專利名稱：一種人乳頭瘤病毒熒光核酸擴增檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用寡核苷酸探針的溶解曲線，和特定的熒光標(biāo)記實現(xiàn)HPV亞型的分型檢測方法，特別涉及一種人乳頭瘤病毒熒光核酸擴增檢測方法。
背景技術(shù)：
宮頸癌是婦女高發(fā)的惡性腫瘤之一。幾乎所有的宮頸癌標(biāo)本中可檢出HPV DNA, HPV陰性者幾乎無罹子宮頸癌之憂，因此，HPV被確認為子宮頸癌發(fā)生的必要條件。人乳頭狀瘤病毒(HPV)型別有80多種，按其感染部位分為皮膚型和生殖道型HPV。大約有35種型別與生殖道感染有關(guān)，約20種與腫瘤相關(guān)。依據(jù)與癌發(fā)生關(guān)系,分為低危型HPV(如6、11、42,43和44型等可引起外生殖器濕疣、宮頸上皮內(nèi)低度病變等)和高危型HPV(如HPV16、 18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68型與子宮頸癌及宮頸上皮內(nèi)高度病變的發(fā)生相關(guān))。而HPV16和18型感染率最高，即HPV16占所有型別的50%，其病理類型主要為子宮頸癌鱗狀上皮細胞癌；HPV18占14%，在子宮頸腺上皮細胞癌占主要地位；HPV45占8% ; HPV31占5% ;其他型別占23%。所以針對HPV分型的檢測對于宮頸癌的預(yù)防十分有必要。 由于目前尚無有效的技術(shù)手段能夠在體外培養(yǎng)HPV，所以目前為止沒有有效的HPV血清學(xué)分型方法。傳 統(tǒng)的診斷方法主要是形態(tài)學(xué)檢查方法，包括巴氏涂片、液基薄層細胞檢查、陰道鏡等；免疫學(xué)檢查，主要是酶聯(lián)免疫反應(yīng)。這些傳統(tǒng)的技術(shù)手段，存在較高假陽性和假陰性率，由于這些不足，分子生物學(xué)技術(shù)被引入HPV的臨床檢測，它們包括，原位雜交、雜交捕獲、PCR、PCR反向點雜交等技術(shù)，其中雜交捕獲是目前美國FDA唯一批準(zhǔn)可用于臨床檢測的試劑盒，但這些方法有個共同的缺點就是操作復(fù)雜，耗時長大大制約了臨床的應(yīng)用。
熒光定量PCR檢測技術(shù)是1990年誕生的技術(shù)，從一開始就受到廣泛的關(guān)注和應(yīng)用，以熒光定量PCR儀為平臺，給種革新的技術(shù)層出不窮，主要包括，sybrgreen染料法、 Taqman探針法、分子信標(biāo)、FRET等技術(shù)，他們各有優(yōu)缺點，和各自不同的應(yīng)用領(lǐng)域。隨著熒光定量PCR技術(shù)越來越普及，熒光定量PCR儀成為了醫(yī)院檢驗科室不可缺少的儀器。發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種人乳頭瘤病毒熒光核酸擴增檢測方法，實現(xiàn)對13中HPV亞型檢測的目的。
本發(fā)明是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的
一種人乳頭瘤病毒熒光核酸擴增檢測方法，是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的
第一步用宮頸刷采集宮頸脫落細胞，將采集完畢的宮頸刷浸泡于3_5ml宮頸細胞保存液中；
第二步將宮頸刷在細胞保存液中充分洗滌，后丟棄，然后將細胞保存液與 lOOOOg，左右離心，去除上清，加500ul細胞裂解液(IOmMTris-Hcl PH9. 0、50mM KCL)，震蕩混勻，100°C孵育5分鐘后，自然冷卻至室溫后，lOOOOg，離心3分鐘，每個25ul的熒光PCR 反應(yīng)取l_5ul上清。
所述保存液是生理鹽水，或者是PH7. 4的磷酸鹽緩沖液。
本發(fā)明的有益效果為檢測效果準(zhǔn)確。
圖1是HPV16檢測結(jié)果圖
圖2是HPV18檢測結(jié)果圖
圖3是HPV31檢測結(jié)果圖
圖4是HPV33檢測結(jié)果圖
圖5是HPV35檢測結(jié)果圖
圖6是HPV39檢測結(jié)果圖
圖7是HPV45檢測結(jié)果圖
圖8是HPV51檢測結(jié)果圖
圖9是HPV52檢測結(jié)果圖
圖10是HPV56檢測結(jié)果圖
圖11是HPV58檢測結(jié)果圖
圖12是HPV59檢測結(jié)果圖
圖13是HPV68檢測結(jié)果圖具體實施方式
以下結(jié)合附圖，對本發(fā)明做進一步說明。
第一步用宮頸刷采集宮頸脫落細胞，將采集完畢的宮頸刷浸泡于3_5ml宮頸細胞保存液中；
第二步將宮頸刷在細胞保存液中充分洗滌，后丟棄，然后將細胞保存液與 lOOOOg，左右離心，去除上清，加500ul細胞裂解液(IOmMTris-Hcl PH9. 0、50mM KCL)，震蕩混勻，100°C孵育5分鐘后，自然冷卻至室溫后，IOOOOg,離心3分鐘，每個25ul的熒光PCR 反應(yīng)取l_5ul上清。所述保存液是生理鹽水，或者是PH7. 4的磷酸鹽緩沖液。
第三步熒光PCR反應(yīng)體系參見下表I。
表I
權(quán)利要求
1.一種人乳頭瘤病毒熒光核酸擴增檢測方法，其特征在于是通過以下的技術(shù)方案實現(xiàn)的第一步用宮頸刷采集宮頸脫落細胞，將采集完畢的宮頸刷浸泡于3-5ml宮頸細胞保存液中；第二步將宮頸刷在細胞保存液中充分洗滌，后丟棄，然后將細胞保存液與10000g，左右離心，去除上清，加500ul細胞裂解液(IOmMTris-Hcl PH9. 0、50mM KCL)，震蕩混勻，100°C 孵育5分鐘后，自然冷卻至室溫后，IOOOOg,離心3分鐘，每個25ul的熒光PCR反應(yīng)取l_5ul上清。
2.如權(quán)利要求1所述的一種人乳頭瘤病毒熒光核酸擴增檢測方法，其特征在于所述保存液是生理鹽水，或者是PH7. 4的磷酸鹽緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人乳頭瘤病毒熒光核酸擴增檢測方法，首先用宮頸刷采集宮頸脫落細胞，將采集完畢的宮頸刷浸泡于3-5ml宮頸細胞保存液中，保存液可以使生理鹽水，也可以是pH7.4的磷酸鹽緩沖液；然后將宮頸刷在細胞保存液中充分洗滌，后丟棄，然后將細胞保存液與10000g，左右離心10分鐘。去除上清，加500ul細胞裂解液(10mM Tris-Hcl pH9.0、50mM Kcl)，震蕩混勻，100℃孵育5分鐘后，自然冷卻至室溫后，10000g，離心3分鐘，每個25ul的熒光PCR反應(yīng)取1-5ul上清。
文檔編號C12R1/93GK102994646SQ20111027823
公開日2013年3月27日 申請日期2011年9月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月19日
發(fā)明者潘振華, 孫朝輝 申請人:潘振華