專利名稱：原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(egf)的簡便化工業(yè)技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)的簡便化方法。
背景技術(shù)：
表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)是最早發(fā)現(xiàn)的生長因子，對調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、增殖和分化起著重要作用。人源表皮生長因子蛋白由53個氨基酸殘基組成，分子量為6千道爾頓，分子內(nèi)有6個半胱氨酸組成的二硫鍵，形成生物活性所必需的受體結(jié)構(gòu)域。表皮生長因子主要由頌下腺、十二指腸合成，廣泛存在于體液和各種腺體中，其中乳汁、尿液、精液中含量較高，但在血清中的濃度較低。一系列的實(shí)驗(yàn)研究證明，表皮生長因子可刺激多種細(xì)胞的增殖，主要是表皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞。表皮生長因子已經(jīng)成功應(yīng)用于角膜損傷、燒燙傷及手術(shù)等創(chuàng)面的修復(fù)和愈合。此外，表皮生長因子被用于生產(chǎn)抗衰老的化妝品和美容產(chǎn)品。同時，表皮生長因子還是無血清培養(yǎng)基的常見添加劑之一。Montalcini和 Cohen教授因發(fā)現(xiàn)表皮生長因子并分析其結(jié)構(gòu)和作用機(jī)理，獲得了 1986年的諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎。表皮生長因子受體是一種糖蛋白，廣泛分布于哺乳動物的上皮細(xì)胞、人成纖維細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞，角質(zhì)細(xì)胞等。EGF受體由細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域三個部分組成。細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域富含半胱氨酸(51個)，并形成多對二硫鍵，其上結(jié)合有糖基，是EGF結(jié)合的位點(diǎn)；細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域含有無活性的酪氨酸激酶和幾個酪氨酸磷酸化的位點(diǎn)。表皮生長因子制劑最初從人尿液中分離純化獲得的。盡管可以采用這種方法獲取少量表皮生長因子，但要如此進(jìn)行大規(guī)模提取并不實(shí)際。如今，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展， 表皮生長因子已經(jīng)可以由多種細(xì)胞株中獲得表達(dá)。但是，不管是從天然資源，還是來自基因工程細(xì)胞株發(fā)酵液，需要經(jīng)過復(fù)雜的分離和純化流程，才能獲得少量相對較純較低的產(chǎn)品， 使得其經(jīng)濟(jì)意義大為降低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)人來源的表皮生長因子在原核細(xì)胞中的大量表達(dá)，并通過透析復(fù)性和簡單的純化步驟，獲得有活性、純度高的目的蛋白。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高的總體要求。本發(fā)明通過體外PCR擴(kuò)增的方法，從人表皮生長因子的cDNA中擴(kuò)增得到EGF基因，并通過NcoI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET-28a連接。隨后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)，誘導(dǎo)后目的蛋白以包涵體的形式過表達(dá)。溶菌酶加上超聲破碎的方法使得包涵體能從大腸桿菌中徹底釋放。在8M尿素溶液中溶解包涵體后，透過透析的方法逐步去除變性劑，最后在Tris-HCl溶液中透析復(fù)性。應(yīng)用強(qiáng)陰離子交換樹脂(SP-bestarose) 和分子篩對復(fù)性后的蛋白進(jìn)行純化，最終獲得高純度表皮生長因子。


圖1是表皮生長因子5小時誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖(M為marker ；1 為誘導(dǎo)前，2為誘導(dǎo)5小時后。)圖2是表皮生長因子超聲細(xì)胞破碎SDS-PAGE電泳分析結(jié)果圖(M為marker，1為上清，2為沉淀)電泳圖中顯示，表皮生長因子以包涵體形式過表達(dá)。圖3是表皮生長因子SDS-PAGE電泳檢測陰離子交換層析結(jié)果圖A是陰離子交換層析收集組分還原條件下電泳圖(1-12為第3至15管收集組分。M為marker)，B是B陰離子交換層析收集組分非還原條件下電泳圖(1流穿液(還原條件)，2洗滌液(還原條件)， 3復(fù)性后表皮生長因子(還原條件)，M為marker，4復(fù)性后表皮生長因子，5流穿液(還原條件)，6-10分別是第3、6、9、12、15管收集組分)。圖4是表皮生長因子Superdex 7510/300GL純化峰圖。圖5是表皮生長因子分子篩純化收集組分SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。(1_3分別對應(yīng)圖4中收集組分B8-B10)。圖6是表皮生長因子SDS-PAGE分析純化純度結(jié)果圖(1非還原條件，2還原條件)。
具體實(shí)施例方式1、重組表皮生長因子的原核表達(dá)編碼人來源的EGF基因通過NcoI和EcoRI限制性酶切位點(diǎn)與表達(dá)載體pET_28a 連接。隨后將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)。挑取單克隆并接入含有3ml LB和終濃度為100 μ g/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中，搖床 37°C，250rpm培養(yǎng)約16小時。將上述菌液按1 200的比例接入含有200ml LB和終濃度為100 μ g/ml卡那霉素的培養(yǎng)基中，搖床37°C，250rpm培養(yǎng)至0D600約為0. 6，加入IPTG至終濃度為ImM，誘導(dǎo) 5小時之后收菌，離心，4000rpm，20min,棄上清，菌體_80°C保存。表皮生長因子誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見附圖1 (M為marker ；1為誘導(dǎo)前，2為5h誘導(dǎo)后。)2、表皮生長因子的復(fù)性收集的菌體置于冰上融化，并按1 20(m/v)比例懸浮于裂解液(50mM Tris pH 8. 0,150mM NaCl,lmM PMSF, 5mM EDTA,)中，加入終濃度為lmg/ml的溶菌酶，置冰放置 30min。細(xì)胞經(jīng)超聲破碎儀裂解(450w，破碎9. 9s，停9. 9s，共15次)。離心13000rpm，30min。 收集上清和沉淀，SDS-PAGE電泳檢測蛋白的可溶性(電泳結(jié)果顯示該蛋白為包涵體表達(dá))。表皮生長因子超聲細(xì)胞破碎SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見附圖2 (M為marker ；1為上清；2為沉淀)。將所得包涵體用含有2% Triton X-100的裂解液洗滌兩次，含有1 % Triton X-100的裂解液洗滌兩次，最后再用裂解液洗滌一次去除Triton X-100。洗滌后的包涵體用20ml含20mM DTT和8M尿素的裂解液，室溫溶解30min ；離心 (12000rpm,30min)去除不溶解的雜質(zhì)。在含有2M、IM和0. 5M尿素的透析液(50mM TrispH 8. 4,150mM NaCl,5mM EDTA, 2. 5mM cysteine)中分別透析 24hr、4hr 和 4hr 去除尿素；最后在無尿素的透析液中透析24hr，使表皮生長因子復(fù)性形成二硫鍵和正確的構(gòu)象。
權(quán)利要求
1.一種通過原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)的簡便化方法，其特征在于該方法通過如下步驟通過原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)重組表皮生長因子的原核表達(dá)，表皮生長因子的復(fù)性，陰離子交換層析純化目的蛋白，凝膠過濾層析進(jìn)一步純化目的蛋白
2.如權(quán)利要求1所述的通過原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)的簡便化方法， 特征在于所述人源表皮生長因子(EGF)是從大腸桿菌高效表達(dá)的包涵體中進(jìn)行制備純化的。
3.如權(quán)利要求1所述的通過原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)的簡便化方法， 特征在于所述人源表皮生長因子(EGF)的表達(dá)溫度為37°C
4.如權(quán)利要求1所述的通過原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)的簡便化方法， 特征在于所述人源表皮生長因子(EGF)的純化溫度為室溫或4°C。
5.如權(quán)利要求1所述的通過原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)的簡便化方法， 特征在于所述人源表皮生長因子(EGF)液氮冷激后于-80°C保存。
全文摘要
本發(fā)明涉及原核表達(dá)并純化人源表皮生長因子(EGF)的簡便化方法。本發(fā)明的目的在于實(shí)現(xiàn)人來源的表皮生長因子在原核細(xì)胞中的大量表達(dá)，并通過透析復(fù)性和簡單的純化步驟，獲得有活性、純度高的目的蛋白。在工業(yè)生產(chǎn)中滿足生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)成本低，產(chǎn)量高的總體要求。
文檔編號C12N15/12GK102344924SQ201110274408
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者朱月珍, 楊宣武, 柴笑梅, 江永海 申請人:江蘇普羅賽生物技術(shù)有限公司