專利名稱：一種飼用果膠酶pla及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種飼用果膠酶PLA及其基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
果膠主要是直鏈α -1，4糖苷鍵連接的D-半乳糖醛酸殘基組成的復(fù)合多糖，是植物細(xì)胞壁和中膠層的重要組成部分(van Buren JP. Academic Press，1991. p. 1-22)。果膠酶(pectinases)是分解果膠質(zhì)的多種酶的總稱，廣泛存在于高等植物和微生物中，通常動(dòng)物細(xì)胞不能合成這類酶。根據(jù)分解糖苷鍵的反應(yīng)性質(zhì)或降解底物的性質(zhì)可以分為 果膠裂解酶(pectin lyases, PL)、果膠水解酶(pectin hydrolases)、果膠酯酶(pectin esterases, ΡΕ)和原果膠酶(Alkorta I，et al. Process Biochem 1998,33:21—28)。果膠酶按其作用最適PH分為酸性果膠酶和堿性果膠酶。果膠酶是世界五大商品酶之一，堿性果膠酶在紡織行業(yè)上的棉麻脫膠應(yīng)用方面效果顯著，使產(chǎn)品質(zhì)量有所提高，同時(shí)降低或不用化學(xué)品在棉麻脫膠工藝的應(yīng)用，減少了對(duì)環(huán)境的污染等。酸性果膠酶的最適作用PH在偏酸性范圍，主要用于食品行業(yè)的水果榨汁和果汁澄清，降低葡萄酒粘度。酸性果膠酶在飼料行業(yè)有重大的應(yīng)用價(jià)值。目前畜禽常規(guī)日糧組成中，植物性原料占有非常大的比例，其中富含大量果膠的植物細(xì)胞壁成分成為了限制植物性原料利用的首要因素，直接影響著動(dòng)物對(duì)植物性飼料原料中養(yǎng)分的利用率，因此，研究果膠和果膠酶各組分的性質(zhì)，有利于新型綠色酶制劑的開(kāi)發(fā)和利用，進(jìn)而對(duì)提高飼料利用率、改善粗飼料營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、節(jié)約飼料資源、降低生產(chǎn)成本具有重要意義。但目前飼料用酶制劑的研究多集中在纖維素酶、半纖維素和淀粉酶上，對(duì)飼用果膠酶并沒(méi)有進(jìn)行深入的研究。 飼料用酶果膠酶的作用環(huán)境是動(dòng)物的胃腸道，這就要求優(yōu)良的飼料用果膠酶的在酸性和中性及37-40°C范圍內(nèi)均能維持高活性，這樣酶的作用時(shí)間最長(zhǎng)，能最高地發(fā)揮其效率。目前作為工業(yè)應(yīng)用的果膠酶都是從微生物(細(xì)菌，真菌和酵母菌)中得到的。 很多果膠酶已被純化并進(jìn)行了性質(zhì)測(cè)定(Niture SK. Biologia 2008,63 1-19 ；Niture SK. Biologia 2008,63 1-19 ；Alkorta et al. Process Biochem 1998,33:21—28)。一些果膠酶素基因已被克隆，測(cè)序和并進(jìn)行了表達(dá)(Mertens et al. Fungal Genet Biol 2008 ； 45 :1616-16 ),但很多酶的性質(zhì)特征，均存在一些缺陷，例如，pH或溫度作用范圍不合適， 表達(dá)量低等，不能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。因此人們希望能夠找到一種新的能夠滿足實(shí)際應(yīng)用需求的果膠酶，從而能夠進(jìn)一步推廣該果膠酶的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新的飼用果膠酶PLA。本發(fā)明的另一目的是提供編碼上述飼用果膠酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述飼用果膠酶基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述飼用果膠酶基因的重組菌株。
本發(fā)明的另ー目的是提供制備上述飼用果膠酶的方法。本發(fā)明的另一目的是提供上述飼用果膠酶的應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種飼用果膠酶PLA，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示MIRSHLLRLS TRAFAGALLL SPLSAMADHV AEKMLRLQTASGGffSKHYQG KAVDYARDYD60AAERAELQQP GRKDDATIDN NATTTEITYL ARAYRDTGND KYLEAVEKGVEYLLAAQYPN120GGFPQFHPDH SSYRHQVTFN DDAMIGVLDI LQDVAEGKGD TGAQLRSSHGAKSTQAVTRG180LDCILKTQVR IDGELTVffAA QHDEVTLQPA KARNFEPASL ASAESVGVMRFLMRLEQPSA240EVIQAVEAGA DffLEAHRMRD LALERIEAPT QETGKDVRLV ARPGASLffARFYDLQRQQPI300F⑶RDGKALT DYMQVPNERR VGYVffHGTffP EKLLAQEIPKWKAANGL347其中，該酶全長(zhǎng)347個(gè)氨基酸和ー個(gè)終止密碼子，N端27個(gè)氨基酸為其預(yù)測(cè)的信 號(hào)肽序列“MIRSHLLRLS TRAFAGALLL SPLSAMA，，。因此，成熟的果膠酶PLA的理論分子量為35. 8kDa,其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示DHVAEKMLRL QTASGGffSKH YQGKAVDYAR DYDAAERAELQQPGRKDDAT IDNNATTTEI60TYLARAYRDT GNDKYLEAVE KGVEYLLAAQ YPNGGFPQFHPDHSSYRHQV TFNDDAMIGV120LDILQDVAEG KGDTGAQLRS SHGAKSTQAV TRGLDCILKT QVRIDGELTVWAAQHDEVTL180QPAKARNFEP ASLASAESVG VMRFLMRLEQ PSAEVIQAVE AGADffLEAHRMRDLALERIE240APTQETGKDV RLVARPGASL WARFYDLQRQ QPIF⑶RDGK ALTDYMQVPNERRVGYVffHG300TffPEKLLAQE IPKffKAANGL 320本發(fā)明提供了編碼上述果膠酶PLA的基因。本發(fā)明通過(guò)PCR的方法從環(huán)境基因組 直接分離克隆了這ー果膠酶基因P1A，DNA全序列分析結(jié)果表明，果膠酶PLA的基因plA全 長(zhǎng)1，044bp，序列如SEQ ID NO. 3所示atgatccgtt cgcacctgct gcgtctgtcc acgcgcgcct tcgccggcgc cctgttgctc 60tcgccattga gtgccatggc cgaccacgtg gccgaaaaga tgctgcgcct gcagaccgcc 120tcgggtggtt ggtccaagca ctaccagggc aaggcggtgg actacgcgcg cgattatgac 180gccgccgaac gcgccgagct ccagcaaccc gggcgcaagg acgacgccac catcgacaac 240aatgcgacca cgaccgaaat cacgtacctg gcgcgcgcct atcgcgacac gggcaacgac 300aagtacctgg aagccgtcga gaagggcgtg gagtacctgc tcgcagcgca atacccgaat 3d0
ggtggcttcccgcagttccacccggaccattcgtcctaccgccaccaggtcaccttcaac420
gacgacgccatgatcggcgtgctcgacatcttgcaggacgtggccgagggcaagggcgac480
accggcgcgcagctgcgtagtagccacggcgcaaagtcgacccaggcggtgacccggggc540
ctggactgcatcctcaagacccaggtccgcatcgacggcgaactcaccgtgtgggccgcg600
cagcatgacgaagtcacgctccagccggccaaggcgcgtaacttcgagcccgcttcgctg660
gcgtccgccgagtcggtcggcgtgatgcggttcctgatgcgcttggagcaaccgtcggcc720
gaggtgattcaggcggtggaagcgggcgccgactggttggaagctcatcgcatgcgcgat780
CtggCCCtggaacgcatcgaggcccccacccaggaaaccggcaaggatgtgcgcctcgtc840
gcgcgtccgggtgcgtcattatgggcgcgcttctacgacctgcagcgccaacagccgatc900
tttggcgaccgcgatggcaaggcattgaccgactacatgcaagtgcccaacgagcgccgc960
gtcggttacgtgtggcatggcacctggccg gaaaagttgttggcgcaaga aatccccaag1020
tggaaggccg ccaatggcct gtaa1044
其中，信號(hào)肽的堿基序列I“ATGATCCGTTCGCACCTGCTGCGTCTGTCCACGCGCGCCTTCG CCGGCGCCCTGTTGCTCTCGCCATTGAGTGCCATGGCC”，該酶的成熟蛋白的編碼序列如 SEQ IDNO. 4 所ΛΙ、
gaccacgtggccgaaaagatgctgcgcctgcagaccgcctcgggtggttggtccaagcac60
taccagggcaaggcggtggactacgcgcgcgattatgacgccgccgaacgcgccgagctc120
cagcaacccgggcgcaaggacgacgccaccatcgacaacaatgcgaccacgaccgaaatc180
acgtacctggcgcgcgcctatcgcgacacgggcaacgacaagtacctggaagccgtcgag240
aagggcgtggagtacctgctcgcagcgcaatacccgaatggtggcttcccgcagttccac300
ccggaccattcgtcctaccgccaccaggtcaccttcaacgacgacgccatgatcggcgtg360
ctcgacatcttgcaggacgtggccgagggcaagggcgacaccggcgcgcagctgcgtagt420
agccacggcgcaaagtcgacccaggcggtgacccggggcctggactgcatcctcaagacc480
caggtccgcatcgacggcgaactcaccgtgtgggccgcgcagcatgacgaagtcacgctc540
cagccggccaaggcgcgtaacttcgagcccgcttcgctggcgtccgccgagtcggtcggc600
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gcccccacccaggaaaccggcaaggatgtgcgcctcgtcgCgCgtCCgggtgcgtcatta780
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acctggccggaaaagttgttggcgcaagaaatccccaagtggaaggccgccaatggcctg960
taa963本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因plA的重組載體，優(yōu)選為pPIC9_plA。將本發(fā)明的果膠酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將果膠酶基因插入到質(zhì)粒pPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-plA。本發(fā)明還提供了包含上述果膠酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株GS115/plA。本發(fā)明還提供了一種制備果膠酶的方法，包括以下步驟
1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組果膠酶的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的果膠酶。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或絲狀真菌細(xì)胞，優(yōu)選將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic pastoris)，得到重組菌株。本發(fā)明還提供了上述果膠酶的應(yīng)用，優(yōu)選該酶在水解果膠以及其在飼料、食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用。本發(fā)明直接從環(huán)境基因組克隆果膠酶基因，并實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)。提供的果膠酶具有寬的作用PH范圍，具有較好的耐熱性，在酸性、中性甚至堿性條件下都有高活性。本發(fā)明表達(dá)的果膠酶為一個(gè)低溫果膠酶，最適溫度為30°C，并且在0°C時(shí)仍有30%以上的酶活，可應(yīng)用于飼料、食品等工業(yè)，或用于工業(yè)制備果膠酶。根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案可以實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)果膠酶。


圖1重組果膠酶的SDS-PAGE分析，1 蛋白質(zhì)Marker ；2 甲醇誘導(dǎo)前發(fā)酵液上清； 3 甲醇誘導(dǎo)之后發(fā)酵液上清；4 純化的重組果膠酶PLA。圖2重組果膠酶的最適pH。圖3重組果膠酶的pH穩(wěn)定性。圖4重組果膠酶作用的最適溫度。圖5重組果膠酶的熱穩(wěn)定性。
具體實(shí)施例方式實(shí)驗(yàn)條件1、菌株及載體大腸桿菌菌株(Escherichia coli) JM109、載體pEASY-！^購(gòu)自全式金公司；畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9及菌株GSl 15購(gòu)自于^witrogen公司。2、酶類及其它生化試劑工具酶包括限制性內(nèi)切酶、Taq酶購(gòu)自TakaRa公司，連接酶購(gòu)自hvitrogen公司，宏基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司，DNA純化、凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化公司。果膠、半乳糖醛酸、多聚半乳糖醛酸購(gòu)自Sigma公司，其它都為國(guó)產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購(gòu)買得到)。3、培養(yǎng)基(1)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，pH7.0)。(2)MM 固體培養(yǎng)基1. 34% YNB,0. 00004% Biotin,0. 5% 甲醇，1. 5%瓊脂糖。(3)MD 固體培養(yǎng)基1. 34% YNB, 0. 00004% Biotin，2%葡萄糖，1. 5%瓊脂糖。(4) BMGY 培養(yǎng)基1 %酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34% YNB, 0. 00004% Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(5)BMMY培養(yǎng)基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY培養(yǎng)基相同。標(biāo)準(zhǔn)的分子操作技術(shù)如質(zhì)粒提取、凝膠電泳、大腸桿菌轉(zhuǎn)化、酵母轉(zhuǎn)化均為本領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)說(shuō)明操作。在以下實(shí)施例中未作詳細(xì)介紹的技術(shù)，均按照以下實(shí)驗(yàn)手冊(cè)或文獻(xiàn)中的相關(guān)章節(jié)或部分來(lái)進(jìn)行，包括Sambrook等人，Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第 3 版.2001) ；Kriegler, Gene Transfer and Expression :A Laboratory Manual (1990)；禾口 Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人編，1994)。實(shí)施例1 土壤微生物宏基因組DNA的提取和純化土壤樣品采自廣西果汁廠，結(jié)合物理和化學(xué)裂解的方法提取土壤微生物的宏基因組DNA，物理的方法主要是液氮研磨，化學(xué)裂解的方法主要參照Brady (Brady SF, Nat Protoc 2007，2 :1297-1305)，以下是具體的操作流程(1)將IOg 土壤加入到研缽中，倒入液氮冷凍，用杵子將土壤用力研磨，解凍后再次加入液氮研磨，重復(fù)三次，使土壤研磨充分；(2)將研磨好的土壤加入到50ml的離心管中，加入預(yù)熱的20ml DNA裂解緩沖溶液，來(lái)回顛倒混勻后放在70°C水浴鍋放置3h，期間每隔15min將離心管來(lái)回顛倒數(shù)次，目的是使土壤中的微生物充分裂解；(3) 14，000Xg，4°C，離心IOmin ；將上清液轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的50mL離心管中；(4)重復(fù)第3步，將上清轉(zhuǎn)移至另一個(gè)新的50mL離心管中，加入0. 7倍體積的異丙醇，混勻，_20°C放置30min;(5)16，000Xg，4°C，離心15min ；去上清，沉淀用70 %乙醇清洗，相同條件下再次離心，將帶有沉淀的離心管真空干燥；(6)用 ImL TE buffer (pH 7. 5)溶解；(7)加入 20 μ L 10mg/mL RNase (DNase-free)，37°C溫浴 IOmin 去除 RNA ；(8)配置回收膠將粗提的宏基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；(9)將回收膠中的宏基因組DNA切回，利用Cycle-Pure DNA回收試劑盒進(jìn)行純化；(10)取5 μ L純化后的宏基因組DNA用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量；(11)將純化的宏基因組于-20°C保存?zhèn)溆谩?shí)施例2果膠酶基因保守區(qū)序列的獲得根據(jù)果膠裂解酶pf09492基因的保守(A Q Y P N G G W/F和W A/G Q Q H/Y D E)序列設(shè)計(jì)合成了簡(jiǎn)并引物pf09492-PF，pf09492-PR pf09492-PF 5‘ -GCTCAGTACCCNAAYGGNGGNT-3‘；pf09492-PR 5‘ -CTCGTCGTRYTGYTGNSCCCA-3‘其中=Y= C/T, R = A/G, S = C/G, N = A/T/G/C。利用上述簡(jiǎn)并引物以土壤生物宏基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因的部分片段。PCR 反應(yīng)參數(shù)為95°C 5min ；94°C 30sec,51°C 30sec，72°C lmin,30 個(gè)循環(huán)后； 72°C lOmin，瓊脂糖電泳檢測(cè)。得到約250bp的片段，回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物技術(shù)有限公司測(cè)序。實(shí)施例3果膠酶基因全長(zhǎng)序列的獲得從以上獲得的大量果膠酶片段中隨機(jī)各挑選1個(gè)果膠酶基因片段進(jìn)行全基因的克隆。根據(jù)目的基因的已知序列片段設(shè)計(jì)4個(gè)目的基因的特異性引物對(duì)SP1、SP2、SP3和 SP4，各特異性引物對(duì)分別包含特異性上游引物和特異性下游引物，其序列見(jiàn)表1。以特異性引物對(duì)SPl分別對(duì)所選出的果膠酶基因片段進(jìn)行第一輪TAIL-PCR擴(kuò)增，針對(duì)目標(biāo)序列含量低的特點(diǎn)，增加了一步特異性引物SPl單引物對(duì)目標(biāo)模板序列進(jìn)行擴(kuò) ±曾，以提高目標(biāo)片段的拷貝數(shù)。以特異性引物對(duì)SP2對(duì)和簡(jiǎn)并引物對(duì)第一輪TAIL-PCR產(chǎn)物進(jìn)行第二輪TAIL-PCR擴(kuò)增。首先，單獨(dú)的加入AD引物，通過(guò)低溫退火，盡可能的與目標(biāo)序列結(jié)合，合成目標(biāo)序列的第二條鏈，再加入SP2引物，利用TAIL-PCR的大循環(huán)的程序特異性的擴(kuò)增目標(biāo)序列，接下來(lái)的第三輪和第四輪PCR與常規(guī)的TAIL-PCR的第二輪和第三輪基本相似。 表1.果膠酶基因plaTAIL-PCR特異性引物
權(quán)利要求
1.一種飼用果膠酶PLA，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所示。
2.一種飼用果膠酶基因plA，其特征在于，編碼權(quán)利要求1所述的飼用果膠酶PLA。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的飼用果膠酶基因plA，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如 SEQ ID NO. 3 或 SEQ ID NO. 4 所示。
4.包含權(quán)利要求2或3所述飼用果膠酶基因plA的重組載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體為pPIC9-plA。
6.包含權(quán)利要求2或3所述飼用果膠酶基因plA的重組菌株。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組菌株，其特征在于，所述重組菌株為畢赤酵母GS115。
8.一種制備飼用果膠酶PLA的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求4的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組飼用果膠酶PLA的表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的飼用果膠酶PLA。
9.權(quán)利要求1所述飼用果膠酶PLA的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種飼用果膠酶PLA及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種新的飼用果膠酶PLA，其具有如SEQ ID NO.1或2所示氨基酸序列，且本發(fā)明還提供了編碼上述飼用果膠酶PLA的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3或4所示，以及包含該基因的重組載體和重組菌株及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的飼用果膠酶PLA最適pH為7.0，在pH 3.0-9.0均具有50％以上的活性；穩(wěn)定的pH值范圍為3.0至10.0；最適溫度是30℃，在10-50℃之間，均具有70％以上酶活性，在0℃時(shí)仍具有30％以上的活性，在40℃條件下有較好熱穩(wěn)定性。本發(fā)明可應(yīng)用于飼料、食品等多種工業(yè)用于降解植物中的果膠。
文檔編號(hào)C12N9/26GK102296054SQ20111027502
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者湯海鷗, 王曉睿, 王海燕, 謝寧, 黃輝 申請(qǐng)人:北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司