專利名稱：口蹄疫純化疫苗及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種口蹄疫疫苗及其制備方法，特別涉及一種口蹄疫純化疫苗的制備方法及由該制備方法得到的口蹄疫純化疫苗，還涉及得到的口蹄疫疫苗在制備預(yù)防動物口蹄疫藥物中的應(yīng)用。屬于疫苗制備領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著家畜集約化養(yǎng)殖水平的提高，尤其是奶牛飼養(yǎng)量的增大，疫苗的輕微副反應(yīng)，就可帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，如懷孕牛流產(chǎn)、泌乳牛產(chǎn)奶量下降、乳品質(zhì)下降等，無任何副反應(yīng)的疫苗在市場上有巨大的需求空間?，F(xiàn)有的口蹄疫滅活疫苗主要存在以下兩個問題1.免疫保護(hù)力不穩(wěn)定，主要表現(xiàn)在免疫后檢測不到中和抗體或者抗體水平很低，或者免疫期較短，只有2 3個月；2.免疫副反應(yīng)大，主要是下游生產(chǎn)工藝仍為傳統(tǒng)方法，未經(jīng)純化處理，疫苗中存在一些培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞中的雜質(zhì)及過敏性物質(zhì)，而且有效抗原含量低。這對口蹄疫的免疫防控工作帶來極大的影響。近些年來，國內(nèi)外關(guān)于疫苗分離純化的研究群雄并起，異軍突起，成績斐然。在人用生物制品中，通過FDA認(rèn)證的疫苗已有上百種，而正在研制開發(fā)中的疫苗達(dá)數(shù)千種之多，有關(guān)疫苗研究的科學(xué)論文和專利幾乎都涉及到分離純化技術(shù)，近年來這類文獻(xiàn)呈現(xiàn)指數(shù)增長態(tài)勢。但分離純化技術(shù)仍未在獸用疫苗的生產(chǎn)中得到應(yīng)用。隨著我國畜牧業(yè)的發(fā)展，人們對獸用疫苗純度和安全性等提出更高要求。疫苗的分離純化主要是去除培養(yǎng)基和宿主細(xì)胞中的雜蛋白、肽、核酸及污染菌和它產(chǎn)生的內(nèi)毒素，傳統(tǒng)的蔗糖密度梯度離心法、沉淀和過濾技術(shù)在疫苗的抗原純化中仍被普遍采用，但絕大部分是簡單分離得到的粗制疫苗，其中抗原含量較低，且可能含有一些雜質(zhì)和過敏性物質(zhì)，這些傳統(tǒng)疫苗的處理方法一般均存在純度、活力以及安全性偏低，不適合應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)等缺點(diǎn)，滿足不了新疫苗的研制和生產(chǎn)的需要。疫苗的純化以層析法提純最為可靠，目前應(yīng)用的領(lǐng)域僅限于人用生物制品，如乙肝、狂犬、出血熱、流感、小兒麻痹疫苗等少數(shù)一些病毒性疫苗的研究和生產(chǎn)中。國內(nèi)外尚未有用層析技術(shù)進(jìn)行獸用疫苗純化的報道。本項目發(fā)明技術(shù)的突破，不僅提高我國動物疫苗生產(chǎn)工藝水平和疫苗質(zhì)量，推動我國獸用疫苗行業(yè)的發(fā)展，而且將促使我國從疫苗生產(chǎn)大國向疫苗生產(chǎn)強(qiáng)國發(fā)展，合乎世界生物制藥發(fā)展趨勢，具有廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的第一個技術(shù)問題是提供一種制備口蹄疫純化疫苗的方法，本發(fā)明的一種口蹄疫純化疫苗的制備方法，其特征在于包括將經(jīng)過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的口蹄疫病毒液中的細(xì)胞碎片去除后，濃縮至適當(dāng)倍數(shù)，用硫酸魚精蛋白沉淀去除大部分宿主細(xì)胞雜蛋白和核酸，離心，上清液通過聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行洗脫，收集第一個洗脫峰，過濾除菌后滅活，加入佐劑進(jìn)行乳化，分裝即得。本發(fā)明所述的制備方法，其特征在于具體的包括以下步驟(I)將口蹄疫病毒種毒接種懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)15 28小時；(2)收獲經(jīng)過BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的口蹄疫病毒，通過微孔過濾系統(tǒng)去除細(xì)胞碎片，得到微濾液；(3)微濾液濃縮至微濾液原體積的1/10-1/100，得到微濾液的濃縮液；(4)向步驟(3)得到的濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度達(dá)到1. Omg/ml 2. 5mg/ml的，室溫(25°C )攪拌0. 5h 2. Oh,靜置作用0. 5h 2. Oh后，5000rpm IOOOOrpm離心15min 60min,棄沉淀,取離心上清,得到濃縮口蹄疫病毒上清液；
·
(5)將聚丙烯酰胺葡凝膠裝入層析柱，用I 2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡該層析柱，將步驟(4)離心獲得的濃縮口蹄疫病毒上清液加于該聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠上面，待病毒液全部進(jìn)入凝膠之后，再用PH7. 4 8. O的0. OIM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫；(6)收集第一個洗脫峰，過濾除菌后用ImM 3mM的BEI 30°C滅活28小時，滅活液經(jīng)2 10倍稀釋后(用PH7. 4 8. 0的0. OlM磷酸鹽緩沖液稀釋，具體實(shí)施例中有記載)，按1:1重量比加礦物油佐劑乳化，分裝得口蹄疫純化疫苗。在本發(fā)明中，所述的口蹄疫病毒毒株為口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一種。這是因?yàn)楸景l(fā)明的口蹄疫病毒的柱層析純化方法的根據(jù)是完整口蹄疫病毒粒子大小，而口蹄疫病毒各型毒株的完整口蹄疫病毒粒子大小是一樣的，因而口蹄疫病毒各種血清型疫苗毒株均可采用本發(fā)明的方法進(jìn)行純化疫苗的制備。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的口蹄疫病毒毒株為0型口蹄疫毒種0NXC/92株(口蹄疫病毒0型-Asia I型二價滅活疫苗毒種種子批的建立(I)，徐春河等，中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會口蹄疫學(xué)分會第i^一次學(xué)術(shù)研討會會議論文)、亞洲I型毒種Asial/JSL/GSZY/06株(口蹄疫0型、Asia I型二價滅活疫苗的研制與應(yīng)用，黃炯，獸醫(yī)導(dǎo)刊，2009年06期)、0型口蹄疫毒種0R/80株(豬口蹄疫0型滅活疫苗(50)效檢攻毒方式探索，郎洪武等，《中國獸藥雜志》2004年03期)或0型口蹄疫毒種0/ZK/93-08株(豬口蹄疫0型滅活疫苗0ZK/93株與0ZK/93株+0S/99株免疫效果對比試驗(yàn)，徐新紅等，飼料與畜牧 規(guī)模養(yǎng)豬2010，(9))。所述的毒種——0型口蹄疫毒種0NXC/92株、亞洲I型毒種Asial/JSL/GSZY/06株、0型口蹄疫毒種0R/80株或0型口蹄疫毒種0/ZK/93-08株購買自蘭州獸醫(yī)研究所。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的微孔過濾系統(tǒng)優(yōu)選孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的濾芯一起聯(lián)合使用，或者5微米，I微米和0. 45微米的振動篩一起聯(lián)合使用，或者5微米，I微米和0. 45微米中空纖維柱一起聯(lián)合使用。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，步驟(3)中所述的濃縮為使用PEG6000進(jìn)行病毒沉淀濃縮或者使用截留分子量為6kd-20kd的中空纖維柱或者截留分子量為6kd-20kd的膜包進(jìn)行濃縮。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠為組分收集范圍為1.0X104 1. OX IO8球蛋白分子量的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠。更優(yōu)選為組分收集范圍為1. OX IO4 1. 5X IO6球蛋白分子量的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠。所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠包括但不限于sephacryl S_300、sephacryl S-400或sephacrylS-500。更優(yōu)選為 sephacryl S-300。硫酸魚精蛋白(貨號p4380)，BEI，均為sigma公司產(chǎn)品；206佐劑購自法國S印pic公司；PEG6000購自AMRESC0公司?？罩鵛K26 ;凝膠介質(zhì)填料s印hacryl S-300, sephacrylS-400及s印hacryl S-500均為GE公司產(chǎn)品。本發(fā)明所要解決的第二個技術(shù)問題是提供由以上所述的制備方法制備得到的口
蹄疫純化疫苗。本發(fā)明所要解決的第三個技術(shù)問題是提供有本發(fā)明方法制備得到的口蹄疫純化疫苗在制備預(yù)防動物口蹄疫疾病藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的口蹄疫純化疫苗的制備方法，通過將口蹄疫病毒接種懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞，收獲后去除細(xì)胞碎片，適當(dāng)濃縮后，用硫酸魚精蛋白沉淀去除大部分宿主細(xì)胞雜蛋白和核酸，離心，取離心上清作為層析上樣樣品，層析介質(zhì)聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠經(jīng)濟(jì)高效、處理量大，化學(xué)穩(wěn)定性高，耐受性好，非常適合工業(yè)化使用，且成本低，工藝簡單、合理，可有效去除宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，雜蛋白和核酸去除率大于90%，病毒回收率大于85%，由本發(fā)明方法制備得到的口蹄疫純化滅活疫苗安全，免疫性好、性質(zhì)穩(wěn)定。


圖1為使用Sepharose 4FF得到的層析圖譜；圖2為使用Sepharose 6FF得到的層析圖譜；圖3為使用DEAE Sepharose得到的層析圖譜；圖4為使用Sephacryl S-500得到的層析圖譜；圖5為使用Sephacryl S-400得到的層析圖譜；圖6為使用S印hacryl S-300得到的層析圖譜。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1?？谔阋叨r滅活純化疫苗(0NXC株+JSL株)的制備I 材料1.1疫苗毒株制造本品用0型口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)用毒種為0NXC/92株以及亞洲I型口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)用毒種為Asial/JSL/GSZY/06株購買自蘭州獸醫(yī)研究所。1. 2化學(xué)試劑BHK21細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)按照現(xiàn)有常規(guī)方法制備，保藏；硫酸魚精蛋白(貨號p4380)，sigma公司產(chǎn)品；206佐劑購自法國S印pic公司。1. 3層析柱與凝膠介質(zhì)凝膠介質(zhì)填料sephacryl S-300、空柱XK26均為GE公司
女口
廣叩；1. 4微孔過濾系統(tǒng)孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的濾芯一起聯(lián)合使用，上海金科過濾器材有限公司產(chǎn)品。
1. 5濃縮系統(tǒng)截留分子量為IOkd的膜包，德國賽多利斯公司制造。2 方法(I)將口蹄疫病毒種毒0NXC/92株、Asial/JSL/GSZY/06株分別接種懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)20小時。 (2)分別收獲經(jīng)過BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的口蹄疫病毒0NXC/92、Asial/JSL/GSZY/06,分別通過孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的濾芯去除細(xì)胞碎片，得到口蹄疫病毒0NXC/92、Asial/JSL/GSZY/06 的微濾液。(3)步驟(2)得到的微濾液分別用膜包超濾濃縮系統(tǒng)濃縮至原體積的1/40。(4)分別向步驟(3)得到的微濾液的超濾濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度為1. Omg/ml，室溫攪拌0. 5h，靜置作用Ih后，7000rpm離心30min，棄沉淀， 取離心上清。(5)將sephacryl S-300凝膠裝入層析柱，用2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將離心獲得的該兩種濃縮口蹄疫病毒液分別各自加于sephacryl S-300凝膠上面，待病毒液全部進(jìn)入凝膠之后，再用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。(6)分別收集第一個洗脫峰，過濾除菌后分別用3mM的BEI (BEA加0. 2N的氫氧化鈉的作用下環(huán)化生成BEI。) 30°C滅活28小時，滅活0NXC/92株和Asial/JSL/GSZY/06株抗原液按1:1體積比混合，用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行4倍稀釋后，再按I I重量比加206佐劑乳化，分裝得?？谔阋叨r滅活純化疫苗。實(shí)施例2豬口蹄疫O型滅活純化疫苗(0R/80株+0/ZK/93-08株)的制備I 材料1.1疫苗毒株制造本品用口蹄疫毒種為O型口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)用毒種0R/80株和O型口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)用毒種0/ZK/93-08株購買自蘭州獸醫(yī)研究所。1. 2化學(xué)試劑BHK21細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)按照現(xiàn)有常規(guī)方法制備，保藏；硫酸魚精蛋白(貨號p4380)，sigma公司產(chǎn)品；206佐劑購自法國S印pic公司。1. 3層析柱與凝膠介質(zhì)空柱XK26 ;凝膠介質(zhì)填料sephacryl S-300均為GE公司
女口
廣叩；1. 4微孔過濾系統(tǒng)孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的中空纖維柱一起聯(lián)合使用，天津愛生膜過濾技術(shù)有限公司產(chǎn)品。1. 5濃縮系統(tǒng)截留分子量為6-10kd的中空纖維柱，天津愛生膜過濾技術(shù)有限公司產(chǎn)品。2 方法(I)將口蹄疫病毒種毒0R/80株和0/ZK/93-08株分別接種懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)25小時。(2)分別收獲經(jīng)過BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的口蹄疫病毒，通過孔徑為5微米、I微米和0. 45微米的中空纖維柱去除細(xì)胞碎片，分別得到口蹄疫病毒種毒0R/80和0/ZK/93-08的微濾液。(3)步驟(2)得到的微濾液分別用中空纖維柱超濾濃縮系統(tǒng)濃縮至原體積的1/60。
(4)分別向步驟(3)得到的微濾液的超濾濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度為2. Omg/ml，室溫攪拌1. 5h，靜置作用0. 5h后，IOOOOrpm離心15min，棄沉淀，取離心上清。(5)將s印hacryl S-300裝入層析柱，用2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將離心獲得的濃縮口蹄疫病毒離心上清液分別各自加于凝膠上面，待病毒液全部進(jìn)入凝膠之后，再用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。(6)分別收集第一個洗脫峰，過濾除菌后分別用2. OmM的BEI (BEA加0. 2N的氫氧化鈉的作用下環(huán)化生成BEI。)30°C滅活28小時，滅活0R/80株和0/ZK/93-08株抗原按I I體積比混合，用PH7. 4 8. 0的0. OlM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行5倍稀釋后，再按1:1重量比加206佐劑乳化，分裝得豬口蹄疫0型滅活純化疫苗。實(shí)施例3豬口蹄疫0型滅活純化疫苗(0R/80株+0/ZK/93-08株)的制備
I 材料1.1疫苗毒株制造本品用口蹄疫毒種為0型口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)用毒種0R/80株和0型口蹄疫滅活疫苗生產(chǎn)用毒種0/ZK/93-08株購買自蘭州獸醫(yī)研究所。1. 2化學(xué)試劑BHK21細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)按照現(xiàn)有常規(guī)方法制備，保藏；硫酸魚精蛋白(貨號P4380)，8￡八，均為sigma公司產(chǎn)品;206佐劑購自法國S印pic公司；PEG6000購自AMRESCO 公司。1. 3層析柱與凝膠介質(zhì)空柱XK26 ;凝膠介質(zhì)填料sephacryl S-300均為GE公司
女口
廣叩；1. 4微孔過濾系統(tǒng)孔徑為5微米，I微米和0. 45微米的中空纖維柱一起聯(lián)合使用，天津愛生膜過濾技術(shù)有限公司產(chǎn)品。2 方法(I)將口蹄疫病毒種毒0R/80株和0/ZK/93-08株分別接種懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)28小時。(2)分別收獲經(jīng)過BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的口蹄疫病毒，通過孔徑為5微米、I微米和0. 45微米的中空纖維柱去除細(xì)胞碎片，分別得到口蹄疫病毒種毒0R/80和0/ZK/93-08的微濾液。(3)按質(zhì)量體積百分比(g/ml)計，分別向步驟⑵得到的微濾液中加入NaCl，使得NaCl的終濃度為4% (即每IOOml微濾液中所加入的NaCl質(zhì)量為4g)，充分溶解后加A PEG6000,使得PEG6000終濃度為8% (即每IOOml微濾液中所加入的PEG6000的質(zhì)量為8g)，4°C下攪拌混合16h，7000rpm高速離心1. 5h，獲得口蹄疫病毒沉淀，使用TEN緩沖液(0. OlM Tris, 0. OlM EDTA，0.1M NaCl，PH為7. 6-8. 0)重懸病毒沉淀，得到濃縮至原體積的1/80的病毒濃縮液；(4)分別向步驟(3)得到的微濾液的超濾濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度為1. 5mg/ml，室溫攪拌lh，靜置作用0. 5h后，7000rpm離心45min，棄沉淀，取離心上清。(5)將s印hacryl S-300裝入層析柱，用2倍柱體積的PH7. 4 8. O的0. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將離心獲得的濃縮口蹄疫病毒離心上清液分別各自加于凝膠上面，待病毒液全部進(jìn)入凝膠之后，再用PH7. 4 8. O的0. OlM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫。
(6)分別收集第一個洗脫峰，過濾除菌后分別用2. OmM的BEI (BEA加0. 2N的氫氧化鈉的作用下環(huán)化生成BEI。)30°C滅活28小時，滅活0R/80株和0/ZK/93-08株抗原按I I體積比混合，用PH7. 4 8. 0的0. OlM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行7倍稀釋后，再按1:1重量比加206佐劑乳化，分裝得豬口蹄疫0型滅活純化疫苗。實(shí)施例4疫苗檢測將實(shí)施例1制備得到的?？谔阋叨r滅活純化疫苗(0NXC株+JSL株)(內(nèi)部批號2011RD001)用于以下檢測攻擊用毒種為0型口蹄疫毒種0NXC/92株，亞洲I型毒種Asial/JSL/GSZY/06株的同源鼠毒毒株購買自蘭州獸醫(yī)研究所。對照疫苗口蹄疫0型、亞洲I型二價滅活疫苗(0NXC株+JSL株)，生產(chǎn)批號20110202，生產(chǎn)日期20110322，為內(nèi)蒙古必威安泰生物科技有限公司產(chǎn)品。以對照疫苗為參照，在按照現(xiàn)有農(nóng)業(yè)部組織擬定的《口蹄疫0型、亞洲I型二價滅活疫苗制造及檢驗(yàn)試行規(guī)程》進(jìn)行物理性狀、無菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、效力檢驗(yàn)的基礎(chǔ)上，效力檢驗(yàn)按照每頭份Iml免疫，同時增加了對奶牛泌乳量的影響的試驗(yàn)。I物理性狀?？谔阋叨r滅活純化疫苗物理性狀檢驗(yàn)結(jié)果見表I。表I物理性狀檢驗(yàn)結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種口蹄疫純化疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步驟將經(jīng)過細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的口蹄疫病毒液中的細(xì)胞碎片去除后，濃縮至適當(dāng)倍數(shù)，用硫酸魚精蛋白沉淀去除大部分宿主細(xì)胞雜蛋白和核酸，離心，上清液通過聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠柱層析進(jìn)行洗脫，收集第一個洗脫峰，過濾除菌后滅活，加入佐劑進(jìn)行乳化，分裝即得。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于具體包括以下步驟 (1)將口蹄疫病毒種毒接種懸浮培養(yǎng)的BHK21細(xì)胞，繼續(xù)懸浮培養(yǎng)15 28小時； (2)收獲經(jīng)過BHK21細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的口蹄疫病毒，通過微孔過濾系統(tǒng)去除細(xì)胞碎片，得到微濾液； (3)微濾液濃縮至微濾液原體積的1/10 1/100，得到微濾液的濃縮液； (4)向步驟(3)得到的濃縮液中加入硫酸魚精蛋白，使硫酸魚精蛋白的終濃度達(dá)到1. Omg/ml 2. 5mg/ml,室溫攬祥O. 5h 2. Oh,靜置作用O. 5h 2. Oh后，5000rpm IOOOOrpm離心15min 60min,棄沉淀,取離心上清,得到濃縮口蹄疫病毒上清液； (5)將聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠裝入層析柱，用I 2倍柱體積的PH7.4 8. O的O. OlM的磷酸鹽緩沖液平衡層析柱，將步驟(4)離心獲得的濃縮口蹄疫病毒上清液加于聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠上面，待病毒液全部進(jìn)入凝膠之后，再用PH7. 4 8. O的O. OlM磷酸鹽緩沖液進(jìn)行洗脫； (6)收集第一個洗脫峰，過濾除菌后用ImM 3mM的BEI30°C滅活28小時，滅活液經(jīng)2-10倍稀釋后，按1:1重量比加礦物油佐劑乳化，分裝得口蹄疫滅活疫苗。
3.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于所述的口蹄疫病毒毒株為口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一種。
4.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(2)中所述的微孔過濾系統(tǒng)為孔徑為5微米，I微米和O. 45微米的濾芯一起聯(lián)合使用或者孔徑為5微米，I微米和O. 45微米的振動篩一起聯(lián)合使用，或者孔徑為5微米，I微米和O. 45微米中空纖維柱一起聯(lián)合使用。
5.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟(3)中所述的濃縮為使用PEG6000進(jìn)行病毒沉淀濃縮或者使用截留分子量為6kd-20kd的中空纖維柱或者截留分子量為6kd-20kd的膜包進(jìn)行濃縮。
6.如權(quán)利要求1或2所述的制備方法，其特征在于所述的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠為組分收集范圍為1. OXIO4 1. OXIO8球蛋白分子量的高分辨率聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠。
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于所述的高分辨率的聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠組分收集范圍為1. OX IO4 1. 5X IO6球蛋白分子量。
8.由權(quán)利要求1-7任一項所述的制備方法制備得到的口蹄疫純化疫苗。
9.權(quán)利要求8所述的口蹄疫純化疫苗在制備預(yù)防動物口蹄疫疾病藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種口蹄疫純化疫苗及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明的制備方法首先用硫酸魚精蛋白沉淀去除大部分宿主細(xì)胞雜蛋白和核酸；然后病毒液經(jīng)濃縮系統(tǒng)濃縮后作為層析上樣樣品。層析介質(zhì)選用聚丙烯酰胺葡聚糖凝膠進(jìn)行純化洗脫，收集第一個洗脫峰，過濾除菌后滅活，加入佐劑進(jìn)行乳化，分裝即得口蹄疫純化疫苗。本發(fā)明的制備方法經(jīng)濟(jì)高效、且成本低，工藝簡單、合理，能有效去除宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基中的雜質(zhì)，病毒回收率大于85％，蛋白和核酸去除率大于90％，由本發(fā)明方法制備得到的口蹄疫純化疫苗安全，免疫性好、性質(zhì)穩(wěn)定。
文檔編號C12N7/02GK102988970SQ201110275159
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者徐樹蘭, 張海艷, 李少英, 趙炳武, 辛俊寶, 張澍, 王欽富, 武華 申請人:內(nèi)蒙古必威安泰生物科技有限公司