專利名稱：Itr同向排列的aav載體構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法
ITR同向排列的AAV載體構(gòu)建及其應(yīng)用本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種ITR同向排列的AAV載體PSDAV2，該表達(dá)載體主要由兩個(gè)同向排列的AAV2的ITR、篩選基因表達(dá)框和外源基因表達(dá)框組成，其中外源基因表達(dá)框中含有多克隆位點(diǎn)MCS，用于表達(dá)外源基因的插入。將報(bào)告基因插入PSDAV2載體，篩選獲得細(xì)胞株，利用“一個(gè)細(xì)胞株/ 一株輔助病毒”策略包裝重組AAV病毒，發(fā)現(xiàn)ITR同向排列不僅能夠明顯提高包裝獲得重組AAV病毒中雙鏈AAV病毒的比例，還能增強(qiáng)包裝攜帶基因的體內(nèi)外表達(dá)效率?？傊?，本發(fā)明提出并構(gòu)建了一種ITR同向排列的AAV載體，為重組AAV病毒的包裝特別是重組雙鏈AAV病毒的包裝提供了新的選擇。背景腺相關(guān)病毒(Adeno-associatedvirus, AAV)屬于微小病毒科(Parvovirus),其基因組為一條單鏈DNA分子。AAV是依賴性病毒,需要其它病毒如腺病毒或單純皰疫病毒，或輔助因素提供輔助功能才能復(fù)制。在沒(méi)有輔助病毒存在時(shí)，AAV感染細(xì)胞后其基因組將 整合到細(xì)胞染色體中成為潛伏狀態(tài),而不產(chǎn)生子代病毒。目前已發(fā)現(xiàn)多種AAV病毒，從基因組組成和血清學(xué)上可以分為不同的亞型(WuZJ, Asokan A, Samulski RJ. Adenoassociated virus serotypes vector toolkit forhuman gene therapy. Mol Ther, 2006,14 (3) :316-327.)。雖然不同的基因組亞型之間，核苷酸序列存在一定的差異，但不同亞型之間的基因組大小和結(jié)構(gòu)是相似的。以AAV2為例，其基因組大小為4675nt,分為反向末端重復(fù)序列(Inverted terminal repeat, ITR)區(qū)、rep基因區(qū)和cap基因區(qū)。ITR區(qū)為基因組5’和3’末端兩個(gè)長(zhǎng)度為145nt的反向末端重復(fù)序列，包含AAV2基因組的復(fù)制起點(diǎn)，與AAV2復(fù)制、整合或包裝等功能相關(guān)，為AAV2病毒基因組中的順式作用元件。rep基因區(qū)和cap基因區(qū)為兩個(gè)功能基因區(qū)，編碼AAV2生活周期中需要的各種調(diào)節(jié)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，為AAV2產(chǎn)毒性復(fù)制提供各種反式作用因子。rep基因區(qū)編碼AAV復(fù)制和病毒基因表達(dá)等所必需的調(diào)節(jié)蛋白，根據(jù)分子量大小的不同可分為R印78、R印68、R印52、R印40等4種形式。cap基因區(qū)編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白，VP1、VP2、VP3，共同組裝成AAV病毒的外殼。AAV是基因治療的理想載體之一。大量的高質(zhì)量的重組AAV(Recombinant AAV,rAAV)病毒的制備是AAV載體用于基因治療的前提和基礎(chǔ)。rAAV病毒制備的過(guò)程中主要解決的3個(gè)問(wèn)題是，AAV載體質(zhì)粒的設(shè)計(jì)和構(gòu)建，各種反式作用因子(即RP和cap基因編碼的各種蛋白)的反式提供和輔助病毒的選擇和提供。針對(duì)這3個(gè)問(wèn)題，不同的研究者提出了不同的解決方案，形成了多種rAAV病毒的制備系統(tǒng)。目前國(guó)際上普遍采用的是Xiao (XiaoX,Li J,Samulski RJ. Production of high—titer recombinant adeno-associated virusvectors in the absence of helper adenovirus. J Virol, 1998, 72 (3) :2224-2232.)等提出的三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染系統(tǒng)。這三個(gè)質(zhì)粒分別為AAV載體質(zhì)粒,rep-cap表達(dá)質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒。三個(gè)質(zhì)粒分別解決rAAV病毒制備過(guò)程中的3個(gè)問(wèn)題。AAV載體質(zhì)粒包含AAV2的兩個(gè)ITR序列，且在兩個(gè)ITR之間插入外源啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和polyA加尾信號(hào)序列，用于外源表達(dá)基因的克隆。rep-cap表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)編碼和表達(dá)MV病毒產(chǎn)毒性復(fù)制的各種調(diào)節(jié)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，反式提供rAAV病毒包裝過(guò)程中所需的各種因子。輔助質(zhì)粒攜帶了 5型腺病毒的E2A、E40RF6和VA RNA基因，可替代腺病毒，為rAAV病毒的產(chǎn)毒性復(fù)制提供輔助功能。在國(guó)內(nèi)rAAV病毒制備應(yīng)用較為廣泛的方法為兩個(gè)中國(guó)專利(專利號(hào)98120033.8,99119038. 6)組合報(bào)道的“一種病毒感染一個(gè)載體細(xì)胞株”法系統(tǒng)。專利(專利號(hào)98120033. 8)報(bào)道了一種攜帶rep-cap基因表達(dá)框的I型單純皰疫病毒(Herpes simplex virus type 1,HSV1),這株病毒不僅具有輔助病毒的功能，還可以反式提供各種rAAV病毒產(chǎn)毒性復(fù)制所需的各種反式作用因子。專利(專利號(hào)99119038.6)則報(bào)道了一系列通用型腺相關(guān)病毒載體，應(yīng)用這些載體可以構(gòu)建穩(wěn)定攜帶AAV載體的細(xì)胞株，將專利(專利號(hào)98120033.8)中的輔助病毒感染AAV載體細(xì)胞株，制備獲得大量的rAAV病毒。這些rAAV病毒制備系統(tǒng)的提出促進(jìn)了 AAV載體在基因治療等領(lǐng)域中的應(yīng)用。但由于AAV病毒本身基因組為單鏈DNA分子，因此AAV病毒進(jìn)入細(xì)胞后，需要先合成其互補(bǔ)鏈才能開始攜帶的外源基因的表達(dá)，導(dǎo)致外源基因表達(dá)的延后和效率降低，限制了 rAAV載體的進(jìn)一步應(yīng)用。scrAAV(Self comp I ementary rAAV)載體制備系統(tǒng)的提出解決了這一問(wèn)題。通過(guò)缺失AAV載體中一個(gè)ITR的TRS (Terminal resolution site)序列，導(dǎo)致Rep蛋白不能對(duì)缺失TRS的ITR進(jìn)行切割，因此包裝獲得rAAV病毒攜帶兩個(gè)正常的ITR、缺失d序列的ITR和完全互補(bǔ)的外源基因表達(dá)框的兩條單鏈(在rAAV 5000nt包裝容量允許的范圍內(nèi))， 獲得自身基因組可互補(bǔ)的rAAV(scrAAV)載體。scrAAV載體進(jìn)入細(xì)胞后其基因組可以自身互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈，不依賴于細(xì)胞合成其互補(bǔ)鏈，提高攜帶外源基因的表達(dá)速度和效率。雖然由于rAAV包裝容量(不大于5000nt)的限制，scrAAV可攜帶的外源基因的表達(dá)框的大小不能大于2500bp,限制了 scrAAV載體對(duì)某些較大外源基因表達(dá)框的攜帶,但是scrAAV可以顯著地提高外源基因的表達(dá)效率，降低其在基因治療中的用量，因此scrAAV載體在基因治療中，特別是以較小基因(如hFIX、siRNA、miRNA和核酶等)為導(dǎo)入基因的基因治療中仍具有廣泛的應(yīng)用前景。而且，近年來(lái)一些較小高效的順式作用元件(如啟動(dòng)子、加尾信號(hào)等)的出現(xiàn)，有效地降低了其在外源基因表達(dá)框中的所占容量，擴(kuò)大了 scrAAV載體可攜帶外源基因的長(zhǎng)度。由于R印蛋白不能完全識(shí)別并切割I(lǐng)TR中的TRS序列，因此當(dāng)rAAV載體攜帶的外源基因表達(dá)框小于2500bp時(shí)，包裝獲得的rAAV載體也存在一定比例的scrAAV，但比例小于50%。為了提高包裝獲得rAAV載體中scrAAV的比例，常采用的策略是降低包裝系統(tǒng)中的Rep蛋白表達(dá)量和對(duì)ITR中的TRS序列進(jìn)行突變操作。在三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)中，常采用將Rep基因的起始密碼子由“ATG”突變?yōu)椤癆CG”和啟動(dòng)子遠(yuǎn)離R印基因的方法降低R印蛋白的表達(dá)水平。對(duì)ITR中TRS序列的突變操作則為對(duì)TRS序列中的D序列進(jìn)行點(diǎn)突變和缺失突變，使R印蛋白不能識(shí)別。經(jīng)過(guò)這些改造，利用三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)獲得scrAAV載體的比例可達(dá)90%以上。雖然降低Rep基因的表達(dá)水平可以提高包裝獲得載體中scrAAV載體的比例，但是在不影響外源基因表達(dá)的情況下，改變ITR的結(jié)構(gòu)使R印蛋白不能識(shí)別，仍然是顯著提高包裝獲得scrAAV載體比例的重要策略之一。ITR是AAV病毒中重要的順式作用元件，在AAV病毒基因組的復(fù)制、AAV病毒顆粒的包裝等過(guò)程中都發(fā)揮作用。而且在天然狀態(tài)下，AAV病毒基因組的兩個(gè)ITR反向排列，這種排列方式保證了其基因組復(fù)制過(guò)程中的精確性和AAV病毒基因組整合入細(xì)胞基因組后的有效拯救。目前，常用的AAV載體都將兩個(gè)ITR反向排列，并在兩個(gè)ITR序列之間插入外源基因表達(dá)框。相反，在本發(fā)明中，我們提出了一種新的AAV載體即ITR同向排列的AAV載體，并在同向排列的兩個(gè)ITR之間插入外源基因表達(dá)框。我們的研究表明ITR同向排列的AAV載體不僅不會(huì)影響rAAV病毒載體的包裝和外源基因的體內(nèi)外表達(dá)還可顯著提高包裝獲得rAAV病毒中scrAAV載體的比例，為scrAAV載體制備提供了一種新的選擇。同時(shí)，本發(fā)明提出的ITR同向排列的AAV載體，只是改變了原類型AAV載體中ITR的排列方向，并未對(duì)ITR的序列進(jìn)行突變等操作，而是利用AAV病毒拯救復(fù)制過(guò)程中產(chǎn)生缺陷的ITR，使R印蛋白在包裝過(guò)程中不能切割，從而提高獲得rAAV病毒中scrAAV載體的比例。利用AAV病毒本身的拯救復(fù)制機(jī)制，減少了操作的復(fù)雜性，使scrAAV載體的構(gòu)建過(guò)程變得更加簡(jiǎn)單、方便。發(fā)明概述
本發(fā)明的第一個(gè)技術(shù)特征是構(gòu)建了一種兩個(gè)ITR同向排列的AAV載體pSDAV2，并在兩個(gè)同向排列的ITR之間插入外源基因的表達(dá)框，表達(dá)框內(nèi)攜帶多克隆位點(diǎn)(Multiplecloning sites，MCS)，用于外源表達(dá)基因的插入。本發(fā)明的第二個(gè)技術(shù)特征是該載體可用于rAAV病毒的包裝制備，且可顯著提高包裝獲得rAAV病毒載體的scrAAV載體的比例，ITR的同向排列并不影響包裝獲得rAAV病毒外源基因的體內(nèi)外表達(dá)特征。本發(fā)明的第三個(gè)特征是該載體還攜帶neo基因表達(dá)框，可用于篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株，獲得的細(xì)胞株不僅可用于rAAV病毒載體的包裝制備還可用作外源基因的蛋白表達(dá)生產(chǎn)細(xì)胞株。發(fā)明詳述ITR在AAV病毒的基因組復(fù)制和病毒包裝過(guò)程中均發(fā)揮了重要作用。在天然條件下，AAV病毒基因組中的兩個(gè)ITR序列反向排列，有利于AAV病毒基因組復(fù)制的精確性。rAAV病毒包裝系統(tǒng)中，AAV載體中的兩個(gè)ITR序列保持了其在AAV病毒基因組中的反向排列順序。相反，本發(fā)明提出并構(gòu)建了一種ITR同向排列的AAV載體pSDAV2。在該載體中，兩個(gè)ITR序列同向排列，且在兩個(gè)ITR之間插入攜帶MCS位點(diǎn)的外源基因表達(dá)框，獲得一種可插入外源基因的通用型表達(dá)載體PSDAV2。同時(shí)，該載體還攜帶neo基因表達(dá)框，用于篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株，該細(xì)胞株可進(jìn)一步應(yīng)用于rAAV病毒的制備和外源基因的表達(dá)產(chǎn)物的大量制備。在本發(fā)明中，我們主要研究了 ITR同向排列對(duì)rAAV病毒包裝的影響，包括三個(gè)方面的內(nèi)容1、ITR同向排列是否會(huì)影響rAAV病毒的包裝過(guò)程；2、ITR同向排列的AAV載體pSDAV包裝獲得rAAV病毒中scrAAV病毒載體的所占比例；3、ITR同向排列對(duì)包裝所獲得rAAV病毒中外源基因的體內(nèi)外表達(dá)特征的影響。為此，我們首先合成了 AAV2的ITR序列，并在其兩端引入合適的酶切位點(diǎn)。然后，用合成的ITR序列替換本公司原有pAAV2neo載體中的一個(gè)ITR序列，使兩個(gè)ITR序列同向排列，同時(shí)刪除了 pAAV2neo載體中的部分冗余序列，獲得pSDAV2。此后，我們將增強(qiáng)型綠色突光蛋白(Enhanced green flurocent protein, EGFP)克隆入 pSDAV2 載體,獲得PSDAV2-EGFP。將pSDAV2_EGFP轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，篩選獲得EGFP穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，包裝獲得rAAV 病毒 rAAV2-EGFP’。隨后，我們用 Sourthern Blot 方法分析了 rAAV2_EGFP’中 scrAAV所占比例，并比較分析了 rAAV2-EGFP’和rAAV2_EGFP(由原pAAV2neo載體為基本骨架，插入EGFP基因包裝獲得的病毒，參見專利申請(qǐng)?zhí)?00910009059. 6，發(fā)明名稱AAV病毒反向感染技術(shù)及AAV病毒陣列，該申請(qǐng)的附圖1)的體內(nèi)外表達(dá)特征。這些結(jié)果表明ITR的同向排列不僅可以rAAV病毒的包裝和包裝獲得rAAV病毒中報(bào)告基因EGFP的體內(nèi)外表達(dá)效率，還可提高包裝獲得rAAV病毒中scrAAV病毒的比例?？傊?，本發(fā)明提出并構(gòu)建的pSDAV2載體為scrAAV病毒載體的包裝提供了一種新的選擇。


圖lpAAV2neo質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；BGH poly (A)是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨芐青霉素抗性基因。圖2pMD18T-R-1TR質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列！promoter是原核啟動(dòng)子,用于pMD18T_R_ITR中相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。
圖3pSDAV2_Pre質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；CMV promoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；BGH poly (A)是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨芐青霉素抗性基因。圖4pSDAV2質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；BGH poly (A)是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨芐青霉素抗性基因。圖5pSDAV2-EGFP質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；CMV promoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；EGFP是增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因；BGH poly (A)是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；Amp是氨芐青霉素抗性基因。圖6Southern blot 檢測(cè)包裝獲得 rAAV2_EGFP’中 scrAAV 的比例結(jié)果。Southernblot檢測(cè)包裝獲得rAAV2-EGFP’中scrAAV的比例，并與ITR反向排列的包裝獲得的rAAV2-EGFP比較。泳道I和3是rAAV2_EGFP提取基因組DNA分別上樣5 μ L和10 μ L，堿性瓊脂糖凝膠電泳后，southern blot檢測(cè)結(jié)果；泳道2和4是rAAV2_EGFP’提取基因組DNA分別上樣5 μ L和10 μ L,堿性瓊脂糖凝膠電泳后，southern blot檢測(cè)結(jié)果。圖7ITR同向排列AAV病毒拯救過(guò)程示意圖。本圖示意了 ITR同向排列的AAV載體整合入細(xì)胞染色體中的拯救過(guò)程。拯救過(guò)程分為9步，圖A至J中a、a’、b、b’、C、c’、d和d’分別表示ITR中的部分序列，其中a和a’、b和b’、c和c’、d和d’互補(bǔ)配對(duì)，使單鏈ITR能夠自我折疊形成“T”字型結(jié)構(gòu)。復(fù)制過(guò)程中，新合成的序列用粗線表示。具體的拯救過(guò)程為，首先ITR同向排列的AAV載體整合入細(xì)胞染色體，形成如圖A所示的結(jié)構(gòu)；然后ITR序列被AAV病毒的Rep蛋白識(shí)別、結(jié)合并d序列中產(chǎn)生切口，形成如圖B所示的結(jié)構(gòu)；在細(xì)胞內(nèi)DNA損傷修復(fù)機(jī)制的作用下，切口發(fā)生移動(dòng)，一端ITR完成復(fù)制，另一端ITR形成缺失部分d序列的單鏈(圖C);該單鏈中ITR序列自我折疊，形成“T”字型結(jié)構(gòu)(圖D);在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行自我復(fù)制，結(jié)構(gòu)如圖E所示。完成復(fù)制后，在Rep蛋白的作用，在d序列處再次產(chǎn)生切口(圖F)，開始新一輪的復(fù)制過(guò)程。同樣，完成ITR的復(fù)制過(guò)程后(圖G)，新合成鏈(圖G中粗線表示)中ITR序列再次自我折疊，形成“T”字型結(jié)構(gòu)(圖H)，開始再次復(fù)制過(guò)程，完成復(fù)制過(guò)程后的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示。圖1中ITR序列進(jìn)一步折疊形成，形成“T”字型結(jié)構(gòu)，兩個(gè)正常的ITR之間，包含一個(gè)缺失d序列的ITR，使包裝獲得的AAV病毒單鏈基因組中完全互補(bǔ)的序列，可互補(bǔ)配對(duì)形成雙鏈(圖J)。圖8rAAV2-EGFP 和 rAAV2_EGFP’分別感染 B16F10、3LL 和 NIH/3T3 細(xì)胞結(jié)果。圖 A和圖D分別表示rAAV2-EGFP’和rAAV2_EGFP感染B16F10細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡拍照結(jié)果；圖B和圖E分別表示rAAV2-EGFP’和rAAV2_EGFP感染3LL細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡拍照結(jié)果；圖C和圖F分別表示rAAV2-EGFP’和rAAV2_EGFP感染NIH/3T3細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡拍照結(jié)果。圖9rAAV2-EGFP’ 和 rAAV2_EGFP 體內(nèi)表達(dá)特征比較結(jié)果。rAAV2_EGFP’ 和!■AAV2-EGFP分別注射C57BL/6小鼠右后肢脛前肌，不同時(shí)間處死小鼠取右后肢脛前肌，冰凍切片后，熒光顯微鏡觀察拍照，并在注射病毒6周后對(duì)小鼠右后肢脛前肌拍照。圖A至D表示的是rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠I周、2周、6周和6個(gè)月后，處死小鼠取右后肢脛前肌，冰凍切片后，熒光顯微鏡觀察拍照結(jié)果；圖E表示的rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠6周后，右后肢脛前肌拍照結(jié)果；圖F至H表示的是rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠I周、2周、6周和6個(gè)月后，處死小鼠取右后肢脛前肌，冰凍切片后，熒光顯微鏡觀察拍照結(jié)果；圖1表示的rAAV2-EGFP’注射C57BL/6小鼠6周后，右后肢脛前肌拍照結(jié)果。以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的ITR同向排列的AAV構(gòu)建及其應(yīng)用作了詳細(xì)說(shuō)明，但并不 意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例1ITR同向排列的通用型AAV載體pSDAV2的構(gòu)建1、ITR序列的設(shè)計(jì)合成首先，我們對(duì)本公司原有的AAV載體pAAV2neo(圖1)進(jìn)行了酶切位點(diǎn)分析，選擇pAAV2neo載體中離CMV啟動(dòng)子較近的ITR為替換對(duì)象，并選擇了 HpaI和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)用于切除替換的ITR序列。根據(jù)選定的用于切除ITR序列酶切位點(diǎn)，我們?cè)O(shè)計(jì)并合成攜帶ITR的序列R-1TR(委托Takara公司合成，大連，中國(guó))，并將該序列克隆入pMD18Tsimple (委托Takara公司合成，大連，中國(guó))，命名為pMD18T-R-1TR(圖2)。合成R-1TR序列具體如下5’ ctcRaRJctaga ttgtttattgcagcttataatggttacaaataaagcaatagcatcacaaatttcacaaataaagcatXhoI XbaIttttttcactgcattctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtatcttatcatgtctggatct gctagc ttggccactccctNheIctctgcgcgctcgctcgctcactgaggccgggcgaccaaaggtcgcccgacgcccgggctttgcccggg
CggCCtcagtgagcgagcgagcgcgcagagagggagtggccaactccatcactaggggttcct gttaac 3’Hpal在合成序列的兩端分別引入XhoI和HpaI酶切位點(diǎn)，但與ITR的相對(duì)方向和原來(lái)相反，使替換后兩個(gè)ITR同向排列。同時(shí)為了方便克隆操作，在ITR序列(即酶切位點(diǎn)NheI和HpaI之間的序列)的5’端引入長(zhǎng)度為133bp的冗余序列(即XbaI和NheI之間的序列)。用合成序列替換原ITR相關(guān)序列后，XbaI和NheI消化、連接去除冗余序列。2、pSDAV2載體的構(gòu)建為了構(gòu)建ITR同向排列的AAV通用型載體pSDAV2，我們首先用HpaI和XhoI (NEB,美國(guó))消化本公司原有的AAV載體pAAV2neo，切除ITR序列，瓊脂糖凝膠電泳后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國(guó))回收長(zhǎng)度為6787bp的載體片段。同時(shí)用HpaI和XhoI (NEB，美國(guó))消化pMD18T-R-1TR，瓊脂糖凝膠電泳后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國(guó))回收大小為296bp的片段。將該片段與回收的載體片段用T4DNA連接酶(NEB，美國(guó))連接后，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(Takara，大連，中國(guó))，挑取克隆，酶切鑒定正確后，獲得pSDAV2-pre (圖3)。在此基礎(chǔ)上，用XbaI和NheI (NEB，美國(guó))消化pSDAV2-pre,瓊脂糖凝膠電泳后,瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen,北京，中國(guó))回收大小為6948bp的載體片段。載體片段T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(Takara，大連，中國(guó))，挑取克隆，酶切鑒定正確后，獲得pSDAV2(圖4)。實(shí)施例2pSDAV2_EGFP載體的構(gòu)建為了驗(yàn)證ITR同向排列的通用型載體pSDAV2的功能，我們先用KpnI和EcoRI (NEB，美國(guó))消化PSDAV2載體，瓊脂糖凝膠電泳后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國(guó))回收大小為6942bp的載體片段。同時(shí)，用KpnI和EcoRI (NEB，美國(guó))消化pAAV2neo-EGFP (本公司構(gòu)建并保存)，瓊脂糖凝膠電泳后，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(Tiangen，北京，中國(guó))回收大小為756bp的EGFP基因片段。將EGFP基因片段和載體片段用T4DNA連接酶(NEB，美國(guó))連接后，轉(zhuǎn)化E. coli JM109感受態(tài)細(xì)胞(Takara，大連，中 國(guó))，挑取克隆，提取質(zhì)粒，酶切鑒定正確，獲得PSDAV2-EGFP (圖5)。實(shí)施例3rAAV2_EGFP’病毒的制備將質(zhì)粒pSDAV2-EGFP 用 Lipofectamine 2000 (Invitrogen，美國(guó))轉(zhuǎn)染 BHK21 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程參見Lipofectamine 2000說(shuō)明書。具體的轉(zhuǎn)染過(guò)程如下轉(zhuǎn)染前l(fā)d，BHK21細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(IxlO5個(gè)細(xì)胞/孔)；轉(zhuǎn)染前4h，培養(yǎng)BHK21細(xì)胞用10%FBS DMEM(Invitrogen，美國(guó))換液(300 μ L/孔)。轉(zhuǎn)染時(shí)按如下過(guò)程配制轉(zhuǎn)染液，以每孔為例具體說(shuō)明。取 50yL OPT1-MEM (Invitrogen，美國(guó))加入 2μ L Lipofectamine 2000，同時(shí)，取 50 μ L OPT1-MEM(Invitrogen，美國(guó))加入 O. 8 μ g 的 pSDAV2_EGFP 質(zhì)粒，分別輕彈混勻，室溫放置5min。然后將兩種液體混合,輕彈混勻，室溫靜置20min,加入培養(yǎng)細(xì)胞中，并前后左右晃動(dòng)混勻。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞于5% CO2 37°C孵箱中培養(yǎng)過(guò)夜，第二天待細(xì)胞密度至90 %以上，將細(xì)胞消化轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并用G418終濃度為800 μ g/ml的10% FBS DMEM培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)15d，獲得穩(wěn)定表達(dá)EGFP細(xì)胞株BHK21/EGFP，并挑取12個(gè)單細(xì)胞克隆，依次編號(hào)為C1-C12。利用伍志堅(jiān)(Wu ZJ，Wu XB, Hou YD. Contruction ofa recombinant herpes simplex virus which can provide packaging function forrecombinant adeno-associated virus. Chin Sci Bull, 1999,44(8) :715-719.)等報(bào)道的方法包裝獲得 rAAV2-EGFP’ 病毒，吳小兵(Wu XB, Dong XY, Wu ZJ, et al. A novel methodfor purification of recombinant adeno-associated virus vectors on a largescale. Chin Sci Bull, 2001,46 (6) :485-489.)等報(bào)道的方法濃縮純化病毒，斑點(diǎn)雜交法檢測(cè)包裝獲得rAAV2-EGFP’病毒滴度，結(jié)果表明單細(xì)胞克隆C6包裝效率最高，選用C6克隆用于rAAV2-EGFP’病毒的大量制備。實(shí)施例4Southern blot檢測(cè)包裝獲得rAAV2_EGFP’中scrAAV的比例為了檢測(cè)用pSDAV2-EGFP包裝獲得rAAV2_EGFP’中scrAAV的比例，我們對(duì)包裝獲得的rAAV2-EGFP’進(jìn)行了 southern blot分析。首先，我們提取rAAV2_EGFP’病毒基因組，并同時(shí)提取pAAV2neo-EGFP包裝獲得rAAV2_EGFP病毒基因組作為對(duì)照。然后，提取的rAAV2-EGFP和rAAV2_EGFP’病毒基因組上樣，行堿變性瓊脂糖電泳，虹吸法轉(zhuǎn)移至帶正電的尼龍膜上，地高辛標(biāo)記的CMV探針雜交，堿磷酶標(biāo)記抗地高辛抗體孵育結(jié)合，BCIP/NBT檢測(cè)試劑盒顯色，結(jié)果如圖6所示。從圖的結(jié)果可知，雖然rAAV2-EGFP中也存在一定的雙鏈形式，但單鏈形式占90%以上；相反，rAAV2-EGFP’則主要以雙鏈形式為主，占60%以上。這表明ITR同向排列的AAV載體不僅不影響rAAV病毒的包裝，還可以顯著地提高包裝獲得rAAV病毒中雙鏈形式比例。這種提高rAAV病毒中雙鏈形式包裝比例的策略不同于直接改變AAV載體中的TRS序列，而是改變天然AAV病毒中兩個(gè)ITR序列的排列順序(反向排列)，使兩個(gè)ITR序列在AAV載體pSDAV2中正向排列。pSDAV2載體整合入染色體后，在rAAV病毒本身的天然拯救過(guò)程中，產(chǎn)生D序列缺失的ITR序列，包裝獲得雙鏈rAAV病毒。rAAV病毒的拯救過(guò)程如圖7所示。pSDAV2整合入細(xì)胞染色體后的結(jié)構(gòu)如圖A所示，a、b、C、d和a’、b’、c’、d’分別表示ITR中的部分序列，其中a和a’，b和b’，c和c’，d和d’兩兩完全互補(bǔ)。Rep蛋白識(shí)別并結(jié)合ITR中的TRS序列(d序列)，并產(chǎn)生切口，在細(xì)胞內(nèi)DNA修復(fù)相關(guān)酶的作用下，替換其中一個(gè)ITR序列，并刪除另一個(gè)ITR的d序列，在R印蛋白的作用下，折疊形成如圖所示的ITR二級(jí)結(jié)構(gòu)。然后，以其中一個(gè)ITR形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)為引物，開始DNA的復(fù)制過(guò)程。待DNA復(fù)制過(guò)程完成后，形成的雙鏈d序列，又被Rep蛋白 識(shí)別結(jié)合并產(chǎn)生切口，開始DNA的重新復(fù)制。復(fù)制完成后，在R印蛋白的作用下，ITR重新折疊形成其二級(jí)結(jié)構(gòu)，DNA進(jìn)一步復(fù)制，如此反復(fù)，形成正常ITR和d序列缺失ITR間隔依次排列的多個(gè)重復(fù)AAV病毒基因組。由于R印蛋白只能識(shí)別并切割正常ITR序列，因此在包裝過(guò)程中形成攜帶兩個(gè)正常ITR序列、缺失d序列ITR序列和完全互補(bǔ)兩條單鏈序列的自身互補(bǔ)的 AAV(Self complementary AAV, scAAV)病毒顆粒。實(shí)施例5rAAV2_EGFP’轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)特點(diǎn)研究為了研究rAAV2-EGFP’轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)特點(diǎn)，我們將rAAV2_EGFP和rAAV2_EGFP’分別以 IxlO5Vg/細(xì)胞(viral genome, vg)轉(zhuǎn)導(dǎo) B16F10、3LL 和 NIH/3T3 細(xì)胞。48h 后，熒光倒置顯微鏡(Nikon TE-300)觀察EGFP表達(dá)情況并拍照，如圖8所示。結(jié)果表明，在三種細(xì)胞中，轉(zhuǎn)導(dǎo)rAAV2-EGFP’均比轉(zhuǎn)導(dǎo)rAAV2_EGFP細(xì)胞的EGFP表達(dá)效率高，這說(shuō)明scrAAV能夠有效地提高外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。而且，B16F10為肝癌來(lái)源細(xì)胞系，3LL為肺癌來(lái)源細(xì)胞系，NIH/3T3為成纖維細(xì)胞，在三種不同來(lái)源的細(xì)胞，均呈現(xiàn)相似的表達(dá)規(guī)律，這進(jìn)一步說(shuō)明scrAAV提高外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的普遍性。實(shí)施例6rAAV2_EGFP’轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠肌肉表達(dá)特點(diǎn)研究為了研究rAAV2-EGFP ’的體內(nèi)表達(dá)特點(diǎn)，rAAV2_EGFP和rAAV2_EGFP ’分別以IxlO10Vg/只注射于6-8周齡C57BL/6小鼠(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)研究所，北京，中國(guó))右后肢脛前肌。注射rAAV2-EGFP’和rAAV2_EGFP不同時(shí)間(I周、2周、6周和6個(gè)月)后，分別取注射右后肢脛前肌，冰凍切片，熒光倒置顯微鏡(Nikon TE-300)觀察EGFP表達(dá)情況并拍照，如圖9A-D和圖9F-H所示。同時(shí)，對(duì)注射6周后的整個(gè)右后肢脛前肌拍照，如圖9E和圖91所示。結(jié)果表明體內(nèi)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與體外的一致，rAAV2-EGFP’轉(zhuǎn)導(dǎo)小鼠脛前肌的效率明顯比rAAV2-EGFP高，這再次證明scrAAV能夠有效提高外源基因在體內(nèi)的表達(dá)效率。名詞及縮寫詞解釋1、AAV :adeno_associated virus,腺相關(guān)病毒。2、ITR :1nverted terminal repeat,倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)。3、AAV2 病毒2 型 AAV 病毒(adeno-associated virus serotype 2)。
4、pAAV2neo質(zhì)粒是一種攜帶了 AAV2病毒ITR的質(zhì)粒DNA。所述的AAV載體質(zhì)粒一般由AAV2ITR、啟動(dòng)子、目的基因或阻斷序列、ployA、AAV2 ITR以及E. coli質(zhì)粒骨架組成。質(zhì)粒骨架上攜帶了 neo基因的表達(dá)單位。5、CMV promoter :人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子。6、BGH poly⑷牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列。7、Neo :氨基糖轉(zhuǎn)移酶基因。 8、Amp :氨芐青霉素抗性基因。
權(quán)利要求
1.1TR同向排列的AAV載體，其技術(shù)特征在于兩個(gè)AAV2 ITR同向排列且ITR間包含一個(gè)外源基因表達(dá)框，用于外源基因的插入。
2.如權(quán)利要求1所述，該載體可用于重組AAV病毒的制備，且明顯提高重組AAV病毒中scrAAV(Self complementary rAAV)的比例，scrAAV 比例達(dá)到 60% 以上。
3.如權(quán)利要求2所述，包裝獲得rAAV病毒可明顯提高外源基因在體內(nèi)外的表達(dá)強(qiáng)度。
4.如權(quán)利要求1所述，外源基因表達(dá)框中的啟動(dòng)子可以是CMV、CAG、TTR、SV40等多種啟動(dòng)子，并根據(jù)不同的需要進(jìn)行選擇。
5.如權(quán)利要求1所述，外源基因可以是蛋白編碼基因、shRNA、siRNA、miRNA等多種基因。
6.如權(quán)利要求1所述，該載體整合入細(xì)胞染色體后，病毒包裝拯救過(guò)程中可產(chǎn)生d序列缺失的ITR。
7.如權(quán)利要求1所述，該載體可應(yīng)用于以HSVl為輔助病毒的rAAV載體包裝系統(tǒng)。
8.如權(quán)利要求1所述，該載體包含neo基因表達(dá)框，可用于篩選獲得外源基因的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種ITR同向排列的AAV載體pSDAV2，該表達(dá)載體主要由兩個(gè)同向排列的AAV2的ITR、篩選基因表達(dá)框和外源基因表達(dá)框組成，其中外源基因表達(dá)框中含有多克隆位點(diǎn)MCS，用于表達(dá)外源基因的插入。將報(bào)告基因插入pSDAV2載體，篩選獲得細(xì)胞株，利用“一個(gè)細(xì)胞株/一株輔助病毒”策略包裝重組AAV病毒，發(fā)現(xiàn)ITR同向排列不僅能夠明顯提高包裝獲得重組AAV病毒中雙鏈AAV病毒的比例，還能增強(qiáng)包裝攜帶基因的體內(nèi)外表達(dá)效率?？傊?，本發(fā)明提出并構(gòu)建了一種ITR同向排列的AAV載體，為重組AAV病毒的包裝特別是重組雙鏈AAV病毒的包裝提供了新的選擇。
文檔編號(hào)C12N15/864GK103014064SQ20111028314
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者董小巖, 田文洪, 吳小兵, 董哲岳 申請(qǐng)人:北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司