專利名稱：一種抑制血管緊張素轉移酶的六肽及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物制品領域，具體涉及一種血管緊張素轉移酶(ACE)抑制六肽及其制備方法。
背景技術：
隨著科學技術的發(fā)展和生活水平的提高，健康已經成為二十一世紀人類追求的最終目標。高血壓已成為危害人類健康的常見病之一，我國高血壓患者已近2億，高血壓引起的腦血管病和心臟病發(fā)病率呈上升趨勢，估計全國每年新發(fā)生腦卒中200萬人，其中2/3致死或致殘。因此，開發(fā)有效控制血壓的生物制品具有重要的經濟和社會效益。ACE作為人體內血壓調節(jié)的關鍵酶，在腎素-血管緊張素系統(tǒng)和激肽-激肽釋放酶系統(tǒng)中均起著重要的作用，因此，通過抑制ACE的活性能夠有效地降低血壓。目前臨床常用的ACE抑制劑主要為人工設計的化學合成類藥物，雖然能夠有效地控制血壓，但是也暴露了一些副作用。本發(fā)明提供了一種天然產物(酵母)來源的、能有效抑制ACE活性的六肽，有望在降血壓的同時克服化學藥的副作用。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于公開一種ACE抑制六肽，并提供該六肽的酵母來源酶解分離純化和固相合成兩種制備方法。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)
一種抑制血管緊張素轉移酶的六肽，該六肽的氨基酸序列為蘇氨酸-脯氨酸-蘇氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-絲氨酸(Thr-Pro-Thr-Gln-Gln-Ser )，半抑制濃度為 52. 35^73. 25 μ g/mL。所述的六肽的制備方法，包括以下步驟
(1)將干酵母粉和水按固液比1:5^1: 15 w/v混合后加入酶進行酶解，所述酶為內切酶、外切酶及風味酶的混合物，三種酶所占比例依次為l(T30%Wt、l(T30%Wt和4(T80%wt，酶解溫度為2(T45°C，酶解時間為2 4h ；步驟(1)得到的酶解液在9(T110°C滅酶后，過濾或離心分離得到液相組分；再除去液相組分中的多糖及核酸類雜質；然后通過超濾膜分離，濾過液經減壓濃縮和真空冷凍干燥后獲得分子量小于IOkDa的多肽組分；
(2)多肽組分用分子排阻層析柱分離，以pH7. (Γ8. 0的磷酸緩沖液為流動相，洗脫流速為 0. 3 1. OmL/min ；
(3)收集分子排阻層析柱流出的目標組分，進一步采用陰離子交換柱分離，用Olmol/ L、pH 7. (Γ8. 5的NaCl溶液梯度洗脫，收集目標組分后冷凍干燥，獲得六肽。所述酶的加入量為干酵母粉質量的0. 59Γ2. 5%。步驟(2)所述除去過濾或離心所得液相組分中的多糖及核酸類雜質是采用乙醇沉淀法，乙醇的加入量為液相組分的體積的2飛倍。所述超濾膜分離選用截留分子量為5kDiTl0kDa的超濾膜。
所述分子排阻層析柱流出的目標組分為對ACE的半抑制濃度最小的多肽組分；收集流出的不同組分后，分別檢測其對ACE的抑制效果，得到對ACE的半抑制濃度最小的多肽，陰離子交換柱流出的所述目標組分為對ACE的半抑制濃度最小的多肽，收集流出的不同組分后，分別檢測其對ACE的抑制效果，得到對ACE的半抑制濃度最小的組分。所述的六肽的制備方法按照固相合成法在羧基樹脂上依次連接以芴甲氧羰酰基為保護基團的氨基酸，縮合劑為羥基苯并三唑；反應溫度2(T40°C，單個氨基酸的接肽反應時間為0. 5 2h，脫保護劑為含哌啶的DMF，脫保護時間為0. 5h，獲得六肽化合物粗品，再經 C18柱分離純化，冷凍干燥，制得六肽；
所述以芴甲氧羰?；鶠楸Ｗo基團的氨基酸為Fmoder、Fmoc-Gln, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr、Fmoc-Pro 禾口 Fmoc-Thr ； 所述羧基樹脂為Wang樹脂。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比，具有如下的優(yōu)點和有益效果
(1)本發(fā)明公布的ACE抑制六肽氨基酸序列來源于天然產物(酵母)中，克服了化學藥的副作用；
(2)本發(fā)明制備條件溫和；
(3)經體外活性實驗證實，本發(fā)明所得六肽具有對ACE的抑制作用。本發(fā)明六肽對ACE 的半抑制濃度為73. 25 μ g/mL。
具體實施例方式以下結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例1
(1)酵母蛋白的提取和酶解將干酵母粉和水按固液比1: 10 (w/V)混合，選用含糜蛋白酶20%、亮氨酸氨肽酶20%及風味蛋白酶60%的混合酶酶解。加酶量為干酵母粉的0. 5% (w/w)，酶解溫度為35°C，酶解時間為池。(2)酶解液的分離與除雜酶解液在100°C下滅酶后離心，取液相組分加入4倍(V/ V)的乙醇，去除其中的多糖和核酸類雜質。(3)活性多肽的超濾膜分離利用截留分子量為IOkDa的超濾膜過濾分離，濾過液減壓濃縮及真空冷凍干燥后得到活性多肽。(4)多肽組分用分離范圍為10(T7000Da的分子排阻層析柱分離，以pH7. O的磷酸緩沖液為流動相，洗脫流速為1. OmL/min ；
(5)收集分子排阻層析柱流出的目標組分，進一步采用陰離子交換柱分離，用Olmol/ L、pH 8. 5的NaCl溶液梯度洗脫，收集目標組分后冷凍干燥，獲得六肽。通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)及氨基酸N端測序鑒定該六肽的結構。結果證實， 該六肽的氨基酸組成為Thr-Pro-Thr-Gln-Gln-Ser。利用HPLC檢測該六肽對ACE的半抑制濃度為73. 25 μ g/mL。實施例2
(1)酵母蛋白的提取和酶解將干酵母粉和水按固液比1: 10 (w/V)混合，選用含糜蛋白酶20%、亮氨酸氨肽酶20%及風味蛋白酶60%的混合酶酶解。加酶量為干酵母粉的0. 5% (w/w)，酶解溫度為35°C，酶解時間為池。
(2)酶解液的分離與除雜酶解液在100°C下滅酶后離心，取液相組分加入4倍(V/ V)的乙醇，去除其中的多糖和核酸類雜質。(3)活性多肽的超濾膜分離利用截留分子量為IOkDa的超濾膜過濾分離，濾過液減壓濃縮及真空冷凍干燥后得到活性多肽。(4)多肽組分用分離范圍為10(T7000Da的分子排阻層析柱分離，以pH8. 0的磷酸緩沖液為流動相，洗脫流速為0. 3mL/min ；
(5)收集分子排阻層析柱流出的目標組分，進一步采用陰離子交換柱分離，用Olmol/ L、pH 7. 0的NaCl溶液梯度洗脫，收集目標組分后冷凍干燥，獲得六肽。通過基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜(MALDI-T0F-MS)及氨基酸N端測序鑒定該六肽的結構。結果證實，該六肽的氨基酸組成為=Thr-Pro-Thr-Gln-Gln-Ser。利用HPLC檢測該六肽對ACE的半抑制濃度為73. 25 μ g/mL。實施例3
以Wang樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接以芴甲氧羰?；?Fmoc-)為保護基團 Fmoc-Ser, Fmoc-Gln, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Pro, Fmoc-Thr,反應溫度 20°C，反應時間為池，獲得六肽樹脂，期間依次采用含20%((哌啶與DMF體積比))哌啶的 DMF的脫保護劑，羥基苯并三唑(HOBT)為縮合劑進行接肽反應，單個氨基酸接肽反應時間為0. 5h，脫保護時間為0. 5h，獲得六肽化合物粗品，再經C18柱分離純化，冷凍干燥，制得該 ACE抑制六肽。利用HPLC檢測該六肽對ACE的半抑制濃度為52. 35 μ g/mL。實施例4
以Wang樹脂為起始原料，按照固相合成的方法依次連接以芴甲氧羰酰基(Fmoc-)為保護基團 Fmoc-Ser, Fmoc-Gln, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Pro, Fmoc-Thr,反應溫度 30°C，反應時間為6h，獲得六肽樹脂，期間依次采用含20%(哌啶與DMF體積比)哌啶的DMF 的脫保護劑，羥基苯并三唑(HOBT)為縮合劑進行接肽反應，單個氨基酸接肽反應時間為 2h,脫保護時間為0. 5h，獲得六肽化合物粗品，再經C18柱分離純化，冷凍干燥，制得該ACE 抑制六肽。利用HPLC檢測該六肽對ACE的半抑制濃度為52. 35 μ g/mL。
權利要求
1.一種抑制血管緊張素轉移酶的六肽，其特征在于該六肽的氨基酸序列為蘇氨酸-脯氨酸-蘇氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-絲氨酸。
2.權利要求1所述的六肽的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將干酵母粉和水按固液比1:5^1: 15 w/v混合后加入酶進行酶解，所述酶為內切酶、外切酶及風味酶的混合物，三種酶所占比例依次為l(T30%Wt、l(T30%Wt和4(T80%wt，酶解溫度為2(T45°C，酶解時間為2 4h ；步驟(1)得到的酶解液在9(T110°C滅酶后，過濾或離心分離得到液相組分；再除去液相組分中的多糖及核酸類雜質；然后通過超濾膜分離，濾過液經減壓濃縮和真空冷凍干燥后獲得分子量小于IOkDa的多肽組分；(2)多肽組分用分子排阻層析柱分離，以pH7. (Γ8. 0的磷酸緩沖液為流動相，洗脫流速為 0. 3 1. OmL/min ；(3)收集分子排阻層析柱流出的目標組分，進一步采用陰離子交換柱分離，用Olmol/ L、pH 7. (Γ8. 5的NaCl溶液梯度洗脫分離，收集目標組分后冷凍干燥，獲得六肽。
3.根據(jù)權利要求2所述的制備方法，其特征在于，所述酶的加入量為干酵母粉質量的 0. 5% 2. 5%ο
4.根據(jù)權利要求2或3所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述除去過濾或離心所得液相組分中的多糖及核酸類雜質是采用乙醇沉淀法，乙醇的加入量為液相組分的體積的 2飛倍。
5.根據(jù)權利要求2所述的方法，其特征在于，所述超濾膜分離選用截留分子量為 5kDa IOkDa的超濾膜。
6.根據(jù)權利要求4所述的方法，其特征在于，所述分子排阻層析柱流出的目標組分為對ACE的半抑制濃度最小的多肽組分；陰離子交換柱流出的所述目標組分為對ACE的半抑制濃度最小的多肽。
7.權利要求1所述的六肽的制備方法，其特征在于，按照固相合成法在羧基樹脂上依次連接以芴甲氧羰?；鶠楸Ｗo基團的氨基酸，縮合劑為羥基苯并三唑；反應溫度2(T40°C， 單個氨基酸的接肽反應時間為0. 5 2h，脫保護劑為含哌啶的N，N-二甲基甲酰胺，脫保護時間為0.證，獲得六肽化合物粗品，再經C18柱分離純化，冷凍干燥，制得六肽；所述以芴甲氧羰酰基為保護基團的氨基酸為Fmoder、Fmoc-Gln, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr、Fmoc-Pro 禾口 Fmoc-Thr。
8.根據(jù)權利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述羧基樹脂為Wang樹脂。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制血管緊張素轉移酶的六肽及其制備方法。該六肽的氨基酸殘基序列為蘇氨酸-脯氨酸-蘇氨酸-谷氨酰胺-谷氨酰胺-絲氨酸。該六肽的兩種制備方法為(1)酵母來源酶解分離制備法以干酵母粉為原料，通過酶解、分離后，獲得分子量小于10kDa的酵母多肽組分，進一步應用分子排阻柱層析和陰離子交換柱層析分離純化獲得該ACE抑制六肽；(2)固相合成法以Wang樹脂為固相載體，芴甲氧羰?；?Fmoc-)為氨基保護基，羥基苯并三唑(HOBT)為縮合劑進行接肽反應，固相合成該ACE抑制六肽。本發(fā)明制備條件溫和；經體外活性實驗證實，本發(fā)明所得六肽具有對ACE的抑制作用。
文檔編號C12P21/06GK102311484SQ20111027230
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月15日 優(yōu)先權日2011年9月15日
發(fā)明者侯軼, 倪賀, 張喜梅, 李琳, 胡松青 申請人:華南理工大學