達(dá)85g/l。通過(guò)優(yōu)化所需化合物的主要生物合成途徑，借助于為細(xì)菌補(bǔ)充更大量的糖例如葡萄糖作為碳源，可以完成對(duì)L-氨基酸生產(chǎn)菌株的進(jìn)一步改善。不考慮PTS的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)效率，在高產(chǎn)菌株中獲取碳源仍然可能是不充足的。已知糖和其它代謝物向細(xì)菌細(xì)胞中的主動(dòng)運(yùn)輸由幾種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)完成。其中，來(lái)自大腸桿菌的XylE蛋白是D-木糖通透酶，大腸桿菌中兩種系統(tǒng)的其中一個(gè)負(fù)責(zé)吸收D-木糖；另一個(gè)是ATP-依賴性ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Xy 1FGH。已顯示克隆的xylE基因在體內(nèi)補(bǔ)充xylE 突變體(Davis, Ε. 0. and Henderson, P. J.，J. Biol. Chem.，262 (29) ； 13928-32 (1987)) 在整個(gè)細(xì)胞中XylE-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)由質(zhì)子載體(protonophore)所抑制，并引發(fā)堿性pH改變(Lam, V. Μ.等，J. Bacteriol. 143(1) ；396-402 (1980))。利用 xylE 和 xylF 突變體的試驗(yàn)已證實(shí)對(duì)于D-木糖，XylE蛋白具有63_169μΜ的KM(Sumiya.M.等，Receptors Channels, 3 (2) ； 117-28 (1995)) 0 XylE蛋白是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要促進(jìn)劑超家族(major facilitator superfamily) (MFS)的成員(Griffith，J. K.等，Curr. Opin. Cell Biol. 4(4)； 684-95 (1992))，看起來(lái)作為D-木糖/質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(symporter)起作用。xylE基因可能構(gòu)成單順?lè)醋硬倏v子，其表達(dá)由D-木糖所誘導(dǎo)。輸入的木糖在XylA(木糖異構(gòu)酶)和 XylB(木酮糖激酶)酶的作用下異化為5-磷酸木酮糖。在合適的條件下，由xylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶還有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的轉(zhuǎn)化(Wovcha，Μ. G.等，Appl Environ Microbiol. 45(4) 1402-4 (1983))。然而，迄今還沒(méi)有利用腸桿菌科(Enterobacteriaceae family)的細(xì)菌增加L-氨基酸的生產(chǎn)的報(bào)導(dǎo)，所述腸桿菌科的細(xì)菌具有增強(qiáng)的D-木糖通透酶活性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是增加產(chǎn)生L-氨基酸的菌株的生產(chǎn)力，以及提供用這些菌株生產(chǎn)非芳族或芳族L-氨基酸的方法。通過(guò)發(fā)現(xiàn)增加編碼D-木糖通透酶的xylE基因的表達(dá)能增強(qiáng)L-氨基酸如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸和L-谷氨酸的生產(chǎn)而實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)。由此完成了本發(fā)明。本發(fā)明的目的是提供腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)改造以增強(qiáng)D-木糖通透酶的活性。本發(fā)明的又一目的是提供上述的細(xì)菌，其中所述D-木糖通透酶的所述活性通過(guò)增加編碼D-木糖通透酶的基因的表達(dá)而增強(qiáng)。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中通過(guò)修飾編碼D-木糖通透酶的基因的表達(dá)控制序列以增強(qiáng)基因表達(dá)，或者通過(guò)增加編碼D-木糖通透酶基因的拷貝數(shù)，而增強(qiáng) D-木糖通透酶的所述活性。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強(qiáng)葡糖激酶的活性。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強(qiáng)木糖異構(gòu)酶的活性。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾而增加了 xylABFGHR位點(diǎn)的表達(dá)。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自下組菌屬埃希氏菌屬(Escherichia)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、泛菌屬(Pantoea)、普羅威登斯菌屬(ftOvidencia)、沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、志賀氏菌屬(Shigella)、和摩根氏菌屬(Morganella)。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述基因編碼選自下組的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)；和(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的變體蛋白質(zhì)，其具有D-木糖通透酶的活性。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述編碼D-木糖通透酶的基因包含選自下組的DNA:(a)包含SEQ ID NO=I中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA ；和(b)在嚴(yán)緊條件下可與SEQ ID NO 1中核苷酸1_1476的核苷酸序列或由所述核苷酸序列制備的探針雜交，并且編碼具有D-木糖通透酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述嚴(yán)緊條件包括其中在60°C在Ix SSC和0. SDS的鹽濃度下洗滌15分鐘的條件。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強(qiáng)了選自下組的基因的表達(dá)-編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I并對(duì)蘇氨酸的反饋抑制有抗性的突變thrA 基因，-編碼高絲氨酸激酶的thrB基因，-編碼蘇氨酸合酶的thrC基因，-編碼推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意組合。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾增加了所述突變thrA 基因、所述thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表達(dá)。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌。本發(fā)明的又一目的是提供上述細(xì)菌，其中所述細(xì)菌為產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌。本發(fā)明的又一目的是提供產(chǎn)生L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上述細(xì)菌， 使L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累，并從培養(yǎng)基分離L-氨基酸。本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述培養(yǎng)基包含木糖。本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸。本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-賴氨酸。本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-組氨酸。本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。本發(fā)明的又一目的是提供上述方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。具體地，本發(fā)明還涉及如下各項(xiàng)1.腸桿菌科的產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌已經(jīng)過(guò)修飾增強(qiáng)了 D-木糖通透酶的活性。2.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述D-木糖通透酶的活性通過(guò)增加編碼D-木糖通透酶的基因的表達(dá)而增強(qiáng)。3.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中通過(guò)修飾編碼D-木糖通透酶的基因的表達(dá)控制序列，或者通過(guò)增加編碼D-木糖通透酶基因的拷貝數(shù)而增強(qiáng)所述D-木糖通透酶的活性。4.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強(qiáng)了葡糖激酶的活性。5.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強(qiáng)了木糖異構(gòu)酶的活性。6.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增加了 xylABFGHR位點(diǎn)的表達(dá)。7.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌選自下組菌屬埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、普羅威登斯菌屬、沙門(mén)氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、和摩根氏菌屬。8.根據(jù)項(xiàng)2的細(xì)菌，其中所述基因編碼選自下組的D-木糖通透酶(A)包含氨基酸序列SEQ ID NO 2的蛋白質(zhì)；和(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的變體蛋白質(zhì)，其具有D-木糖通透酶活性。9.根據(jù)項(xiàng)2的細(xì)菌，其中所述編碼D-木糖通透酶的基因包含選自下組的DNA (a)包含SEQ ID NO 1中核苷酸1至1476的核苷酸序列的DNA ；禾口(b)在嚴(yán)緊條件下可與SEQ ID NO 1中核苷酸1_1476的核苷酸序列或者由所述核苷酸序列制備的探針雜交，并且編碼具有D-木糖通透酶活性的蛋白質(zhì)的DNA。10.根據(jù)項(xiàng)9的細(xì)菌，其中所述嚴(yán)緊條件包括其中在60°C在Ix SSC^PO. 1% SDS 的鹽濃度下洗滌15分鐘的條件。11.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌。12.根據(jù)項(xiàng)11的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌還經(jīng)額外修飾而增強(qiáng)了選自下組的基因的表達(dá)-編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I并對(duì)蘇氨酸的反饋抑制有抗性的突變thrA 基因，-編碼高絲氨酸激酶的thrB基因，-編碼蘇氨酸合酶的thrC基因，-編碼推定的跨膜蛋白的rhtA基因，和-其任意組合。13.根據(jù)項(xiàng)12的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾增強(qiáng)了所述突變的thrA基因、所述 thrB基因、所述thrC基因、和所述rhtA基因的表達(dá)。14.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。
15.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌。
16.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌。
17.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌。
18.根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，其中所述細(xì)菌是產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌。
19.生產(chǎn)L-氨基酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)項(xiàng)1的細(xì)菌，使所述L
酸在培養(yǎng)基中積累，并從培養(yǎng)基分離L-氨基酸。 20.根據(jù)項(xiàng)19的方法，其中所述培養(yǎng)基含有木糖。
21.根據(jù)項(xiàng)19的方法，其中所述L-氨基酸是L-蘇氨酸。22.根據(jù)項(xiàng)19的方法，其中所述L-氨基酸是L-賴氨酸。23.根據(jù)項(xiàng)19的方法，其中所述L-氨基酸是L-組氨酸。24.根據(jù)項(xiàng)19的方法，其中所述L-氨基酸是L-苯丙氨酸。25.根據(jù)項(xiàng)19的方法，其中所述L-氨基酸是L-精氨酸。26.根據(jù)項(xiàng)19的方法，其中所述L-氨基酸是L-谷氨酸。


圖1顯示大腸桿菌染色體中xylE基因上游區(qū)域的結(jié)構(gòu)，和包含cat基因和雜合 PL-tac啟動(dòng)子的整合DNA片段的結(jié)構(gòu)。圖2顯示在含葡萄糖的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的大腸桿菌菌株MG1655、 MG1655 Δ ptsHI-crr 和 MG1655PL_ta。xylE 的生長(zhǎng)曲線。圖例MG =大腸桿菌 MG1655 ；MG Apts =i;J ff^MG1655AptsHI-crr ；MG Apts P xylE =大腸桿菌 MG1655 Δ ptsHI-crr
PL-tacXylE°本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案本發(fā)明中，“產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌”指當(dāng)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)菌時(shí)，具有在培養(yǎng)基中生產(chǎn)和分泌L-氨基酸的能力的細(xì)菌。可以通過(guò)培育而賦予或增強(qiáng)L-氨基酸生產(chǎn)能力。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌”還指能夠以大于大腸桿菌如大腸桿菌K-12 的野生型或親本菌株的量生產(chǎn)并導(dǎo)致L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累的細(xì)菌，優(yōu)選指所述細(xì)菌能夠?qū)е略谂囵B(yǎng)基中積累不少于0. 5g/L量的，更優(yōu)選不小于1. Og/L的目標(biāo)L-氨基酸。術(shù)語(yǔ)“L-氨基酸”包括L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-蛋氨酸、 L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、和L-纈氨酸。L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸、和L-谷氨酸是特別優(yōu)選的。腸桿菌科包括屬于埃希氏菌屬、腸桿菌屬、歐文氏菌屬、克雷伯氏菌屬、泛菌屬、 Photorhabdus、普羅威登斯菌屬、沙門(mén)氏菌屬、沙雷氏菌屬、志賀氏菌屬、摩根氏菌屬、耶爾森氏菌屬(Yersinia)等的細(xì)菌。具體地，可以使用依據(jù)NCBI (National Center for Biotechnology Information)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/htbinpost/ Taxonomy/wgetorg ？ mode = Tree&id = 1236&lvl = 3&keep = l&srchmode = l&unlock) 中所用分類法歸類于腸桿菌科的那些。屬于埃希氏菌屬或泛菌屬的細(xì)菌是優(yōu)選的。短語(yǔ)“屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌”指依據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法歸類于埃希氏菌屬的細(xì)菌。如用于本發(fā)明的屬于埃希氏菌屬的微生物的例子包括但不限于大腸桿菌(E. coli)?？捎糜诒景l(fā)明的屬于埃希氏菌屬細(xì)菌沒(méi)有特別限制然而，例如Ne i dhardt， F. C.等描述的細(xì)菌(Escherichia coli and Salmonella typhimurium,American Society for Microbiology, Washington D. C.，1208，表 1)包括在本發(fā)明中。術(shù)語(yǔ)“屬于泛菌屬的細(xì)菌”指依據(jù)微生物學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的分類法歸類于泛菌屬的細(xì)菌?；?6S rRNA的核苷酸序列分析等，成團(tuán)腸桿菌(Enterobacter agglomerans)的一些菌種最近已被重新歸類于成團(tuán)泛菌(Pantoea agglomerans)、Pantoea ananatis>SfrESSlii (Pantoea stewartii) ··。 (Int. J· Syst· Bacteriol·，43， 162-173(1993))。本發(fā)明的細(xì)菌包括具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力的腸桿菌科菌株，其經(jīng)修飾增強(qiáng)了 D-木糖通透酶的活性。此外，本發(fā)明的細(xì)菌包括具有生產(chǎn)L-氨基酸的能力而不具有D-木糖通透酶天然活性，并且已經(jīng)用編碼D-木糖通透酶的DNA片段轉(zhuǎn)化的腸桿菌科的菌株。短語(yǔ)“D-木糖通透酶的活性”指將糖如木糖和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中的活性。可以通過(guò)補(bǔ)償具有破壞的糖轉(zhuǎn)運(yùn)PTS-系統(tǒng)的細(xì)菌的生長(zhǎng)延遲(參見(jiàn)，例如，實(shí)施例中描述的 AptsHI-crr 突變體)或者通過(guò)體內(nèi)補(bǔ)償 xylE 突變(Davis, Ε. 0. and Henderson, P. J.， J. Biol.Chem. ,262(29) ； 13928-32 (1987))來(lái)檢測(cè) D-木糖通透酶的活性。短語(yǔ)“細(xì)菌經(jīng)修飾增強(qiáng)了 D-木糖通透酶的活性”指每個(gè)細(xì)胞的活性高于非修飾菌株例如野生型菌株的活性。這種修飾的例子包括增加每個(gè)細(xì)胞的D-木糖通透酶分子的數(shù)目，增強(qiáng)每個(gè)D-木糖通透酶分子的比活等。另外，可用于對(duì)比目的的野生型菌株包括例如大腸桿菌K-12。本發(fā)明中，作為增強(qiáng)D-木糖通透酶的胞內(nèi)活性的結(jié)果，可以增加培養(yǎng)基中積累的L-氨基酸例如L-蘇氨酸或L-精氨酸的量?？梢酝ㄟ^(guò)增加編碼D-木糖通透酶的xylE基因的表達(dá)獲得細(xì)菌細(xì)胞中D-木糖通透酶活性的增強(qiáng)。源自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的任何xylE基因以及源自其它細(xì)菌如棒狀桿菌型細(xì)菌(coryneform bacteria)的任意xylE基因可以用作本發(fā)明中的D-木糖通透酶基因。源自屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的xylE基因是優(yōu)選的。短語(yǔ)“增加基因的表達(dá)”指基因的表達(dá)量高于非修飾的菌株例如野生型菌株的表達(dá)量。這種修飾的例子包括增加每個(gè)細(xì)胞中基因的拷貝數(shù)，提高(一個(gè)或幾個(gè))基因的表達(dá)水平等等。例如，通過(guò)限制性處理染色體DNA，然后利用基于基因序列的探針進(jìn)行 Southern印跡，熒光原位雜交(FISH)等測(cè)定基因的拷貝數(shù)。基因表達(dá)水平可以用多種方法包括Northern印跡、定量RT-PCR等測(cè)定。另外，可以當(dāng)作對(duì)照的野生型菌株包括例如大腸桿菌 K-12 或 Pantoea ananatis FERM BP-6614 (US2004180404A1)。Pantoea ananatis FERM BP-6614于1998年2月19日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology,Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry) (3獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(International Patent Organism Depositary,National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)), 給予保藏號(hào)FERM P-16644。然后依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1999年1月11日將其轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，給予保藏號(hào)FERM BP-6614。雖然該菌株在其被分離時(shí)被鑒定為成團(tuán)腸桿菌，但如上所述，基于16S rRNA的核苷酸序列分析，已經(jīng)將其重新歸類于Pantoea ananatis。作為增強(qiáng)D-木糖通透酶胞內(nèi)活性的結(jié)果，提高了 L-氨基酸例如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸或L-谷氨酸在培養(yǎng)基中的積累。已經(jīng)闡明了來(lái)自大腸桿菌的編碼D-木糖通透酶，即D-木糖/質(zhì)子同向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的xylE基因(GenBank登錄號(hào)NC 000913. 2，gi :49175990的序列中的核苷酸編號(hào)4240277 至4238802)。xylE基因位于大腸桿菌K-12染色體上yjbAORF和maW基因之間。也闡明了另一個(gè)編碼D-木糖通透酶的xylE基因(AAN45595. xylose-proton sym. . . [gi 24054686], AAM41050. MFS transporter. . . [gi :21112853]野油菜黃單胞菌(Xanthomonas
8campestris) :XCC1759)。本發(fā)明中，來(lái)自大腸桿菌的xylE基因由SEQ ID NO. 1表示。一旦被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中，葡萄糖就由葡糖激酶磷酸化，所述葡糖激酶由glk基因所編碼。因此也希望改造所述細(xì)菌以使之具有增強(qiáng)的葡糖激酶活性。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌葡糖激酶的glk基因(GenBank登錄號(hào)NC 000913. 1，gi :16127994的序列中核苷酸編號(hào) 2506481至2507446)。glk基因位于大腸桿菌K-12染色體上b2387和b23890RFs之間。在合適的條件下，由xylA基因編碼的木糖異構(gòu)酶也有效地催化D-葡萄糖向D-果糖的轉(zhuǎn)化(Wovcha, Μ. G.等，Appl Environ Microbiol. 45(4) 1402-4 (1983))。因此也希望修飾所述細(xì)菌以使之具有增強(qiáng)的木糖異構(gòu)酶活性。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌木糖異構(gòu)酶的xylA基因(GenBank登錄號(hào)NC_000913. 2，gi :49175990的序列中核苷酸編號(hào)37沘788至 3727466)。xylA基因位于大腸桿菌K-12染色體上x(chóng)ylB和xylF基因之間。當(dāng)培養(yǎng)基包含作為附加碳源的木糖時(shí)，增加木糖利用酶的活性是必需的?！澳咎抢妹浮卑咎寝D(zhuǎn)運(yùn)、木糖異構(gòu)化和木糖磷酸化的酶、以及調(diào)節(jié)蛋白。這種酶包括木糖異構(gòu)酶、木酮糖激酶、木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、和木糖轉(zhuǎn)錄激活因子(xylose transcriptional activator)。木糖異構(gòu)酶催化D-木糖到D-木酮糖的異構(gòu)化的反應(yīng)。木酮糖激酶催化利用 ATP磷酸化D-木酮糖產(chǎn)生D-木酮糖-5-磷酸(D-xylulose-5-phosphate)和ADP的反應(yīng)。 木糖利用酶如木糖異構(gòu)酶和木酮糖激酶活性的存在分別通過(guò)相應(yīng)木糖異構(gòu)酶陰性或木酮糖激酶陰性大腸桿菌突變體的補(bǔ)償來(lái)測(cè)定。編碼上述木糖利用酶的基因位于大腸桿菌染色體上x(chóng)ylABFGHR基因座中。編碼木酮糖激酶(EC編號(hào)2. 7. 1. 17)的基因是已知的，已被命名為xylBteenBank登錄號(hào) NC_000913. 1，gi =16131435的序列中核苷酸編號(hào)3725546至3727000)。編碼木糖結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的基因是已知的，已被命名為xylF(GenBank登錄號(hào)NC_000913. l,gi :16131437 的序列中核苷酸編號(hào)37觀760至37^75 。編碼木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)推定的ATP結(jié)合蛋白的基因是已知的，已被命名為xylG(GenBank登錄號(hào)NC_000913. 1，gi :16131438的序列中核苷酸編號(hào)3729830至3731371)。編碼ABC型木糖轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的通透酶成分的基因是已知的，已被命名為xylH(GenBank登錄號(hào)NC_000913. 1，gi :16131439的序列中核苷酸編號(hào)3731349至 3732530)。編碼xyl操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的基因是已知的，已被命名為XylR(GenBank登錄號(hào) NC_000913. 1，gi :16131440 的序列中核苷酸編號(hào) 3732608 至 3733786)。因此，可以利用基于所述基因的已知核苷酸序列制備的引物通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參考 White，T. J.等.，Trends Genet.，5，185 (1989))獲得 xylE、glk 和 xylABFGHR 基因座的基因。編碼其他微生物的D-木糖通透酶的基因可以按照類似的方式獲得。用編碼下述蛋白㈧或⑶的DNA例示源自大腸桿菌的xylE基因(A)具有SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；或(B)SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的變體蛋白質(zhì)，其具有D-木糖通透酶活性。如本發(fā)明中所用的短語(yǔ)“變體蛋白”指其序列有改變的蛋白質(zhì)，無(wú)論是氨基酸的缺失、插入、添加、還是取代，但其仍然保留了可用水平的所需活性，例如可用于增強(qiáng)L-氨基酸的生產(chǎn)。變體蛋白中改變的數(shù)目依賴于蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基的位點(diǎn)或類型。對(duì)于蛋白質(zhì)(A)來(lái)說(shuō)可以是2至30個(gè)，優(yōu)選2至15個(gè)，更優(yōu)選2至5個(gè)。所述變體中的這些改變可能發(fā)生在對(duì)于蛋白質(zhì)的功能來(lái)說(shuō)不重要的蛋白質(zhì)區(qū)域中。這是因?yàn)橐恍┌被岜舜司哂懈叨鹊耐葱?，這樣三維結(jié)構(gòu)或活性不受這種改變的影響。所述變體蛋白中的這些改變可能發(fā)生在對(duì)于蛋白質(zhì)的功能來(lái)說(shuō)不重要的蛋白質(zhì)區(qū)域中。因此，所述蛋白質(zhì)變體(B) 可以是相對(duì)于SEQ ID NO. 2所示的D-木糖通透酶的完整氨基酸序列來(lái)說(shuō)具有不小于70%， 優(yōu)選80 %，更優(yōu)選90 %，最優(yōu)選95 %的同源性的變體，只要保留了 D-木糖通透酶的活性。 可以用熟知的方法例如計(jì)算機(jī)程序BLAST 2.0測(cè)定兩個(gè)氨基酸序列之間的同源性，BLAST 2. 0計(jì)算三個(gè)參數(shù)分?jǐn)?shù)、同一性和相似性。編碼與上述D-木糖通透酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA可以例如通過(guò)修飾編碼D-木糖通透酶的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO=D來(lái)獲得，例如以定點(diǎn)誘變方法，使特定位點(diǎn)包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、取代、插入、或添加。如上所述修飾的DNA可以由常規(guī)已知的突變處理獲得。這種處理包括羥胺處理編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的DNA，或者用紫外線照射或試劑如N-甲基-N’ -硝基-N-亞硝基胍或亞硝酸處理包含所述DNA的細(xì)菌。一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失、插入或添加應(yīng)當(dāng)是保守性突變，以保留所述活性。代表性保守性突變是保守性取代。保守性取代的例子包括Ser或Thr取代Ala，Glru His 或 Lys 取代 Arg，Glu、Gin、Lys, His 或 Asp 取代 Asn，Asn、Glu 或 Gln 取代 Asp，Ser 或 Ala 取代 Cys，Asn、Glu、Lys, His、Asp 或 Arg 取代 Gln，Asn、Gin、Lys 或 Asp 取代 Glu，Pro 取代 Gly，Asn、Lys、Gin、Arg 或 Tyr 取代 His，Leu、Met、Val 或 Phe 取代 lie，lie、Met、Val 或 Phe 取代 Leu, Asn、Glu、Gin、His 或 Arg 取代 Lys, lie、Leu、Val 或 Phe 取代 Met, Trp, Tyr、Met、lie 或 Leu 取代 Phe, Thr 或 Ala 取代 Ser，Ser 或 Ala 取代 Thr, Phe 或 Tyr 取代 Trp, His、Phe 或 Trp 取代 Tyr，以及 Met、Ile 或 Leu 取代 Val。編碼與D-木糖通透酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA可以通過(guò)在合適的細(xì)胞中表達(dá)具有上述突變的DNA，并研究任何表達(dá)產(chǎn)物的活性而獲得。編碼與D-木糖通透酶基本相同的蛋白質(zhì)的DNA也可以通過(guò)分離DNA獲得，所述DNA可在嚴(yán)緊條件下與具有核苷酸序列的探針雜交并編碼具有D-木糖通透酶活性的蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列包含例如SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。此處所指“嚴(yán)緊條件”是在此條件下形成所謂的特異性雜合體而不形成非特異性雜合體的條件?？梢耘e例說(shuō)明所述嚴(yán)緊條件，例如，在所述嚴(yán)緊條件下，具有高度同源性的DNAs，例如具有不小于50 %同源性，優(yōu)選80 %，更優(yōu)選90 %，最優(yōu)選95 %的 DNAs能夠互相雜交，而具有低于上述同源性的DNAs不能互相雜交。或者，可以舉例說(shuō)明嚴(yán)緊條件，在所述嚴(yán)緊條件下，DNA能夠于Southern雜交中，在相當(dāng)于常規(guī)洗滌條件的鹽濃度下雜交，即Ix SSC、0. SDS，優(yōu)選0. Ix SSC、0. SDS、60°C。洗滌的持續(xù)時(shí)間依賴于用于印跡的膜的類型，通常是制造商所推薦的。例如，在嚴(yán)緊條件下，洗滌HyboncTN+尼龍膜 (Amersham)的推薦的持續(xù)時(shí)間是15分鐘。優(yōu)選地，洗滌可以進(jìn)行2至3次。核苷酸序列SEQ ID NO 1的部分序列也可以用作探針。可以利用基于核苷酸序列 SEQ ID NO :1的引物，和包含核苷酸序列SEQ ID NO 1的DNA片段作為模板，通過(guò)PCR制備探針。長(zhǎng)約300bp的DNA片段用作探針時(shí)，洗滌的雜交條件包括，例如50°C、2x SSC和0. 1% SDS。上述核苷酸的取代、缺失、插入、或添加還包括例如由于細(xì)菌的種或?qū)僦械亩鄻有远烊话l(fā)生(突變體或變體)并且包含D-木糖通透酶的突變?！坝镁幋a蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)菌”指例如用常規(guī)方法將DNA導(dǎo)入細(xì)菌中。該DNA 的轉(zhuǎn)化將導(dǎo)致編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的基因表達(dá)的增加，并將增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞中所述蛋白質(zhì)的活性。轉(zhuǎn)化方法包括迄今報(bào)導(dǎo)的任何已知方法。例如，對(duì)于大腸桿菌K-12，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了用氯
10化鈣處理受體細(xì)胞以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)DNA的通透性的方法(Mandel，Μ. and Higa，Α.，J. Mol. Biol.，53，159 (1970))，并可以使用該方法。基因表達(dá)增強(qiáng)的方法包括增加基因拷貝數(shù)。將基因?qū)氲侥軌蛟谀c桿菌科細(xì)菌中發(fā)揮作用的載體中來(lái)增加基因的拷貝數(shù)。優(yōu)選使用低拷貝載體。低拷貝載體的例子包括但不限于pSC101、pMW118、pMW119等。術(shù)語(yǔ)“低拷貝載體”用于其拷貝數(shù)多達(dá)每個(gè)細(xì)胞5個(gè)拷貝的載體。也可以通過(guò)將多拷貝基因?qū)氲郊?xì)菌染色體中來(lái)實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的增強(qiáng)，例如通過(guò)同源重組、Mu整合等方法導(dǎo)入。例如一次Mu整合作用允許向細(xì)菌染色體中導(dǎo)入多達(dá)3個(gè)拷貝的基因。增加D-木糖通透酶基因的拷貝數(shù)也可以通過(guò)向細(xì)菌的染色體DNA導(dǎo)入多拷貝的 D-木糖通透酶基因而實(shí)現(xiàn)。為了將多拷貝基因?qū)氲郊?xì)菌染色體中，利用其多拷貝在染色體DNA中作為靶物(target)存在的序列實(shí)施同源重組。在染色體DNA中具有多拷貝的序列包括但不限于重復(fù)DNA，或存在于轉(zhuǎn)座元件(transposable element)末端的反向重復(fù)序列(inverted repeat) 還有，如美國(guó)專利5，595，889中公開(kāi)的，可以將D-木糖通透酶基因摻入到轉(zhuǎn)座子中，并使其轉(zhuǎn)移以將多拷貝基因?qū)肴旧wDNA中。基因表達(dá)的增強(qiáng)也可以通過(guò)將本發(fā)明的DNA置于強(qiáng)啟動(dòng)子的控制之下而實(shí)現(xiàn)。例如，將Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、和lambda噬菌體的或啟動(dòng)子稱為強(qiáng)啟動(dòng)子?；虮磉_(dá)的增強(qiáng)還可以通過(guò)將強(qiáng)終止子置于本發(fā)明的DNA下游而實(shí)現(xiàn)。強(qiáng)啟動(dòng)子和/ 或終止子可以與基因拷貝的增加組合使用?；蛘?，例如可以通過(guò)向啟動(dòng)子導(dǎo)入突變以提高位于啟動(dòng)子下游的結(jié)構(gòu)基因(基因的編碼區(qū))的轉(zhuǎn)錄水平，從而增強(qiáng)啟動(dòng)子的效果。類似地，例如可通過(guò)向終止子導(dǎo)入突變以提高位于終止子上游基因轉(zhuǎn)錄的周轉(zhuǎn)(turnover)，從而增強(qiáng)終止子的效果。另外，已知核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)與起始密碼子之間的間隔區(qū)，尤其是恰位于起始密碼子上游的序列中幾個(gè)核苷酸的取代深刻地影響mRNA可譯性。例如，發(fā)現(xiàn)了 20倍范圍的表達(dá)水平，這依賴于起始密碼子之前的三個(gè)核苷酸的性質(zhì)(Gold等.，Annu. Rev. Microbiol.，35，365-403，1981 ；Hui 等.，EMBO J.，3，623-629，1984)。先前，已表明 rhtA23 突變是相對(duì)于ATG起始密碼子來(lái)說(shuō)在-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29,1997, abstract No. 457) 。 0] , ! 明rhtA23突變?cè)鰪?qiáng)了 rhtA基因表達(dá)，結(jié)果增加了對(duì)蘇氨酸、高絲氨酸和轉(zhuǎn)運(yùn)出細(xì)胞的一些其它物質(zhì)的抗性。另外，也可能向細(xì)菌染色體上的D-木糖通透酶基因的啟動(dòng)子或終止子區(qū)導(dǎo)入核苷酸取代，這導(dǎo)致更強(qiáng)的啟動(dòng)子或終止子功能。例如，可以利用溫度敏感性質(zhì)粒以與基因取代相同的方式進(jìn)行表達(dá)控制序列的改變，如國(guó)際專利公開(kāi)WO 00/18935和日本專利申請(qǐng)公開(kāi)No. 1-215280中公開(kāi)的。制備質(zhì)粒DNA的方法包括但不限于DNA的消化和連接、轉(zhuǎn)化、選擇寡核苷酸作為引物等、或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他方法。例如在Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch, Ε. F.，和 Maniatis,Τ. ,"Molecular Cloning A Laboratory Manual,Second Edition，，，Cold SpringHarbor Laboratory Press (1989)中描述了這些方法。可以通過(guò)將前述DNA導(dǎo)入到本身具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的細(xì)菌中而獲得本發(fā)明的細(xì)菌?；蛘?，可以通過(guò)將產(chǎn)生L-氨基酸的能力賦予已包含所述DNA的細(xì)菌而獲得本發(fā)明的細(xì)菌。牛產(chǎn)L-蘇氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括，但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-蘇氨酸的細(xì)菌，如大腸桿菌TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996)(美國(guó)專利 Nos. 5，175，107 和 5，705，371)、大腸桿菌 NRRL-21593 (美國(guó)專利 No. 5，939，307)、大腸桿菌 FERM BP-3756 (美國(guó)專利 No. 5，474，918)、大腸桿菌 FERM BP-3519 和 FERM BP-3520 (美國(guó)專禾Ij No. 5，376，538)、大腸桿菌 MG442 (Gusyatiner 等·，Genetika (俄語(yǔ)),1978,14 947-956)、大腸桿菌 VL643 和 VL2055(EP 1149911A)等。菌株TDH-6是thrC基因缺陷的，并且是蔗糖同化的，且i 1 vA基因具有滲漏 (leaky)突變。該菌株在rhtA基因中也有突變，其賦予對(duì)高濃度蘇氨酸或高絲氨酸的抗性。菌株B-3996包含質(zhì)粒PVIC40，其通過(guò)將包括突變thrA基因的thrA*BC操縱子插入到 RSF1010衍生載體中而獲得。該突變thrA基因編碼天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I，其對(duì)于蘇氨酸反饋抑制基本上脫敏。菌株B-3996于1987年11月19日以保藏號(hào)RIA 1867保藏在 All-Union Scientific Center of Antibiotics (Nagatinskaya Street 3_A, 117105 莫斯科，俄羅斯聯(lián)邦)。所述菌株還于1987年4月7日以保藏號(hào)B-3996保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(Russian National Collection of Industrial Microorganisms) (VKPM ；Dorozhny proezd. 1，莫斯科 1175佔(zhàn)，俄羅斯聯(lián)邦)。優(yōu)選本發(fā)明的細(xì)菌經(jīng)額外修飾增強(qiáng)下述基因中一個(gè)或多個(gè)的表達(dá)-突變thrA基因，其編碼對(duì)蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I ；-thrB基因，其編碼高絲氨酸激酶；-thrC基因，其編碼蘇氨酸合酶；-rhtA基因，其編碼推定的跨膜蛋白；-asd基因，其編碼天冬氨酸- β -半醛脫氫酶；和-aspC基因，其編碼天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶)；已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的thrA基因(核苷酸位置 337 至 2799，GenBank 登錄號(hào) NC 000913. 2，gi :49175990)。thrA 基因位于大腸桿菌 K-12染色體上的thrL和thrB基因之間。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌高絲氨酸激酶的thrB 基因(核苷酸位置沘01 至 3733，GenBank 登錄號(hào) NC_000913. 2，gi :49175990)。thrB 基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrA和thrC基因之間。已經(jīng)闡明了編碼大腸桿菌蘇氨酸合酶的 thrC 基因(核苷酸位置 3734 至 5020，GenBank 登錄號(hào) NC_000913. 2，gi :49175990)。 thrC基因位于大腸桿菌K-12染色體上thrB基因和yaaX開(kāi)放閱讀框之間。這三個(gè)基因都作為單一蘇氨酸操縱子起作用。編碼對(duì)蘇氨酸反饋抑制有抗性的天冬氨酸激酶高絲氨酸脫氫酶I的突變thrA 基因，以及thrB和thrC基因，可以從熟知的質(zhì)粒PVIC40作為一個(gè)操縱子獲得，質(zhì)粒 PVIC40存在于生產(chǎn)蘇氨酸的大腸桿菌VKPM B-3996中。質(zhì)粒pVIC40詳細(xì)描述于美國(guó)專利No. 5，705，371。rhtA基因存在于大腸桿菌染色體上靠近glnHPQ操縱子的ISmin處，其編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的組件。rhtA基因與0RFl(ybiF基因，位置764至1651，GenBank登錄號(hào) AAA218541，gi :440181)相同，并且位于pexB和ompX基因之間。表達(dá)由ORFl編碼的蛋白質(zhì)的單元已被命名為rhtA基因(rht:抗高絲氨酸和蘇氨酸)。另外，揭示了 rhtA23突變是相對(duì)于ATG起始密碼子來(lái)說(shuō)-1位置的A取代G的取代(ABSTRACTS of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with the Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, August 24—29，1997，abstract No. 457，EP 1013765A)。已闡明大腸桿菌的asd基因(核苷酸位置3572511至3571408，GenBank登錄號(hào)NC 000913. l,gi :16131307)，并可以利用基于所述基因的核苷酸序列的引物通過(guò)PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；參考White，T.J.等，Trends Genet.，1989，5 :185)獲得。其它微生物的asd基因可以以類似的方式獲得。還闡明了大腸桿菌的aspC基因(核苷酸位置983742至984932，GenBank登錄號(hào) NC 000913. l,gi :16128895)，并可以通過(guò)PCR獲得該基因。其它微生物的aspC基因可以以類似的方式獲得。產(chǎn)牛L-賴氨酸的細(xì)菌屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌的例子包括對(duì)L-賴氨酸類似物具有抗性的突變體。所述L-賴氨酸類似物抑制屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌的生長(zhǎng)，但當(dāng)L-賴氨酸共存于培養(yǎng)基中時(shí)，該抑制是完全或部分脫敏的。L-賴氨酸類似物的例子包括但不限于氧代賴氨酸、賴氨酸氧肟酸(lysine 1^辦0份1^切)、5-(2-氨乙基)-1^-半胱氨酸(AEC)、γ -甲基賴氨酸、α-氯代己內(nèi)酰胺(a-chlorocaprolactam)等等。對(duì)這些賴氨酸類似物有抗性的突變體可以通過(guò)對(duì)屬于埃希氏菌屬細(xì)菌進(jìn)行常規(guī)人工誘變處理而獲得?？捎糜诋a(chǎn)生L-賴氨酸的菌株的具體例子包括大腸桿菌AJl 1442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185 ；參見(jiàn)美國(guó)專利4，346，170)和大腸桿菌VL611。在這些微生物中，天冬氨酸激酶受L-賴氨酸的反饋抑制是脫敏的。菌株WC196可以用作大腸桿菌的產(chǎn)生L-賴氨酸的細(xì)菌。通過(guò)將AEC抗性賦予菌株W3110來(lái)培育該細(xì)菌菌株，菌株W3110來(lái)源于大腸桿菌K-12。所得菌株稱為大腸桿菌AJ13069菌株，并于1994年12月6日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)石if究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology)(現(xiàn)在為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary), Tsukuba Central 6,1-1, Higashi l-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)，得到登錄號(hào)FERM P-14690。之后，依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，于1995年9月四日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，得到登錄號(hào)FERM BP-5252 (美國(guó)專利 5，827，698)。產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-組氨酸的細(xì)菌，如大腸桿菌菌株M(VKPM B-5945, RU2003677)；大腸桿菌菌株 80(VKPM B-7270，RU2119536)；大腸桿菌 NRRLB 12116-B12121 (美國(guó)專利 4，388，405)；大腸桿菌 H-9342 (FERM BP-6675)和 H-9343 (FERM BP-6676)(美國(guó)專利 6，344, 347)；大腸桿菌 H-9341 (FERMBP-6674) (EP 1085087)；大腸桿菌 AI80/pFM201 (美國(guó)專利 6，258，554)等。產(chǎn)牛L-苯丙氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌，如大腸桿菌AJ12739(tyrA::TnlO，tyrR) (VKPM B-8197)；含有 pheA34 基因的大腸桿菌 HW1089 (ATCC 55371)(美國(guó)專利 5，354，672)； 大腸桿菌 MWEClOl-b(KR8903681)；大腸桿菌 NRRL B-12141、NRRL B-12145、NRRL B-12146、禾口 NRRL B-12147 (美國(guó)專利 4，407，952)。另外，大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) / pPHAB (FERMBP-3566)、大腸桿菌 K-12 [W3110 (tyrA) /pPHAD] (FERM BP-12659)、大腸桿菌 K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-U662)、和命名為 AJ 12604(FERM BP-3579)的大腸桿菌 K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4，pACMAB]可以用作親本菌株(EP 488424B1)。另夕卜， 也可以使用屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-苯丙氨酸的細(xì)菌，其中由yedA基因或yddG基因編碼的蛋白質(zhì)具有增強(qiáng)的活性(美國(guó)專利申請(qǐng)2003/0148473A1和2003/0157667A1)。產(chǎn)牛L-精氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-精氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于產(chǎn)生 L-精氨酸的細(xì)菌如大腸桿菌菌株237 (VKPM B-7925)(美國(guó)專利申請(qǐng)2002/0058315A1)及其含有突變的N-乙酰谷氨酸合酶的衍生菌株(俄羅斯專利申請(qǐng)No. 2001112869)、大腸桿菌菌株382(VKPM B-7926) (EP 1170358A1)、具有在其中導(dǎo)入的編碼N-乙酰谷氨酸合成酶的 argA基因的產(chǎn)生精氨酸的菌株(JP 57-5693A)等等。產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于屬于埃希氏菌屬的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌如大腸桿菌VL334thrC+(EP117M33)。大腸桿菌 VL334(VKPM B-1641)是L-異亮氨酸和L-蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，其在thrC和ilvA基因中具有突變(美國(guó)專利No. 4，278，765)。利用培養(yǎng)在野生型大腸桿菌K12 (VKPM B-7)細(xì)胞上的噬菌體P1，通過(guò)普通的轉(zhuǎn)導(dǎo)方法轉(zhuǎn)移thrC基因的野生型等位基因。結(jié)果，獲得了 L-異亮氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株VL334thrC+(VKPM B-8961)。該菌株能夠產(chǎn)生L-谷氨酸。用于衍生本發(fā)明的產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的親本菌株的例子包括但不限于α -酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的突變體或者具有減小的α-酮戊二酸脫氫酶活性的突變體。 α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的或者具有減小的α-酮戊二酸脫氫酶活性的屬于埃希氏菌屬的細(xì)菌以及獲得它們的方法在美國(guó)專利5，378，616和5，573，945中描述。具體地，這些菌株包括下述大腸桿菌 W3IIOsucA Kmr大腸桿菌AJU624(FERM BP-3853)大腸桿菌AJU6^(FERM BP-3854)大腸桿菌AJUM9 (FERM BP-4881)大腸桿菌W31 IOsucA :Kmr通過(guò)破壞大腸桿菌W3110的α -酮戊二酸脫氫酶基因 (以下稱為“sucA基因”)而獲得。該菌株是α-酮戊二酸脫氫酶完全缺陷的。
產(chǎn)生L-谷氨酸的細(xì)菌的其它例子包括屬于泛菌屬的突變菌株，其為α-酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的或者具有減小的α-酮戊二酸脫氫酶活性，并可以如上所述獲得。這樣的菌株包括 Pantoea ananatis AJ13356。(美國(guó)專利 6，331，419)。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日以登錄號(hào)FERMP-16645保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)石if究所(National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and hdustry)(現(xiàn)在為獨(dú)立行政法人產(chǎn)業(yè)技術(shù)綜合研究所特許生物保藏中心(National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary), Central 6，1-1， Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi， Ibaraki-ken， 305-8566，日本)。之后依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定于1999年1月11日轉(zhuǎn)為國(guó)際保藏，得到登錄號(hào)FERM BP-6615。Pantoea ananatts AJ13356是α -酮戊二酸脫氫酶活性缺陷的，這是破壞cKGDH-El亞基基因(sucA)的結(jié)果。上述菌株在分離時(shí)被鑒定為成團(tuán)腸桿菌，并保藏為成團(tuán)腸桿菌AJ13356。然而，最近根據(jù)16S rRNA的核苷酸測(cè)序等將其重新分類為Pantoea ananatts0盡管AJ13356在前述保藏機(jī)構(gòu)保藏為成團(tuán)腸桿菌，但在本說(shuō)明書(shū)中，將它們描述為 Pantoea ananatis0L-氨基酸的牛產(chǎn)草酰乙酸(OAA)作為導(dǎo)致合成Thr和Lys的反應(yīng)的底物。OAA由于PEP與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)的反應(yīng)而得到，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶作為催化劑起作用。因此，細(xì)胞中PEPC濃度的升高對(duì)于這些氨基酸的發(fā)酵生產(chǎn)可能是非常重要的。當(dāng)葡萄糖用作發(fā)酵中的碳源時(shí)，葡萄糖被葡萄糖-磷酸轉(zhuǎn)移酶(Glc-PTQ系統(tǒng)內(nèi)在化(internalize)。此系統(tǒng)消耗PEP，而且PTS中的蛋白質(zhì)由ptsG和ptsHIcrr編碼。內(nèi)在化期間，從一個(gè)分子葡萄糖產(chǎn)生一個(gè)分子PEP和一個(gè)分子丙酮酸(Pyr)。在蔗糖而非葡萄糖中培養(yǎng)時(shí)，已被修飾而具有利用蔗糖的能力(Scr-PTS)的產(chǎn)生L-蘇氨酸的菌株和產(chǎn)生L-賴氨酸的菌株具有更高的生產(chǎn)這些氨基酸的能力(EP 1149911A2)。相信由一個(gè)分子蔗糖通過(guò)Scr-PTS產(chǎn)生三個(gè)分子PEP和一個(gè)分子Pyr，提高PEP/Pyr的比例，由此促進(jìn)由蔗糖合成Thr和Lys。此外，已報(bào)導(dǎo)Glc-PTS受到幾種表達(dá)控制(Postma P. W 等·，Microbiol Rev.，57 (3)，543-94 (1993) ；Clark B.等· J. Gen. Microbiol. ,96(2)，191-201 (1976) ；Plumbridge J.，Curr. Opin. Microbiol.，5 (2)， 187-93(2002) ；Ryu S.等·，J. Biol. Chem.，270 (6) J489-96 (199 )，因此有可能葡萄糖自身的摻入在氨基酸發(fā)酵中可能是限速步驟。通過(guò)在產(chǎn)生蘇氨酸的菌株、產(chǎn)生賴氨酸的菌株、產(chǎn)生組氨酸的菌株、產(chǎn)生苯丙氨酸的菌株和/或產(chǎn)生谷氨酸的菌株中增加xylE基因的表達(dá)而進(jìn)一步提高PEP/Pyr的比例將進(jìn)一步增加氨基酸生產(chǎn)。因?yàn)閺膬蓚€(gè)分子葡萄糖產(chǎn)生四個(gè)分子PEP，預(yù)期PEP/Pyr的比例將大大提高。由于xylE基因表達(dá)增加，預(yù)期將去除glc-PTS的表達(dá)控制。本發(fā)明產(chǎn)生L-氨基酸的方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-氨基酸在培養(yǎng)基中積累，并從培養(yǎng)基收集L-氨基酸的步驟。此外，本發(fā)明的方法包括產(chǎn)生L-蘇氨酸、 L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的細(xì)菌，使L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸積累在培養(yǎng)基中，并從培養(yǎng)基收集L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸。在本發(fā)明中，從培養(yǎng)基培養(yǎng)、收集、和純化L-氨基酸等可通過(guò)常規(guī)發(fā)酵方法進(jìn)行， 其中用微生物生產(chǎn)L-氨基酸。所述培養(yǎng)基可以是合成的或天然的，只要所述培養(yǎng)基包括碳源和氮源以及礦物質(zhì)，并且必要時(shí)還包括微生物生長(zhǎng)所需的適量營(yíng)養(yǎng)物。碳源可以包括多種碳水化合物如葡萄糖、蔗糖和木糖，以及多種有機(jī)酸。取決于所選微生物的同化方式，可以使用醇包括乙醇和甘油。作為氮源，可以使用多種銨鹽如氨和硫酸銨，其它氮化合物如胺，天然氮源如蛋白胨，大豆水解物和經(jīng)消化的發(fā)酵微生物。作為礦物質(zhì)，可以使用鉀單磷酸鹽(potassium monophosphate)、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、氯化鈣等。硫胺、酵母提取物等可以用作維生素。必要時(shí)可以向培養(yǎng)基添加附加營(yíng)養(yǎng)物。例如，如果微生物生長(zhǎng)需要L-氨基酸 (L-氨基酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型)，則可以向培養(yǎng)基添加足量的L-氨基酸。 培養(yǎng)優(yōu)選在需氧條件下進(jìn)行，例如在20至40°C，優(yōu)選30至38°C的溫度振蕩培養(yǎng)， 以及通氣攪拌培養(yǎng)。培養(yǎng)的PH通常在5到9之間，優(yōu)選6. 5到7. 2之間?？梢杂冒薄⑻妓徕}、多種酸、多種堿、和緩沖液調(diào)整培養(yǎng)的PH。通常，培養(yǎng)1至5天導(dǎo)致目標(biāo)L-氨基酸在液體培養(yǎng)基中積累。培養(yǎng)后，可以通過(guò)離心或膜過(guò)濾從液體培養(yǎng)基中去除固體如細(xì)胞，然后可以通過(guò)離子交換、濃縮和/或結(jié)晶方法收集并純化目標(biāo)L-氨基酸。
實(shí)施例以下將參考下述非限制性實(shí)施例更具體地解釋本發(fā)明。實(shí)施例1 用雜合I\_ta。啟動(dòng)子取代大腸桿菌中xylE基因的天然啟動(dòng)子區(qū)為了取代xylE基因的天然啟動(dòng)子區(qū)，利用DatsenkoK. A. and Wanner B. L. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97,6640-6645)描述的方法，將攜帶雜合P^ta。啟動(dòng)子和由cat基因編碼的氯霉素抗性標(biāo)記(CmK)的DNA片段整合到大腸桿菌MG1655(ATCC 700926)的染色體中，代替天然啟動(dòng)子區(qū)，所述方法也稱為“Red-介導(dǎo)的整合”和/或“Red-驅(qū)動(dòng)的整合”。 具有熱敏復(fù)制子的重組質(zhì)粒 pKD46(Datsenko，K. Α.，Wanner, B. L.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000,97,6640-6645)用作由噬菌體λ衍生的基因的供體，所述基因負(fù)責(zé)Red-介導(dǎo)的重組系統(tǒng)。包含重組質(zhì)粒PKD46的大腸桿菌菌株BW25113可由大腸桿菌Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USA 獲得，其登錄號(hào)為 CGSC7630。化學(xué)合成雜合I\_ta。啟動(dòng)子。取代的啟動(dòng)子的核苷酸序列顯示于序列表中(SEQ ID NO 3)。包含雜合Pptae啟動(dòng)子的合成DNA片段在其5，端包含BglII識(shí)別位點(diǎn)，其對(duì)于進(jìn)一步連接到被導(dǎo)入以進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中的cat基因和與xylE基因5’末端同源的36 個(gè)核苷酸來(lái)說(shuō)是必需的。使用商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒pACYC184(GenBank/EMBL 登錄號(hào) X06403，“Fermentas”， Lithuania)為模板，和引物Pl (SEQ ID N0:4)和P2(SEQ ID NO :5)通過(guò)PCR獲得包含由 cat基因編碼的CmK標(biāo)記的DNA片段。弓丨物Pl在其5’端包含BglII識(shí)別位點(diǎn)，其對(duì)于進(jìn)一步連接到雜合Pkta。啟動(dòng)子是必需的，引物P2包含與位于xylE基因起始密碼子上游217bp 的區(qū)域同源的36個(gè)核苷酸，其被導(dǎo)入到引物中用于進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中。利用“TermoHybaid PCR Express”擴(kuò)增儀實(shí)施PCR。反應(yīng)混合物(總體積-50 μ 1)由含 15mM MgCl2&5yl IOx PCR 緩沖液(“ Fermentas ”，Lithuania)、200 μ tM 的每種 dNTP、 25pmol的每種所用引物和IU的iTaq-聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)組成。將大約 5ng的質(zhì)粒DNA添加到反應(yīng)混合物中作為模板DNA用于PCR擴(kuò)增。溫度曲線(temperature profile)如下在95°C初始DNA變性5min，接下來(lái)是95°C變性30sec、55°C退火30sec、72°C 延伸30sec的25個(gè)循環(huán)；和在+72°C最終延伸7min。然后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化擴(kuò)增的 DNA 片段，用 “GenElute Spin Columns” ( “Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。用BglII限制酶處理上述兩種DNA片段并連接。用引物P2 (SEQ ID NO : 和P3 (SEQ ID NO 6)通過(guò)PCR擴(kuò)增連接產(chǎn)物。引物P3在其5，端包含36個(gè)核苷酸，這36個(gè)核苷酸與被導(dǎo)入用于進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中的xyIE基因的5’末端同源。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳純化擴(kuò)增的DNA片段，用“GenElute Spin Columns" ( “Sigma”，USA)提取，并用乙醇沉淀。獲得的DNA片段用于電穿孔和Red-介導(dǎo)整合到大腸桿菌MG1655/pKD46的細(xì)菌染色體中。將MG1655/pKD46細(xì)胞于30°C在添加了氨芐青霉素(100 μ g/ml)的液體LB-培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，然后用添加了氨芐青霉素(100 μ g/ml)和L-阿拉伯糖(IOmM)(阿拉伯糖用于誘導(dǎo)Red系統(tǒng)的質(zhì)粒編碼基因)的SOB-培養(yǎng)基(酵母提取物，5g/l ；NaCl, 0. 5g/l ；胰蛋白胨，20g/l ;KC1，2. 5mM;MgCl2，10mM)l 100稀釋，在30°C培養(yǎng)以使細(xì)菌培養(yǎng)物的光密度達(dá)到0D_ = 0. 4-0. 7。來(lái)自IOml細(xì)菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)細(xì)胞用以冰預(yù)冷的去離子水洗滌3次， 然后懸浮在IOOul水中。將溶解在去離子水中的10 μ 1 DNA片段(IOOng)添加到細(xì)胞懸浮液中。依照廠商的說(shuō)明，用“Bio-Rad”電穿孔儀(USA) (No. 165-2098，2_89版本)進(jìn)行電穿孔。 將電擊過(guò)的(shocked)細(xì)胞添加到 1-ml SOC 培養(yǎng)基(Sambrook 等，“Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), 在37°C溫育2小時(shí)，然后將其涂布到含25 μ g/ml氯霉素的L-瓊脂上。用引物P4(SEQ ID NO 7)和P5 (SEQ ID NO 8)通過(guò)PCR測(cè)試24小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)的菌落的CmE標(biāo)記而非xylE基因的天然啟動(dòng)子區(qū)的存在。為此目的，將新分離的菌落懸浮在20 μ 1水中，然后將1 μ 1獲得的懸浮液用于PCR。使用下述溫度曲線在95°C初始DNA變性IOmin ；然后是95°C變性30sec、 55°C退火30seC、72°C延伸Imin的30個(gè)循環(huán)；在72°C最終延伸7min。所測(cè)試的少量0^菌落包含所需的 2000bp DNA片段，這證實(shí)了 CmK標(biāo)記DNA而不是xylE基因的192bp天然啟動(dòng)子區(qū)的存在(參見(jiàn)圖1)。這些菌株中的一個(gè)通過(guò)在37°C培養(yǎng)來(lái)消除熱敏質(zhì)粒pKD46， 并將所得菌株命名為大腸桿菌MG1655Ppta。XylE。實(shí)施例2 增加的xylE基因表達(dá)對(duì)具有破壞的PTS轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的大腸桿菌菌株生長(zhǎng)的影響為了表明xylE基因表達(dá)增強(qiáng)對(duì)大腸桿菌菌株生長(zhǎng)的影響，構(gòu)建了具有破壞的PTS 轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的大腸桿菌菌株。為實(shí)現(xiàn)該目的，用Datsenko K. A.禾Π Wanner B 上.(Proc. Natl. Acad. ki. USA， 2000,97,6640-6645)描述的方法將攜帶卡那霉素抗性標(biāo)記(KmK)的DNA片段整合到大腸桿菌MG1655/pKD46的染色體中，代替ptsHI-crr操縱子，該方法也稱為“Red-介導(dǎo)的整合”和 /或“Red-驅(qū)動(dòng)的整合”，實(shí)施例1也描述了該方法。已經(jīng)闡明了 ptsHI-crr 操縱子(GenBank 登錄號(hào) NC 000913. 2，gi :49175990 的序列中，對(duì)于ptsH、ptsl和err基因分別為核苷酸編號(hào)2531786至2532043、2532088至2533815和2533856至25:3436 。ptsHI_crr操縱子位于大腸桿菌K-12染色體上cysK和 pdxK基因之間。利用商業(yè)上可獲得的質(zhì)粒pUC4KAN(GenBank/EMBL 登錄號(hào) X06404，“Fermentas", Lithuania)作為模板，和引物P6 (SEQ ID NO 9)和P7 (SEQ ID NO 10)通過(guò)PCR獲得攜帶 KmE基因的DNA片段。引物P6包含與ptsH基因5、末端同源的36個(gè)核苷酸，引物P7包含與err基因3’-末端同源的36個(gè)核苷酸。將這些序列導(dǎo)入到引物P6和P7中，用于進(jìn)一步整合到細(xì)菌染色體中。如實(shí)施例1所述進(jìn)行PCR。然后，用瓊脂糖凝膠電泳濃縮擴(kuò)增的DNA片段，通過(guò)以“GenElute Spin Columns^ "Sigma", USA)離心從凝膠中提取，并用乙醇沉淀。所獲得的DNA片段如實(shí)施例 1所述用于電穿孔和Red-介導(dǎo)整合到大腸桿菌MG1655/pKD46的細(xì)菌染色體中，只是在電穿孔后將細(xì)胞涂布到含50 μ g/ml卡那霉素的L-瓊脂上。利用引物P8 (SEQ ID NO 11)和P9 (SEQ ID NO: 12)通過(guò)PCR測(cè)試24小時(shí)內(nèi)生長(zhǎng)的菌落的記而非ptsHI-crr操縱子的存在。為此目的，將新分離的菌落懸浮在20 μ 1 水中，然后將1 μ 1獲得的懸浮液用于PCR。PCR條件如實(shí)施例1所述。所測(cè)試的少量10^菌落包含所需的 1300bp DNA片段，這證實(shí)了 10^基因而非ptsHI-crr操縱子的存在。所獲得的菌株中的一個(gè)通過(guò)在37°C培養(yǎng)而消除熱敏質(zhì)粒pKD46，并將所得菌株命名為大腸桿菌 MG1655AptsHI-crr。然后，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655Ppta。XylE的染色體的DNA片段通過(guò)Pl轉(zhuǎn)導(dǎo) (Miller, J. H. (1972)Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY)轉(zhuǎn)移到大腸桿菌 MG1655 Δ ptsHI-crr，得到菌株 MG1655 Δ ptsHI-crr
PL-tacXylE。檢測(cè)三個(gè)大腸桿菌菌株MG1655、MG1655 Δ ptsHI-crr 和 MG1655 Δ ptsHI-crr PL_ta。xylE在含有葡萄糖作為碳源的基本Adams上生長(zhǎng)的能力。如圖2所示，大腸桿菌MG1655AptsHI-crr不能在含葡萄糖的基本Adams培養(yǎng)基上良好地生長(zhǎng)(μ 0. 06)。 增加xylE基因表達(dá)明顯增強(qiáng)了受體菌株在含葡萄糖的基本Adams培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)特性。實(shí)施例3 增加的xylE基因表達(dá)對(duì)蘇氨酸產(chǎn)生的影響為了測(cè)試在Pptae啟動(dòng)子控制下的xylE基因增強(qiáng)的表達(dá)對(duì)蘇氨酸生產(chǎn)的影響，將來(lái)自上述大腸桿菌MG1655PL_ta。xylE的染色體的DNA片段通過(guò)Pl轉(zhuǎn)導(dǎo)(Miller，J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) 轉(zhuǎn)移到產(chǎn)生蘇氨酸的大腸桿菌菌株VKPM B-3996。菌株VKPM B-3996于1987年4月7日以登錄號(hào)B-3996保藏在俄羅斯國(guó)立工業(yè)微生物保藏中心(VKPM)(俄羅斯，117545莫斯科，Ist Dorozhny proezd,1)。將大腸桿菌菌株B-3996和B_3996PL_ta。xylE都在37 °C在L-瓊脂平板上培養(yǎng)18- 小時(shí)。為獲得種子培養(yǎng)物，在旋轉(zhuǎn)震蕩器O50rpm)上，在32°C將所述菌株在含2ml具有4% 蔗糖的L-培養(yǎng)液(L-broth)的20x 200mm試管中培養(yǎng)18小時(shí)。然后，用0. 21ml (10% )種子材料接種發(fā)酵培養(yǎng)基。在20x 200mm試管中，在2ml用于發(fā)酵的基本培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。 細(xì)胞在32°C 250rpm振動(dòng)生長(zhǎng)48小時(shí)。培養(yǎng)后，用以下流動(dòng)相丁醇醋酸水=4 1 1 (ν/ν)通過(guò)紙層析測(cè)定培養(yǎng)基中積累的L-蘇氨酸的量。將茚三酮的丙酮溶液用作顯示試劑。切下含L-蘇氨酸的斑點(diǎn)，在CdCl2的0. 5%水溶液中洗脫L-蘇氨酸，用分光光度法在540nm處評(píng)估L-蘇氨酸的量。結(jié)果顯示在表1中。由于導(dǎo)入IVta。xylE，改進(jìn)了蘇氨酸生產(chǎn)。發(fā)酵培養(yǎng)基的成分(g/Ι)如下
葡萄糖80.0
(NH4)2SO422.0
NaCl0.8
KH2PO42.0
MgSO4 7H200.8FeSO4 7H200.02
MnSO4 5H200.02
疏胺素鹽酸鹽(thiamine HCl) 0.0002
酵母提取物1.0
CaCO330.0葡萄糖和硫酸鎂分別滅菌。CaCO3在180°C干熱滅菌2小時(shí)。pH調(diào)整到7. O。滅菌后將抗生素加到培養(yǎng)基中。表權(quán)利要求
1.生產(chǎn)L-蘇氨酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)產(chǎn)生L-蘇氨酸的大腸桿菌以使L-蘇氨酸在所述培養(yǎng)基中積累，并從所述培養(yǎng)基分離L-蘇氨酸，其中所述大腸桿菌已經(jīng)過(guò)修飾而增強(qiáng)了編碼SEQ ID N0:2的氨基酸序列的xylE基因的表達(dá)，而且其中通過(guò)將所述xylE 基因置于包含SEQ ID NO :3的核苷酸序列的強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下而增強(qiáng)了所述xylE基因的表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述xylE基因包含SEQID NO 1的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及用腸桿菌科的細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的方法，具體地公開(kāi)了利用腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸，例如L-蘇氨酸、L-賴氨酸、L-組氨酸、L-苯丙氨酸、L-精氨酸或L-谷氨酸的方法，其中所述細(xì)菌經(jīng)修飾增強(qiáng)了D-木糖通透酶的活性。
文檔編號(hào)C12P13/08GK102286562SQ20111027126
公開(kāi)日2011年12月21日 申請(qǐng)日期2005年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2004年10月22日
發(fā)明者原吉彥, ?？ㄌ乩锬?A.斯利文斯卡亞, ?？ㄌ乩锬?A.賽維拉索瓦, 埃爾韋拉.B.沃羅什洛娃, 埃琳娜.V.克里亞奇科, 塔特亞娜.V.里奧諾娃, 尤里.I.科茲洛夫, 康斯坦丁.V.賴貝克, 拉里薩.G.埃里克, 植田拓嗣, 瑟奇.V.馬什科, 瓦萊里.Z.阿克維迪安, 米克海爾.M.古斯亞蒂納, 薇拉.G.多羅申科 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社