專利名稱：一株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌及其應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
二十一世紀(jì)，人們對食品安全和生態(tài)環(huán)境要求越來越高，處于養(yǎng)殖業(yè)前沿的飼料行業(yè)普遍引起人們的關(guān)注。全國飼料工業(yè)辦公室頒布的《1996-2020年中國飼料工業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略研究》中已明確提出“用綠色環(huán)保產(chǎn)品替代飼用抗生素等化學(xué)合成物質(zhì)濫用非常迫切”，替代這些污染物質(zhì)最優(yōu)方法就是利用生物技術(shù)。微生態(tài)制劑是生物技術(shù)化的現(xiàn)代高技術(shù)產(chǎn)品，是將益生菌、酶制劑、低聚糖、生物肽有機(jī)結(jié)合的功能性生物飼料添加劑。這幾個(gè)領(lǐng)域是當(dāng)前安全飼料添加劑的研究熱點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)由單一產(chǎn)品目前尚無法完全替代飼用抗生素的使用效果。另外，微生態(tài)制劑具有安全、高效的特點(diǎn)，在畜禽飼料中使用，不僅解決了動物性食品的抗生素殘留、濫用狀況帶來的安全問題，而且大大降低了養(yǎng)殖業(yè)傳染性疾病以及對環(huán)境造成的污染(養(yǎng)殖污染目前已經(jīng)成為我國第一大污染源)。微生態(tài)制劑具有安全、無污染、無殘留、預(yù)防疾病等特點(diǎn)，能夠顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率和動物的生產(chǎn)性能，是替代飼用抗生素等化學(xué)合成物質(zhì)首選的綠色飼料添加劑。微生態(tài)制劑不僅是一個(gè)產(chǎn)品，更是一項(xiàng)綜合技術(shù)，是在畜牧業(yè)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)可持續(xù)發(fā)展、節(jié)約型畜牧業(yè)、解決三農(nóng)問題的關(guān)鍵。微生態(tài)制劑的大量使用可使中國畜牧飼料業(yè)由傳統(tǒng)的粗放型向現(xiàn)代意義上的“質(zhì)量、效益、生態(tài)和可持續(xù)發(fā)展”型轉(zhuǎn)變，將大大提高我國動物性產(chǎn)品的世界市場競爭力。飼用酶制劑的研究與開發(fā)已受到飼料業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)的高度重視，目前已研制出的酶制劑有纖維素酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、植酸梅、木聚糖酶、葡聚糖酶等多種，但由于此類酶制劑的耐高溫性、耐酸性等耐受性較差、貯存時(shí)間較短等缺點(diǎn)，影響了產(chǎn)品的酶活，從而影響了該類產(chǎn)品的飼喂效果，大大限制了飼用酶制劑的推廣應(yīng)用，急需開發(fā)一種新型的動物微生態(tài)制劑。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供了一株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌，本發(fā)明的菌株是從動物腸道內(nèi)容物、畜禽糞便、土壤等材料中，通過誘變、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，篩選出的高酶活特性的益生素菌株，對菌株進(jìn)行安全試驗(yàn)、發(fā)酵條件的研究，并進(jìn)行復(fù)方配伍， 經(jīng)動物試驗(yàn)驗(yàn)證等，本發(fā)明研制出了一種新的微生態(tài)制劑_產(chǎn)酶益生素。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的—株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌，該菌株命名為枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtilis)N9-l-35,已于2011年08月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心， 其保藏編號為CCTCC M2011301。所述枯草芽孢桿菌N9-1-35的特性如下菌落呈圓形或不規(guī)則性，邊緣不整齊，表面有皺褶、粗糙，污白色或微帶黃色，有隆起；該菌種細(xì)胞大小為0.3μπι 0. 5 μ mX 1. 4 μ m 3. 0 μ m，呈桿狀，革蘭氏陽性；芽孢橢圓形，大小為0. 6 μ m 0. 9 μ mX 1. 0 μ m 1. 5 μ m，孢囊不膨大，有運(yùn)動性；能利用葡萄糖、木糖及阿拉伯糖等，能水解淀粉，還原硝酸鹽；在含7%氯化鈉的培養(yǎng)基上能夠生長，在50°C下培養(yǎng)能夠生長，V-P 反應(yīng)呈陽性，在厭氧條件下不生長。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌N9-1-35最適的培養(yǎng)基為0. 5 %葡萄糖，1. 0 %蛋白胨、 0. 5%牛肉膏、0. 5%氯化鈉，調(diào)pH至7. 2，115°C條件下滅菌20min (所述百分?jǐn)?shù)為質(zhì)量百分?jǐn)?shù))。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌N9-1-35是從常規(guī)枯草芽孢桿菌中通過航天育種技術(shù)篩選出來的，經(jīng)試驗(yàn)測試表明，其是非常優(yōu)秀的益生素菌種。進(jìn)入動物腸道后，除了發(fā)揮其益生素的功能外，在其生長繁殖過程中還能夠產(chǎn)生淀粉酶、中性蛋白酶、纖維素酶等多種消化酶，從而提高動物對飼料的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本，可以用于產(chǎn)酶益生素的生產(chǎn)，是一株極具研究開發(fā)價(jià)值的菌株。所述生產(chǎn)制備酶益生素的方法為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N9_l_35經(jīng)發(fā)酵處理，得到發(fā)酵液，然后加入玉米淀粉通過噴霧干燥制成枯草芽孢桿菌菌粉，再復(fù)配乳酸鏈球菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉及玉米淀粉，即得產(chǎn)酶益生素。所述制備枯草芽孢桿菌菌粉的具體步驟如下⑴菌種選用枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N9-1-35 ；(ii)斜面培養(yǎng)將菌種一環(huán)接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)18 24h ；(iii) 一級種子培養(yǎng)取上述培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下用接種環(huán)取一環(huán)接種于50mL IOOmL種子液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下，靜置培養(yǎng)12 16h，制得一級種子液；(iv)擴(kuò)大培養(yǎng)以2% (ν/ν)的接種量，將一級種子液接于500mL IOOOmL種子液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下，靜置培養(yǎng)8 14h，制得二級種子液；(ν)發(fā)酵罐培養(yǎng)以2% (ν/ν)的接種量，將二級種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于 37°C條件下，通氣培養(yǎng)22 28h ；(vi)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(ν)芽孢率達(dá)到90%以上時(shí)，收集發(fā)酵液；(vii)向發(fā)酵液中加入4 8% (質(zhì)量百分?jǐn)?shù))玉米淀粉，立即噴霧干燥，制得菌粉。所述步驟(iii)、(iv)中的種子液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，使用時(shí)，調(diào)節(jié)pH至7. 0 7. 5，115°C條件下滅菌20min ；所述步驟 ( )中的固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加1. 5 2. 0%的瓊脂粉；所述步驟 (ν)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉60g/L，豆粕30g/L，磷酸氫二鈉6g/L，硫酸銨3g/ L，氯化鈣 2g/L，pH 7.0 7. 5。通過上述方法制備得到的產(chǎn)酶益生素，是由枯草芽孢桿菌菌粉、乳酸鏈球菌 (Streptococcus lactis)菌粉、嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)菌粉及玉米淀粉組成，優(yōu)選的配方為枯草芽孢桿菌菌粉、乳酸鏈球菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉及玉米淀粉的質(zhì)量比為6 2 1 21，枯草芽孢桿菌、乳酸鏈球菌和嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)分別大于或者等于 3 X 108cfu/g、1 X 108cfu/g 和 5 X 107cfu/g。


本發(fā)明提供的菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N9-l-35，已于2011 年08月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M 2011301，保藏地址為中國湖北省武漢市武漢大學(xué)，郵編430072。圖1為枯草芽孢桿菌N9-1-35與枯草芽孢桿菌N酶活比較示意圖。圖2-1為枯草芽孢桿菌N9-1-35斜面10代與1代酶活比較示意圖，其中A為中性蛋白酶，B為淀粉酶，C為纖維素酶，單位U/mL。圖2-2為枯草芽孢桿菌N9-1-35斜面10代與1代活菌數(shù)比較示意圖，IgX為活菌數(shù)的對數(shù)值。圖3為枯草芽孢桿菌N9-1-35的產(chǎn)酶曲線。圖4為實(shí)施例4中的生產(chǎn)工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。實(shí)施例一、菌種的篩選1、材料與方法11樣品土壤、枯草、動物腸道內(nèi)容物、牛、羊、鵝等動物的糞便、牛瘤胃內(nèi)容物。1. 2篩選培養(yǎng)基產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選培養(yǎng)基玉米淀粉1. 0%、牛肉膏0. 3%、蛋白胨0. 5%、瓊脂粉 2. 0%, pH7. 2 7. 4，121°C，滅菌 30min。產(chǎn)中性蛋白酶菌株的篩選培養(yǎng)基大豆蛋白粉1. 0%、牛肉膏0. 5%、磷酸氫二鉀 0. 05%、硫酸鎂 0. 05%,氯化鈣 0. 05%,吐溫-800. 1 %、瓊脂粉 2.0%，ρΗ7· 2 7. 4，121 °C， 滅菌30min。產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選培養(yǎng)基羧甲基纖維素1%、蛋白胨0.5%、磷酸氫二鉀 0. 05 %、硫酸鎂 0. 02%,氯化鈣 0.01%,氯化鐵 0. 02%,瓊脂粉 2.0%, ρΗ7· 2 7. 4，121 °C， 滅菌30min。產(chǎn)植酸酶菌株的篩選培養(yǎng)基植酸鈣2.0%、蛋白胨0.5%、磷酸氫二鉀0. 1%、硫酸鎂0. 05%、氯化鉀0. 05%、氯化鈣0. 002%、硫酸亞鐵0. 001%、硫酸錳0. 001%、瓊脂粉 2. 0%, pH7. 2 7. 4，121°C，滅菌 30min。1. 3樣品初篩樣品放入燒杯中，加入10倍量的滅菌生理鹽水，90°C處理lOmin，然后做10—1、10_2、10_3、10_4、10_5稀釋，每個(gè)稀釋度涂步平板3個(gè)，37°C培養(yǎng)24 72h，進(jìn)行各種產(chǎn)酶菌株的篩選。觀察透明圈的大小，計(jì)算透明圈與菌落直徑比，挑取透明圈與菌落直徑比較大的菌落，做純培養(yǎng)，保存于冰箱中備用。1. 4菌種復(fù)篩250mL三角瓶裝液量50mL，轉(zhuǎn)速180rpm，溫度34°C，培養(yǎng)24h，測酶
活。搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基牛胨培養(yǎng)基。淀粉酶的測定按照《食品酶學(xué)原理與分析方法》中細(xì)菌α -淀粉酶活力的測定，中性蛋白酶的測定采用福林-酚法，纖維素酶的測定采用羧甲基纖維素鈉(CMC)糖化力法，植酸酶的測定采用釩鉬磷法。1. 5儀器UV-2000紫外分光光度計(jì)；恒溫水浴鍋；培養(yǎng)箱；光學(xué)顯微鏡；秒表。
2、結(jié)果2. 1初篩結(jié)果見表1，從30個(gè)樣品中，共分離了 123個(gè)菌株，通過透明圈與直徑比的篩選，共篩選了 8株較理想的菌株。表1初篩結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌，其特征在于該菌株命名為枯草芽孢桿菌N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為=CCTCC M 2011301。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌，其特征在于所述枯草芽孢桿菌N9-1-35的菌落呈圓形或不規(guī)則性，邊緣不整齊，表面有皺褶、粗糙，污 白色或微帶黃色，有隆起；該菌種細(xì)胞大小為0. 3 μ m 0. 5 μ mX 1. 4 μ m 3. 0 μ m，呈桿狀， 革蘭氏陽性；芽孢橢圓形，大小為0. 6 μ m 0. 9 μ mX 1. 0 μ m 1. 5 μ m，孢囊不膨大，有運(yùn)動性；能利用葡萄糖、木糖及阿拉伯糖等，能水解淀粉，還原硝酸鹽；在含7%氯化鈉的培養(yǎng)基上能夠生長，在50°C下培養(yǎng)能夠生長，V-P反應(yīng)呈陽性，在厭氧條件下不生長。
3.權(quán)利要求1所述的一株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌在生產(chǎn)制備產(chǎn)酶益生素中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于制備產(chǎn)酶益生素的方法為枯草芽孢桿菌 N9-1-35經(jīng)發(fā)酵處理，得到發(fā)酵液，然后加入玉米淀粉通過噴霧干燥制成枯草芽孢桿菌菌粉，再復(fù)配乳酸鏈球菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉及玉米淀粉，即得產(chǎn)酶益生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述制備枯草芽孢桿菌菌粉的具體步驟如下⑴菌種選用枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis N9-1-35 ；( )斜面培養(yǎng)將菌種一環(huán)接種于固體斜面培養(yǎng)基上，在37°C下培養(yǎng)18 24h ；(iii)一級種子培養(yǎng)取上述培養(yǎng)好的斜面，在無菌條件下用接種環(huán)取一環(huán)接種于 50mL IOOmL種子液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下，靜置培養(yǎng)12 16h，制得一級種子液；(iv)擴(kuò)大培養(yǎng)以2%的接種量，將一級種子液接于500mL IOOOmL種子液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下，靜置培養(yǎng)8 14h，制得二級種子液；(ν)發(fā)酵罐培養(yǎng)以2%的接種量，將二級種子液接于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37°C條件下，通氣培養(yǎng)22 28h;(vi)收集發(fā)酵產(chǎn)物待步驟(ν)芽孢率達(dá)到90%以上時(shí)，收集發(fā)酵液；(vii)向發(fā)酵液中加入4 8%玉米淀粉，立即噴霧干燥，制得菌粉。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(iii)、(iv)中的種子液體培養(yǎng)基配方為葡萄糖5g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，氯化鈉5g/L，使用時(shí)，調(diào)節(jié)pH至7. 0 7.5，1151條件下滅菌201^11;所述步驟(ii)中的固體斜面培養(yǎng)基為上述種子液體培養(yǎng)基中添加1. 5 2. 0%的瓊脂粉；所述步驟(ν)中的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為玉米粉60g/L，豆粕30g/L，磷酸氫二鈉6g/L，硫酸銨3g/L，氯化鈣2g/L，pH 7. 0 7. 5。
7.—種產(chǎn)酶益生素，其特征在于由枯草芽孢桿菌菌粉、乳酸鏈球菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉及玉米淀粉組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的產(chǎn)酶益生素，其特征在于所述枯草芽孢桿菌菌粉、乳酸鏈球菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉及玉米淀粉的質(zhì)量比為6 2 1 21，枯草芽孢桿菌、乳酸鏈球菌和嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)分別大于或者等于3X108CfU/g、lX108CfU/g和5X107cfu/g。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株經(jīng)航天育種技術(shù)選育的枯草芽孢桿菌，該菌株命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)N9-1-35，已于2011年08月31日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏編號為CCTCC M2011301。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌經(jīng)試驗(yàn)測試表明，是非常優(yōu)秀的益生素菌種。進(jìn)入動物腸道后，除了發(fā)揮其益生素的功能外，在其生長繁殖過程中還能夠產(chǎn)生多種消化酶，從而提高動物對飼料的消化吸收，提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低飼料成本，可以用于產(chǎn)酶益生素的生產(chǎn)，是一株極具研究開發(fā)價(jià)值的菌株。本發(fā)明還公開了一種產(chǎn)酶益生素，其是由枯草芽孢桿菌菌粉、乳酸鏈球菌菌粉、嗜酸乳桿菌菌粉及玉米淀粉組成的。
文檔編號C12N1/20GK102329749SQ20111027806
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者單寶龍, 徐海燕, 翟延慶, 谷巍 申請人:山東寶來利來生物工程股份有限公司