專利名稱：一種多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)及其應(yīng)用和制備的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬腫瘤分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)及其應(yīng)用和制備的試劑盒。
背景技術(shù)：
腫瘤是一種多基因復(fù)雜性疾病，其發(fā)生是環(huán)境因素與腫瘤遺傳易感因素共同作用的結(jié)果。基因突變是導(dǎo)致不同個體對腫瘤遺傳易感存在差異的重要原因。瘤基因與抑瘤基因的突變、線粒體DNA突變以及不穩(wěn)定性三核苷酸重復(fù)序列的動態(tài)突變等均與腫瘤的遺傳易感性相關(guān)。如果瘤基因與抑瘤基因的突變，存在家族與人群聚集性，可顯著提高患腫瘤的風(fēng)險，那么對于這些突變位點(diǎn)在健康或腫瘤人群中進(jìn)行篩查，無疑能對具有腫瘤遺傳易感傾向的人群起到的風(fēng)險預(yù)警和早期診斷的作用。傳統(tǒng)的突變檢測方法是采用一些已有的成熟技術(shù)，如DNA測序、限制性酶切片段長度多態(tài)性(RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交(ASO)等。 這些技術(shù)雖在某種程度上能完成對突變位點(diǎn)的檢測，但由于它們必須通過凝膠電泳進(jìn)行檢測，因此，距快速、高效、自動化的檢測目標(biāo)還相差甚遠(yuǎn)。傳統(tǒng)的RFLP只能檢測到突變的一部分，測序技術(shù)既費(fèi)時費(fèi)力，又不易實(shí)現(xiàn)自動化，而且DNA鏈的二級結(jié)構(gòu)還容易造成人工假相，使測序結(jié)果出現(xiàn)偏差，不適宜于突變的檢測；SSCP則很難滿足自動化的需要，難以大規(guī)模開展工作。因此，這些方法均未被廣泛采用。DNA芯片技術(shù)是近年來新開發(fā)的一種DNA序列變異檢測工具，但如果涉及的突變位點(diǎn)不多時，用高通量DNA芯片則因成本較高也不適且。才目比之下，變個生高效液才目色i普(Denaturing High Performance Liquid Chromatography, DHPLC)在突變檢測上具有較大的優(yōu)勢。DHPLC是一種在SSCP和DGGE基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的高通量篩選DNA序列變異的技術(shù)，其原理是通過HPLC在部分變性的條件下將發(fā)生錯配的異源雜合雙鏈DNA與完全匹配的同源雙鏈DNA分離開來。該技術(shù)可以自動檢測單堿基替代及小片段核苷酸的插入或缺失，還可分離分析大小相近而序列存在差異的DNA，是一種高性價比的檢測技術(shù)。與傳統(tǒng)的雜合雙鏈分析技術(shù)相比較，上樣前PCR 產(chǎn)物不需要酶切、純化，可直接進(jìn)行分析，同時過柱不需要灌膠、上樣、電泳等繁瑣的跑膠過程，該技術(shù)花時短，分析一個樣品一般僅需5分鐘，不需使用放射性同位素，自動化程度高， 大大降低了交叉污染的幾率、減少了工作量和成本。因此具有高通量、自動化、快速、檢出率高、重復(fù)性好、檢測DNA片段大小范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。運(yùn)用DHPLC技術(shù)的WAVE核苷酸片段分析系統(tǒng)可以快速、自動化地進(jìn)行分析。目前國內(nèi)外，DHPLC技術(shù)已在基因分型分析、腫瘤的突變檢測、地中海貧血的基因診斷等方面得到了廣泛的應(yīng)用。當(dāng)前DHPLC儀器和技術(shù)已經(jīng)在各地市級醫(yī)院非常普及，也是該試劑盒得以推廣的重要保證。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于通過研究與多種腫瘤發(fā)生相關(guān)的突變，從而提供一種多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)及其應(yīng)用和制備的試劑盒。可用于正常人群腫瘤遺傳易感性的篩查，起到風(fēng)險預(yù)警、早期診斷的作用。一種多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)，位于人TSC22D2基因的ATG上游_91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風(fēng)險基因型tc或CC?！N多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)應(yīng)用于制備檢測多癌風(fēng)險易感性試劑，所述的多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)位于人TSC22D2基因的ATG上游_91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風(fēng)險基因型tc或cc。所述的試劑包括DNA測序試劑、限制性酶切片段長度多態(tài)性試劑、單鏈構(gòu)象多態(tài)性試劑、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交試劑或變性高效液相色譜試劑。最適合為變性高效液相色譜試劑。所述試劑中含有針對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列L 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3‘。一種檢測多癌風(fēng)險易感性的突變篩查試劑盒，包括DNA抽提試劑，PCR試劑和 DHPLC檢測用試劑，在PCR試劑中包含針對人TSC22D2基因ATG上游_91bp，T > C突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的上下游引物，L :5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘ ；R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3‘； 在DHPLC檢測用試劑中，包括所述突變位點(diǎn)基因型為tt的陰性基因組DNA。發(fā)明人通過對湖南罕見多癌家系的研究證實(shí)TSC22D2基因(Homo sapiens TSC22 domain family,member 2，基因存取號NM_014779. 2，基因存取號來源為NCBI數(shù)據(jù)庫)調(diào)控區(qū)存在c. -91T > C突變位點(diǎn)在家系中與致病單體型共分離。TSC22D2基因?qū)儆赥SC22結(jié)構(gòu)域家族，其基因家族成員還有TSC22D1、TSC22D3、TSC22D4。目前對TSC22D1的研究提示，該基因家族可能參與TGF β信號通路，該通路與腫瘤的抑制密切相關(guān)。在多種腫瘤中TSC22D1 的mRNA表達(dá)下調(diào)，也表明其與惡性細(xì)胞增生有關(guān)。因此我們推測，TSC22D2作為基因家族成員之一，可能由于具有相同的結(jié)構(gòu)域而具有相同或類似的功能。通過對當(dāng)?shù)?00例正常人群進(jìn)行該位點(diǎn)的突變篩查，其結(jié)果均為陰性。上述遺傳學(xué)證據(jù)都提示，該基因及其突變可能與多種腫瘤的疾病發(fā)生相關(guān)，針對該位點(diǎn)進(jìn)行人群中的基因分型可以起到患癌風(fēng)險預(yù)測的作用?？紤]到人群中大量樣本為陰性，本發(fā)明的發(fā)明人在傳統(tǒng)DHPLC方法上進(jìn)行改進(jìn)， 不是將單純樣本PCR產(chǎn)物上DHPLC儀進(jìn)行檢測，而是采取將待測樣本PCR產(chǎn)物與陰性對照的樣本DNA等量混合，變性后上DHPLC檢測。這樣DNA雙鏈經(jīng)變性后打開，如果有突變的話， 緩慢復(fù)性后重新結(jié)合的雙鏈中就會出現(xiàn)異源鏈，從而在DHPLC圖中出現(xiàn)雙峰?；旌戏梢詼p少的DHPLC次數(shù)并提高一次DHPLC的判別效能?？梢灾挥靡淮蜠HPLC就區(qū)分風(fēng)險易感人群和正常人群。為適應(yīng)DHPLC方法快速檢測該突變，本發(fā)明提供一種用于檢測人類多癌風(fēng)險易感風(fēng)險性的診斷試劑盒。該試劑盒包括常規(guī)DNA抽提試劑，PCR試劑和DHPLC檢測用試劑。在 PCR試劑中包括常規(guī)PCR試劑，如高保真Taq酶、MgCl2+緩沖液、PCR專用去離子水等之外， 還包括待測突變位點(diǎn)c. -91Τ > C的上下游PCR引物，引物分別針對突變位點(diǎn)上游300bp和下游300bp各600bp范圍的片段而設(shè)計(jì)，產(chǎn)物大小在200 300bp之間。在DHPLC檢測用試劑中，除包含常規(guī)HPLC試劑外，還包括所述突變位點(diǎn)的陰性對照基因組DNA。
所述引物具體核苷酸序列如下LEFT PRIMER 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘RIGHT PRIMER 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3'本發(fā)明試劑盒的使用方法為(1)用枸櫞酸鈉抗凝管收集待測個體外周血樣本， 抽提基因組DNA (大于50ng/樣本)；( 用本發(fā)明試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物特異目的條帶；( 取PCR產(chǎn)物與陰性純合子DNA等量混合，用變性高效液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行檢測，區(qū)分多癌風(fēng)險易感陰性和陽性結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)為本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)位于人類染色體3q25. 1的TSC22D2基因ATG上游-91bp存在突變T > C(c. -91T > C)，該突變在多癌家系中與致病單體型共分離，并且在當(dāng)?shù)卮髽颖?500例)正常人群中驗(yàn)證為陰性。因此在此基礎(chǔ)上提出一種通過該突變呈現(xiàn)的不同基因型來制備檢測人類多癌易感風(fēng)險性的試劑，以及制備得到的試劑盒，并且經(jīng)臨床實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，本發(fā)明的檢測試劑盒具有良好靈敏性、穩(wěn)定性和特異性，提高了單次DHPLC 的判別效能，更加適合含有大量陰性樣本的篩查。用本發(fā)明的試劑盒對正常人群進(jìn)行腫瘤遺傳易感性的篩查，能有效起到風(fēng)險預(yù)警、早期診斷的作用。


圖1 本發(fā)明中研究的多癌家系圖譜；圖2 已收集到的多癌家系圖譜；圖3 用GeneHunter軟件對MS結(jié)果進(jìn)行單點(diǎn)、多點(diǎn)的參數(shù)和非參連鎖分析的LOD 值圖；圖4 瓊脂糖凝膠電泳得到特異目的條帶；圖5 本發(fā)明突變位點(diǎn)在家系中的測序結(jié)果圖；圖6 本發(fā)明突變位點(diǎn)在家系中與致病單體型共分離的單體型圖；圖7 本發(fā)明突變位點(diǎn)在正常人群大規(guī)模測序的部分測序結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1 前期研究發(fā)現(xiàn)3明4-26與多癌家系緊密連鎖前期研究中，發(fā)明人在湖南發(fā)現(xiàn)一個罕見多癌大家系，有六代超過103人。其中患者15人，存活有10人，涉及多種良惡性腫瘤，多癌家系圖譜參見圖1。為了定位與疾病連鎖的染色體區(qū)段，我們首先采用了高通量SNP芯片(Affymetrix公司Human Mapping 500K SNP Array)進(jìn)行全基因組掃描和分型，通過Merlin軟件進(jìn)行單點(diǎn)參數(shù)連鎖分析，在 3明4-3明6得到了 LOD值大于2的區(qū)域。后來進(jìn)一步針對該區(qū)域采用微衛(wèi)星進(jìn)行精細(xì)定位， 通過Genehunter軟件進(jìn)行多點(diǎn)非參連鎖分析時，最大LOD值達(dá)到了 10. 674(p = 0. 00195)， 定位于D3S1584 D3S3710之間，證實(shí)了該區(qū)段確實(shí)與疾病位點(diǎn)密切連鎖(參見圖2)。在進(jìn)一步用Cyrillic軟件進(jìn)行的單體型分析中，也發(fā)現(xiàn)有典型的單體型區(qū)間 (D3S1555-D3S3575)與疾病共分離。而后，發(fā)明人對該區(qū)段感興趣的Refseq gene展開了突變篩查工作，首先鎖定了一些可能與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切關(guān)聯(lián)的基因。針對這些基因的外顯子及內(nèi)外顯子交界、啟動子區(qū)進(jìn)行測序，最終在基因TSC22D2的ATG上游_91bp發(fā)現(xiàn)突變T> C(c. -91T > C)在家系中與致病單體型共分離，即家系中致病單體型攜帶者該位點(diǎn)的基因型均為tc雜合，系外正?；蚣蚁祪?nèi)致病單體型非攜帶者的基因型均為tt純合(參見圖 4、圖幻，隨后該位點(diǎn)在當(dāng)?shù)卮髽颖?500例)正常人群中驗(yàn)證為陰性(參見圖6)，從遺傳學(xué)上證實(shí)該位點(diǎn)為多癌家系的致病基因和致病突變，與多種腫瘤的發(fā)生存在關(guān)聯(lián)。提示該突變與腫瘤的風(fēng)險易感相關(guān)，可作為腫瘤風(fēng)險預(yù)測的分子靶標(biāo)。實(shí)施例2 腫瘤風(fēng)險易感突變篩查試劑盒的制備(一 )針對突變位點(diǎn)的引物設(shè)計(jì)1.模板序列的選取模板序列來自UCSC數(shù)據(jù)庫(http://Renome.ucsc. edu/)，針對突變位點(diǎn)上下游各 300bp選取，以保證PCR產(chǎn)物在合適的片段范圍便于檢測。2.引物設(shè)計(jì)PCR引物設(shè)計(jì)有3條基本原則首先引物要跟模板緊密結(jié)合，其次引物與引物之間不能有穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)存在，再次引物不能在別的非目的位點(diǎn)引起DNA聚合反應(yīng) (即錯配)。具體考慮因素包括引物長度(primer length)、產(chǎn)物長度(product length)、 序列 Tm 值(melting temperature) > AG 值(internal stability)、引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(duplex formation and hairpin)、錯誤弓丨發(fā)位點(diǎn)(false priming site)、弓丨物及產(chǎn)物 GC含量(composition)等。在考慮了以上因素后，采用在線軟件I^rimerf (http //frodo. wi.mit.edu/)設(shè)計(jì)引物，我們在諸多輸出引物結(jié)果中選擇了一對最合適的兩對引物。具體引物序列如下針對TSC22D2 (c. -91T > C)的引物序列LEFT PRIMER 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘RIGHT PRIMER 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3'3.引物特異性檢測為了驗(yàn)證引物的特異性，進(jìn)一步在UCSC Blat數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(http:// Renome. ucsc. edu/cRi-bin/hRBlat ？ command = start)。在輸出的結(jié)果中剛好只有引物所在染色體正反鏈位置上的兩條序列比對上，就說明該對引物的特異性很好，可以初步選為本發(fā)明突變篩查試劑盒的引物序列。發(fā)明人用PCR實(shí)驗(yàn)和跑膠進(jìn)一步確認(rèn)了所選擇引物的特異性，選擇的引物出現(xiàn)特異性目的帶(參見圖5)，其產(chǎn)物大小為347bp，退火溫度為53°C。本發(fā)明突變篩查試劑盒的制備通過前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，具校正功能的DNA聚合酶比 Taq聚合酶更適合于DHPLC突變分析。因此，我們選擇了 TaKaRa公司具有校正功能的高保真DNA聚合酶PrimeSTARTM HS DNA Polymerase作為突變篩查試劑盒的PCR酶。本發(fā)明突變篩查試劑盒的核心組分包括如下(I)DNA抽提試劑TaKaRa公司全血基因組抽提試劑盒(Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3. 0)O) PCR相關(guān)試劑今Markerl上下游引物干粉(各20D) 2支今Marker2上下游引物干粉(各20D) 2支今高保真DNA 聚合酶 PrimeSTAR HS DNAPolymerase 100 μ 1
今5XPrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus) :1ml X 2今dNTP Mixture (各 2. 5mM) :800 μ 1今突變位點(diǎn)的陰性對照(純合子tt)Blood gDNA(50ng/y 1) :100μ 1X2今MiniQ 超純水5ml(3) DHPLC所需的常規(guī)試劑今Buffer A :0. ITEAA 溶液；今Buffer B :0. ITEAA 溶液；今Buffer C :Wash Solution ；今 Buffer D Storage Solution (75% acetonitrile)；今DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)IOObp DNA ladder (100 至 600bp 的 Marker)，參照片段 (bp)600500 400 300 200 100主要溶液今紅細(xì)胞裂解液；今白細(xì)胞裂解液今TE (IOmM Tris+lmM EDTA)今飽和NaCl 5M今6M凝膠加樣緩沖液今5M電泳緩沖液(TBE)引物人工合成。通過測序方法篩查突變位點(diǎn)為陰性的純合子(tt)個體，并采用全血基因組抽提試劑盒提取其外周血gDNA，跑膠呈均一條帶，測吸光度OD值在1. 8左右為質(zhì)量合格，將其作為陰性對照DNA。另外根據(jù)引物的Tm值，在Tm上下五度范圍，采用梯度PCR摸索得到引物的最佳退火溫度，推薦退火溫度為53°C。實(shí)施例3 本發(fā)明突變篩查試劑盒的使用步驟
步驟1血液樣本的采集和gDNA的抽提血液樣本的采集與處理使用德國格雷那公司VACUETTE (非可替)5ml EDTA 抗凝管，采集待測個體外周血樣本5ml，4°C保存，兩周內(nèi)抽提gDNA。如果不立即抽提gDNA， 可以將抗凝管放至冰箱-20。C保存，待收集了多個樣本后一起抽提。gDNA抽提使用TaKafci公司全血基因組抽提試劑盒(Universal Genomic DNAExtraction Kit Ver. 3. 0)提取Blood gDNA(步驟詳見產(chǎn)品說明書)。取2 μ 1 DNA樣本跑膠，同時取2μ 1 gDNA樣本稀釋到100μ 1，測吸光度值，按照公式DNA濃度=吸光度值X 稀釋倍數(shù)X40(單位為ng/μ 或yg/ml)計(jì)算抽提的DNA濃度，取250ng稀釋為50ng/ μ 1(共50 μ 1)待用，余下樣本_80°C保存。步驟2PCR擴(kuò)增(1)引物稀釋將突變篩查試劑盒中的裝有干粉引物的離心管取出，常溫點(diǎn)離，按照說明配制5X弓丨物原液(50μΜ)，再按照1 5稀釋一部分為IX引物工作液(10 μ Μ)， 待用。引物原液于_20°C保存，引物工作液于4°C保存。O) PCR 體系按下列組分配制PCR反應(yīng)液
權(quán)利要求
1.一種多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)，其特征在于所述的突變位點(diǎn)位于人TSC22D2基因的ATG上游-91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風(fēng)險基因型tc或cc。
2.一種多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)的應(yīng)用方法，其特征在于應(yīng)用于制備檢測多癌風(fēng)險易感性試劑，所述的多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)位于人TSC22D2基因的ATG上游_91bp，T > C，其基因型包括陰性基因型tt和多癌易感風(fēng)險基因型tc或cc。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的試劑包括DNA測序試劑、限制性酶切片段長度多態(tài)性試劑、單鏈構(gòu)象多態(tài)性試劑、等位基因特異的寡聚核苷酸雜交試劑或變性高效液相色譜試劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述的試劑為變性高效液相色譜試劑。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用方法，其特征在于所述試劑中含有針對突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物序列L 5' -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3‘R 5' -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3‘。
6.一種檢測多癌風(fēng)險易感性的突變篩查試劑盒，包括DNA抽提試劑，PCR試劑和DHPLC檢測用試劑，其特征在于在PCR試劑中包含針對人TSC22D2基因ATG上游-9 Ibp，T > C 突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)的上下游引物，L 5 ‘ -AGAGCCGAAGAGACCGACA-3 ‘ ；R 5 ‘ -ACGTCCTCTGTGCGTGACT-3 ‘；在DHPLC檢測用試劑中，包括所述突變位點(diǎn)基因型為tt的陰性基因組DNA。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種多癌風(fēng)險易感性突變位點(diǎn)及其應(yīng)用和制備的試劑盒。本發(fā)明通過研究證實(shí)，多癌家系染色體3q24-26區(qū)域與疾病位點(diǎn)緊密連鎖，基因突變篩查進(jìn)一步證實(shí)人TSC22D2基因的ATG上游-91bp T＞C突變(c.-91T＞C)在多癌家系中與致病單體型共分離，通過在當(dāng)?shù)卣Ｈ巳捍笠?guī)模測序驗(yàn)證，該突變?yōu)殛幮?。從而提出針對該突變位點(diǎn)的基因型可用于腫瘤遺傳易感人群的篩查，用于腫瘤患病風(fēng)險預(yù)測。并研制了相關(guān)的突變篩查試劑盒。該試劑盒具有靈敏度高、特異性好、高通量等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的測序方法相比，無需PCR產(chǎn)物的純化，減少了交差污染等人為因素的干擾，同時節(jié)省了大量的人力、財力和物力。
文檔編號C12Q1/68GK102311952SQ20111027777
公開日2012年1月11日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者曾朝陽, 李桂源, 熊煒, 肖嵐, 譚世明 申請人:中南大學(xué)