專利名稱：一種豬胰腺α-淀粉酶(PPA)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種淀粉酶，具體涉及豬胰腺α-淀粉酶及其制備方法。
背景技術(shù)：
我國飼料以玉米為主，玉米中含有大量淀粉，添加α -淀粉酶使淀粉預降解，既達到了切斷長鏈淀粉的作用，又減少了黏度，有助于提高了飼料的轉(zhuǎn)化效率，為此α-淀粉酶在飼料酶中占據(jù)著很重要的地位。
淀粉酶是水解淀粉和糖原等的一類酶的統(tǒng)稱，最早實現(xiàn)工業(yè)生產(chǎn)，是迄今為止用途最廣、產(chǎn)量最大的幾個酶制劑品種之一。人類早在數(shù)千年前就已利用淀粉酶的作用從事釀酒。但直到1811年，第一種淀粉降解酶才被KirchhofT發(fā)現(xiàn)[錯誤！未定義書簽。]， 1833年P(guān)ayen和Persoz從麥芽的水抽提物中用酒精沉淀分離到淀粉酶。1894年日本人高峰讓吉從米曲霉(Aspergillus oryzae)中提取出淀粉酶作為消化劑；1919年法國人又先后發(fā)現(xiàn)枯草桿菌(Bacillus subtilis)可以分泌耐熱且活性更強的α-淀粉酶；1926年德國設(shè)廠生產(chǎn)α -淀粉酶，為微生物酶工業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)；1949年，日本成功地進行了 α -淀粉酶的液體深層發(fā)酵，從而促進了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)展。至此，α-淀粉酶在輕工、食品、制藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用越來越廣泛。
基因工程技術(shù)在α-淀粉酶工業(yè)上應(yīng)用和發(fā)展已取得可喜結(jié)果。國內(nèi)外研究者已報道了 α-淀粉酶基因的克隆。1984年被Tsukagoshi等人在嗜熱脂肪芽胞桿菌 (B. stearothermophiIus)中克隆得到一段包含ct -淀粉酶基因的6. 4kb片段,而Mielenz 所克隆的基因大小為5. 4kb，二者可以在大腸桿菌HBlOl中表達,在淀粉-瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生淀粉水解圈，這表明該片段含有的α -淀粉酶基因是完整的。
α-淀粉酶廣泛分布于動物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽、山崳菜)及微生物中，不同來源的酶具有不同性質(zhì)，不同性質(zhì)的酶具有不同的用途。工業(yè)生產(chǎn)用的一般由微生物進行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn),主要來源于幾種細菌和真菌,如原核微生物枯草桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、黃單胞菌等；真核微生物米曲霉、黑曲霉.、擬內(nèi)孢菌等。一般來說細菌淀粉酶因為具有某些特性而優(yōu)于真菌淀粉酶。另外也有從動植物體內(nèi)提取獲得α-淀粉酶，但受到動植物原料來源及工藝方面不成熟的限制而成本高昂，無法滿足市場的需求。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種豬胰腺α-淀粉酶(PPA)及其制備方法，可以高效表達 α-淀粉酶的重組酵母可用來大規(guī)模工業(yè)化廉價生產(chǎn)飼料用α -淀粉酶，同時發(fā)酵后的菌體還可以做優(yōu)良的單細胞飼料蛋白。
本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)一種豬胰腺α-淀粉酶(ΡΡΑ)，來源于豬胰腺組織，豬胰腺α-淀粉酶的核苷酸序列如下
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豬胰腺α -淀粉酶的氨基酸序列如下
MKLFLLLSAFGFCWAQYAPQTQSGRTSIVHLFEWRWVDIALECERYLGP
KGFGGVQVSPPNENIVVTNPSRPWWERYQPVSYKLCTRSGNENEFRDMV
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DGTAQFSISNSAEDPFIAIHAESKLNL
所述的豬胰腺α -淀粉酶(PPA)的制備方法包括以下步驟
I)克隆豬胰腺α -淀粉酶PPA基因；
2) PPA基因在酵母表達載體上的構(gòu)建；
3)酵母轉(zhuǎn)化和重組酵母的篩選；
4)發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶。
本發(fā)明探索了三種發(fā)酵方法第一種為以甘油為碳源、甘油飼喂培養(yǎng)的發(fā)酵方法具體如下1)菌株培養(yǎng)階段。發(fā)酵培養(yǎng)基接種前先加28%氨水使培養(yǎng)基的pH達到5. O (氨水同時也作為氮源)，再按每升培養(yǎng)基加入4. 37ml PTMl，5-10%接種種子液，通氣攪拌培養(yǎng)18-24小時，在培養(yǎng)過程中隨著菌株的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量將有100%逐漸降低，當碳源消耗完后溶氧量將再度升高至80%以上，此時菌體濕重將達到110g/L。2)碳源飼喂階段。流加50%甘油(包含12ml/LPTMl)，流加量為18. 15/hr/L，培養(yǎng)4小時。調(diào)整通氣量使溶氧量始終大于20%.此時菌體濕重達到220g/L。3)誘導表達階段。加入甲醇(含 12ml/L PTM1)，使甲醇終濃度維持在O. 3%，溶氧量始終大于20% .在誘導過程中每12小時取樣一次測定表達的淀粉酶的積累量。第二種方法為以甘油為碳源、碳源-甲醇混合飼喂的方法。具體為在第一種方法的第二步即碳源飼喂階段完成后，增加一個碳源-甲醇混合飼喂階段，即流加50%甘油甲醇(4 I)培養(yǎng)4小時，流加量為5ml/hr/L，控制溶氧量始終大于20%.接著再進入甲醇誘導階段。第三種方法為以葡萄糖為碳源、碳源-甲醇混合飼喂的方法。除了把碳源甘油換成葡萄糖外，其余與第二種方法完全相同。
本發(fā)明的有益效果為高效表達α -淀粉酶的重組酵母可用來大規(guī)模工業(yè)化廉價生產(chǎn)飼料用α-淀粉酶，同時發(fā)酵后的菌體還可以做優(yōu)良的單細胞飼料蛋白；具有高活性、 高耐受性，不僅可以豐富淀粉酶選擇性，還可以進一步對其分子水平改造提供一定的理論依據(jù)。
具體實施方式
實施例1克隆豬胰腺α -淀粉酶PPA基因
豬胰腺RNA的提取采用Trizol試劑盒法，采集新鮮豬胰腺組織，迅速在液氮中研磨，研磨粉末放入Trizol溶液中，渦旋均勻后低溫下離心，上清液經(jīng)異丙醇處理后，轉(zhuǎn)入 75%的乙醇中沉淀RNA分子，即可獲得純凈的RNA。
通過RT-PCR擴增得到包含α -淀粉酶原ORF的cDNA片段。反應(yīng)參數(shù)如下表
權(quán)利要求
1.一種豬胰腺α -淀粉酶(PPA)，其特征在于豬胰腺α -淀粉酶來源于豬胰腺組織，豬胰腺α-淀粉酶的核苷酸序列如下5' -ATGAAGTTGTTTCTGCTGCTTTCAGCCTTTGGGTTCTGCTGGGCCCAGTATGCCCCACAAACCCAGTCTGGACGAACGTCTATTCTCCATCTGTTTGAATGGCGCTGGGTTGACATTGCTCTTGAATGTGAGCGGTATTTGGGCCCCAAAGGATTTGGAGGGGTACAGGTCTCCCCCCCCAATGAAAATATAGTAGTCACTAACCCTTCAAGACCTTGGTGGGAGAGATACCAACCAGTGAGTTACAAGTTATGTACCAGATCAGGAAATGAAAATGAATTCAGAGACATGGTGACTAGATGTAACAACGTTGGCGTGCGTATATATGTGGATGCTGTCATTAATCATATGTGTGGAAGTGGTGCAGCTGCAGGAACGGGCACCACTTGTGGAAGTTATTGCAACCCTGGAAATAGGGAGTTTCCAGCAGTCCCATACTCTGCTTGGGATTTTAACGATGGTAAATGTAAAACTGCAAGTGGAGGAATCGAGAGCTATAATGATCCTTATCAAGTCAGAGATTGTCAACTGGTTGGTCTTCTTGATCTTGCACTGGAAAAGGATTATGTGCGCTCCATGATTGCTGATTATCTAAACAAACTCATTGACATTGGTGTAGCAGGGTTCCGAATTGATGCTTCTAAGCACATGTGGCCTGGAGACATAAAAGCAGTTTTGGATAAACTTCACAACCTAAACACCAACTGGTTCCCTGCCGGAAGTCGACCTTTCATATTCCAGGAGGTGATTGATTTGGGTGGTGAGGCAATTCAAAGCAGTGAGTACTTTGGAAATGGCCGCGTGACAGAATTTAAATACGGTGCAAAACTGGGCACCGTTGTGCGCAAGTGGAGTGGAGAGAAGATGTCTTACTTGAAGAACTGGGGAGAAGGCTGGGGTTTCATGCCCTCTGATAGAGCCCTTGTCTTTGTTGATAACCATGACAACCAGCGAGGGCATGGAGCGGGGGGAGCATCTATTCTTACATTCTGGGACGCTAGACTGTACAAAGTGGCAGTTGGATTTATGCTCGCCCACCCTTACGGATTCACACGAGTGATGTCAAGCTACCGTTGGGCAAGAAATTTTGTGAATGGACAAGATGTTAATGATTGGATTGGGCCACCAAATAATAACGGGGTCATTAAGGAAGTTACTATTAATGCAGATACTACCTGTGGCAATGACTGGGTCTGTGAGCATCGATGGCGTCAGATAAGGAACATGGTTTGGTTCCGTAACGTGGTGGACGGCCAACCTTTTGCAAACTGGTGCGATAACGGAAGCAACCAGGTAGCTTTTGGAAGAGGAAACAGAGGATTCATTGTCTTTAACAATGATGATTGGCAATTATCTTCAACTTTGCAAACTGGTCTTCCTGGTGGCACATACTGTGATGTTATCTCTGGAGATAAAGTTGGTAACAGTTGTACAGGAATTAAAGTCTATGTTTCCAGTGATGGCACAGCTCAGTTTTCTATTAGTAACTCTGCTGAAGATCCATTTATTGCAATTCATGCTGAATCCAAATTGAATCTCTAG-3' 豬胰腺α-淀粉酶的氨基酸序列如下MKLFLLLSAFGFCWAQYAPQTQSGRTSIVHLFEWRWVDIALECERYLGPKGFGGVQVSPPNENIVVTNPSRPWWERYQPVSYKLCTRSGNENEFRDMVTRCNNVGVRIYVDAVTNHMCGSGAAAGTGTTCGSYCNPGNREFPAVPYSAWDFNDGKCKTASGGIESYNDPYQVRDCQLVGLLDLALEKDYVRSMIADYLNKLIDIGVAGFRIDASKHMWP⑶IKAVLDKLHNLNTNWFPAGSRPFIFQEVTDLGGEAIQSSEYFGNGRVTEFKYGAKLGTVVRKWSGEKMSYLKNWGEGffGFMPSDRALVFVDNHDNQRGHGAGGASILTFffDARLYKVAVGFMLAHPYGFTRVMSSYRWARNFVNGQDVNDWIGPPNNNGVIKEVTINADTTCGNDWVCEHRWRQIRNMVffFRNVVDGQPFANWffDNGSNQVAFGRGNRGFIVFNNDDWQLSSTLQTGLPGGTYCDVIS⑶KVGNSCTGIKVYVSSDGTAQFSISNSAEDPFIAIHAESKLNL
2.權(quán)利要求1所述的豬胰腺α-淀粉酶(PPA)的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 1)克隆豬胰腺α-淀粉酶PPA基因； 2)PPA基因在酵母表達載體上的構(gòu)建；3)酵母轉(zhuǎn)化和重組酵母的篩選；4)發(fā)酵 生產(chǎn)α-淀粉酶。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種豬胰腺α-淀粉酶(PPA)及其制備方法，豬胰腺α-淀粉酶來源于豬胰腺組織；其制備方法包括1)克隆豬胰腺α-淀粉酶PPA基因；2)PPA基因在酵母表達載體上的構(gòu)建；3)酵母轉(zhuǎn)化和重組酵母的篩選；4)發(fā)酵生產(chǎn)α-淀粉酶。本發(fā)明的有益效果為高效表達α-淀粉酶的重組酵母可用來大規(guī)模工業(yè)化廉價生產(chǎn)飼料用α-淀粉酶，同時發(fā)酵后的菌體還可以做優(yōu)良的單細胞飼料蛋白。
文檔編號C12N15/81GK102994473SQ20111027216
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月14日
發(fā)明者夏新界, 謝夢憶 申請人:廣州格拉姆生物科技有限公司