專利名稱：：攜帶雙篩選基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建及其應(yīng)用的制作方法攜帶雙篩選基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建及其應(yīng)用本發(fā)明屬于生物技術(shù)發(fā)明領(lǐng)域。本發(fā)明具體涉及一種攜帶dhfr和neo基因的真核表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr，該表達(dá)載體主要由AAV2的ITR、neo基因表達(dá)框、dhfr基因表達(dá)框和外源基因表達(dá)框組成，其中外源基因表達(dá)框中含有多克隆位點(diǎn)MCS，用于表達(dá)外源基因的插入。使用時(shí)將外源基因插入其表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)之間，獲得外源基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)細(xì)胞，多種策略篩選獲得外源基因的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株。由于該載體攜帶AAV2的ITR序列，因此有利于外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得。同時(shí)，該載體包含兩種篩選基因，適用于多種表達(dá)細(xì)胞并縮短穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的篩選過(guò)程。本載體可高效地真核表達(dá)多種外源基因，為真核蛋白的表達(dá)提供了新的選擇。背景表達(dá)載體是一種將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞，并使宿主細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)外源基因的運(yùn)載工具。根據(jù)宿主細(xì)胞的不同,表達(dá)載體可分為以大腸桿菌為主要宿主的原核表達(dá)載體和以酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞為宿主的真核表達(dá)載體。所謂真核表達(dá)載體指的是將外源基因?qū)胝婧怂拗骷?xì)胞(如酵母、昆蟲(chóng)細(xì)胞、植物細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)的工具，而且其攜帶的結(jié)構(gòu)元件不僅直接影響外源基因的表達(dá)水平還影響外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得。為了實(shí)現(xiàn)外源基因的穩(wěn)定聞效表達(dá)，真核表達(dá)載體通常具有以下基本兀件真核啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)、加尾信號(hào)序列、真核篩選基因表達(dá)框以及原核復(fù)制子和篩選基因表達(dá)框，其中啟動(dòng)子調(diào)控外源基因的轉(zhuǎn)錄，多克隆位點(diǎn)用于外源基因的插入，真核篩選基因用于篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株，原核復(fù)制子和篩選基因則用于真核表達(dá)載體的構(gòu)建和擴(kuò)增。在真核表達(dá)載體中，常用的真核啟動(dòng)子為巨細(xì)胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子、小鼠巨細(xì)胞病毒(Mousecytomegalovirus,mCMV)啟動(dòng)子和猴空泡病毒40(Simianvirus40，SV40)啟動(dòng)子等。這些啟動(dòng)子均具有很高的轉(zhuǎn)錄活性，有利于外源基因的高效表達(dá)。利用真核篩選基因獲得外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，是蛋白表達(dá)過(guò)程中常用的一種策略。目前常用的真核篩選基因?yàn)閚eo(氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因、dhfr(二氫葉酸還原酶)基因、puro(嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)基因和Hyg(潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶)基因等。其基本原理是當(dāng)真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞后，用含有真核表達(dá)載體表達(dá)篩選基因的作用底物(該底物通常會(huì)抑制細(xì)胞株的生長(zhǎng)或?qū)е录?xì)胞死亡)的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，轉(zhuǎn)導(dǎo)真核表達(dá)載體的細(xì)胞由于表達(dá)篩選基因而存活且生長(zhǎng)，未轉(zhuǎn)導(dǎo)真核表達(dá)載體的細(xì)胞則生長(zhǎng)受到抑制或死亡。在實(shí)際操作中，獲得穩(wěn)定表達(dá)外源基因的細(xì)胞株以后，因細(xì)胞株中不同細(xì)胞間外源基因表達(dá)水平差異，通常還需將細(xì)胞單克隆化，進(jìn)一步篩選獲得高表達(dá)的單克隆細(xì)胞株。neo基因是一種常用的獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的篩選基因，編碼氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，其作用原理是氨基糖類抗生素G418通過(guò)影響核糖體80S亞基功能抑制蛋白質(zhì)合成，從而對(duì)真核細(xì)胞產(chǎn)生毒性，當(dāng)neo基因整合進(jìn)入細(xì)胞基因組后，穩(wěn)定表達(dá)氨基糖甘膦酸轉(zhuǎn)移酶，使G418磷酸化，導(dǎo)致其失活，細(xì)胞存活并生長(zhǎng)。neo基因作為一種選擇標(biāo)記基因，以廣泛地應(yīng)用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源基因細(xì)胞株的篩選。以neo基因?yàn)楹Y選基因且來(lái)源于ATCC(AmericanTissueCultureColection)的pSV2neo,作為一種經(jīng)典的表達(dá)載體，現(xiàn)在仍存在較為廣泛的應(yīng)用。dhfr基因編碼二氫葉酸還原酶,含有NADPH的二氫葉酸還原酶催化二氫葉酸還原成四氫葉酸，為核苷酸的從頭合成提供一碳單位。二氫葉酸還原酶缺陷性細(xì)胞由于缺乏核苷酸從頭合成所必需的二氫葉酸還原酶，需要在培養(yǎng)基中加入次黃嘌呤和胸腺嘧啶，細(xì)胞利用次黃嘌呤和胸腺嘧啶通過(guò)核苷酸補(bǔ)救合成途徑合成細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的核苷酸而維持生長(zhǎng)。以dhfr為篩選基因，CH0/dhfr_細(xì)胞轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體后可以在不含次黃嘌呤和胸腺嘧啶的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，同時(shí)在培養(yǎng)基中加入氨甲喋呤可以使外源基因的拷貝數(shù)擴(kuò)增，提高外源基因的表達(dá)水平(NunbergJ.H.，KaufmanR.J.，SchimkeR.T.，etal.Amplifieddihydrofolatereductasegenesarelocalizedtoahomogeneouslystainingregionofasinglechromosomeinamethotrexate—resistantChinesehamasterovarycellline.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA,1978,75(11):5553-5556.)。而且CHO細(xì)胞使用時(shí)間長(zhǎng)，遺傳背景清楚，既能貼壁培養(yǎng)又能懸浮培養(yǎng)，較易轉(zhuǎn)染外源基因，是重組蛋白表達(dá)常用的細(xì)胞株。因此，dhfr基因通常作為CHO/dhfr—細(xì)胞株表達(dá)外源基因的選擇基因。為了提高外源基因表達(dá)細(xì)胞株基因組中的整合頻率，美國(guó)專利(U.S.Pat.No.5928914)描述了一種利用Cre-1ox酶系統(tǒng)使表達(dá)外源基因定點(diǎn)整合而獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的方法，而且選擇整合頻率較高的載體(如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體)也有助于表達(dá)外源基因的整合。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中的長(zhǎng)末端重復(fù)序列(LongTerminalRepeat,LTR)有利于實(shí)現(xiàn)外源基因的整合。與此相似，腺相關(guān)病毒(Adeno-associatedvirus,AAV)的反向末端重復(fù)序列(InvertedTerminalRepeat,ITR)可在沒(méi)有輔助病毒的存在的情況下,使位于兩個(gè)ITR之間序列以附加體(episome)的形式存在于細(xì)胞內(nèi)(NakaiH.,StormT.A.andKayM.A.Recruitmentofsingle-strandedrecombinantadeno-associatedvirusvectorgenomesandintermolecularrecombinationareresponsibleforstabletransductionofliverinvivo.JVirol.，2000，74(20):9451-9463.NakaiH.,YantS.R.,StormT.A.，etal.Extrachromosomalrecombinantadeno-associatedvirusvectorgenomesareprimarilyresponsibleforstablelivertransductioninvivo.JVirol.,2001,75(15):6969-6976.),并在輔助病毒協(xié)助下實(shí)現(xiàn)序列的整合(DeyleD.R.andRussellD.ff.Adeno-associatedvirusvectorintegration.Curr.Opin.Mol.Ther.,2009,11(4)442-447.)。美國(guó)專利(Pub.No.US2003/0064517A1)報(bào)道了一種攜帶neo基因和dhfr基因的真核表達(dá)載體，其特點(diǎn)是neo基因表達(dá)框、dhfr基因表達(dá)框和外源基因表達(dá)框順序一致，且相鄰之間沒(méi)有其他序列間隔。利用這種表達(dá)載體可以快速地獲得外源基因的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株。本發(fā)明中，我們也構(gòu)建了一種攜帶兩個(gè)篩選基因的真表達(dá)載體，兩個(gè)篩選基因分別由不同的啟動(dòng)子調(diào)控其表達(dá)，兩個(gè)篩選基因分別具有不同的篩選功能，一者主要作用于穩(wěn)定細(xì)胞的獲得篩選過(guò)程，一者則主要實(shí)現(xiàn)外源表達(dá)基因的選擇性擴(kuò)增，提供高外源基因的表達(dá)水平。而且，本發(fā)明中的雙篩選基因表達(dá)載體，外源基因表達(dá)框和dhfr基因表達(dá)框位于AAV2的兩個(gè)ITRs之間，且兩者之間方向相反被絕緣子序列間隔，有利于外源基因表達(dá)框的穩(wěn)定表達(dá)和避免了外源基因表達(dá)框中啟動(dòng)子對(duì)篩選基因表達(dá)的影響，有助于篩選基因的低表達(dá)。利用該載體可以簡(jiǎn)單、快速地獲得外源基因的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株，有效地實(shí)現(xiàn)外源基因的聞效表達(dá)，為真核重組蛋白的表達(dá)提供了一種新的工具。發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)技術(shù)特征是構(gòu)建了一種攜帶兩個(gè)篩選基因的真核表達(dá)載體，一個(gè)篩選基因用于獲得穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，另一篩選基因用于表達(dá)外源基因的選擇性擴(kuò)增，利用該載體可以簡(jiǎn)單、快速地實(shí)現(xiàn)真核重組蛋白的高效表達(dá)。本發(fā)明的第二個(gè)技術(shù)特征是該載體含有腺相關(guān)病毒2型(Adeno-associatedvirus2,AAV2)的ITR序列,外源基因表達(dá)框和其擴(kuò)增選擇性基因讀框位于兩個(gè)ITR之間，有利于實(shí)現(xiàn)外源基因的選擇性擴(kuò)增。本發(fā)明的第三個(gè)技術(shù)特征是，該真核表達(dá)載體攜帶3個(gè)完整的表達(dá)單元，且外源基因表達(dá)單元和選擇性擴(kuò)增篩選基因表達(dá)單元間被絕緣子序列分隔，避免了兩者間的相互影響，且選擇性擴(kuò)增篩選基因的啟動(dòng)子較弱，有助于外源基因的擴(kuò)增。發(fā)明詳述在已有的知識(shí)和進(jìn)展的基礎(chǔ)上，本發(fā)明構(gòu)建了一種攜帶兩種篩選基因的真核表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr。該載體主由外源基因表達(dá)框、neo基因表達(dá)框、dhfr基因表達(dá)框和AAV2的ITR組成，其中外源基因表達(dá)框中含有MCS位點(diǎn)，用于表達(dá)外源基因的插入，neo基因表達(dá)框編碼表達(dá)氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶，用于篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，dhfr基因表達(dá)框編碼表達(dá)二氫葉酸還原酶，選擇性擴(kuò)增外源表達(dá)基因。同時(shí)該表達(dá)載體中還含有AAV2的ITR序列，且外源基因表達(dá)框和dhfr基因表達(dá)框位于兩個(gè)ITRs之間，有利于外源基因的穩(wěn)定表達(dá)。此外，在真核表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr的基礎(chǔ)上，我們還構(gòu)建了攜帶T4噬菌體Fibritin三聚化模體序列的雙篩選真核表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr_T4，該載體可實(shí)現(xiàn)外源基因和T4噬菌體Fibritin三聚化模體的融合表達(dá)，使外源基因表達(dá)產(chǎn)物三聚化。由于在正常生理?xiàng)l件下生物體中許多蛋白質(zhì)以三聚體的形式存在并發(fā)揮作用，因此pAAV2neo-dhfr-T4為天然三聚體蛋白的表達(dá)提供了新的選擇。為了構(gòu)建pAAV2neo_dhfr，我們首先對(duì)本公司原有的pAAV2neo(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)進(jìn)行了改造，消除了其骨架中原有的HindIII位點(diǎn)，并在ITR和CMV啟動(dòng)子之間插入了MluI位點(diǎn)，獲得pAAV2neo'(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)。然后以pAAV2neo'為基礎(chǔ)，將pGL4.14-PGK(見(jiàn)實(shí)施例1)中的“insulator-PGK-Fluc-SV401atepolyA”片段通過(guò)PCR擴(kuò)增后，克隆入pAAV2neo'，獲得pAAV2neo_Fluc，其后用dhfr基因替換pAAV2neo_Fluc中的fIuc基因，獲得pAAV2neo-dhfr,具體過(guò)程詳見(jiàn)實(shí)施例1。在此基礎(chǔ)上，我們通過(guò)序列合成包含T4噬菌體Fibritin三聚體化模體序列和多克隆位點(diǎn)MCS序列的組合序列，將該序列插入pAAV2neo-dhfr中外源基因表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)中，獲得pAAV2neo-dhfr-T4。該載體可用于外源基因的三聚化表達(dá),為天然三聚體蛋白特別是同源三聚體蛋白的表達(dá)提供了新的選擇。此后，為了驗(yàn)證構(gòu)建載體的有效性，我們利用所構(gòu)建的這兩種通用型的表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr和pAAV2neo-dhfr-T4分別構(gòu)建了流感病毒血凝素蛋白HA、丙型肝炎病毒外膜蛋白El和E2的表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr-HA、pAAV2neo-dhfr-HA-T4、pAAV2neo-dhfr-El-T4、pAAV2neo-dhfr-E2-T4。然后，將這些載體分別轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，G418篩選后，獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，并用WesternBlot檢測(cè)了蛋白表達(dá)，結(jié)果表明該真核表達(dá)載體可以有效地高表達(dá)外源基因，并實(shí)現(xiàn)外源基因的三聚化表達(dá)。最后，我們將這些載體轉(zhuǎn)染CHO/dhfr_細(xì)胞，利用不同篩選策略，簡(jiǎn)單快速地獲得外源基因的高表達(dá)細(xì)胞株，并初步實(shí)現(xiàn)了重組蛋白的大規(guī)模表達(dá)(具體見(jiàn)實(shí)施例6和7)。圖lpAAV2neo質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因。圖2pAAV2neo'質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV2病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；Dl和D2是AAV2病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因。圖3pAAV2neo-Fluc質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；Luc2是螢火蟲(chóng)熒光素酶基因；Insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖4pAAV2neo-PGK-MCS質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖5pAAV2neo_dhrf質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyAl是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；DHFR是二氫葉酸還原酶基因insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖6pAAV2neo-dhfr_T4質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；DHFR是二氫葉酸還原酶基因；T4是噬菌體FibritinE的C端三聚化模體的編碼序列insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖7pAAV2neo-dhfr-HA-T4質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV40latepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；DHFR是二氫葉酸還原酶基因；HA是人工合成流感病毒血凝素蛋白編碼基因；T4是噬菌體FibritinE的C端三聚化模體的編碼序列；Insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖8pAAV2neo-dhfr-El質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；DHFR是二氫葉酸還原酶基因；tPAsp是人組織多肽抗原(Humantissuepolypeptideantigen)信號(hào)妝序列；E1是丙型肝炎(HepatitisCvirus)El基因編碼序列insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖9pAAV2neo-dhfr_El質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；DHFR是二氫葉酸還原酶基因；tPAsp是人組織多肽抗原(Humantissuepolypeptideantigen)信號(hào)妝序列；E2是丙型肝炎(HepatitisCvirus)E2基因編碼序列insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖10pAAV2neo-dhfr-El_T4質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；DHFR是二氫葉酸還原酶基因；tPAsp是人組織多肽抗原(Humantissuepolypeptideantigen)信號(hào)妝序列；E1是丙型肝炎(HepatitisCvirus)El基因編碼序列；T4是噬菌體FibritinE的C端三聚化模體的編碼序列；Insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖llpAAV2neo-dhfr-E2_T4質(zhì)粒圖譜。圖中ITR代表AAV病毒基因組的反向末端重復(fù)序列；D1和D2是AAV病毒ITR中的部分序列；CMVpromoter是人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子；PGKpromoter是人磷酸甘油酸激酶的啟動(dòng)子；BGHpolyA是牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列；SV401atepolyA是SV40病毒晚期蛋白表達(dá)的加尾信號(hào)序列；neo是新霉素抗性基因；ampR是氨芐青霉素抗性基因；DHFR是二氫葉酸還原酶基因；tPAsp是人組織多肽抗原(Humantissuepolypeptideantigen)信號(hào)妝序列;E2是丙型肝炎(HepatitisCvirus)E2基因編碼序列；T4是噬菌體FibritinE的C端三聚化模體的編碼序列；Insulator是來(lái)源于人類16號(hào)染色體上的轉(zhuǎn)錄終止序列。圖12WB檢測(cè)表達(dá)重組蛋白圖。WesternBlot檢測(cè)pAAV2neo-dhfr-HA_T4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后，細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)HA-T4融合蛋白表達(dá)。圖中泳道I表示的是蛋白Marker,泳道2和3表示的是BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAAV2neo-dhfr-HA_T4質(zhì)粒48h后，用HA單克隆抗體檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中HA表達(dá)結(jié)果；泳道4表示的是未轉(zhuǎn)染pAAV2ne0-dhfr-HA-T4質(zhì)粒BHK21細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果；泳道5和6表示的是BHK21細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAAV2neo-dhfr-HA-T4質(zhì)粒48h后，用HA單克隆抗體檢測(cè)細(xì)胞裂解液中HA表達(dá)結(jié)果；泳道7表示的是未轉(zhuǎn)染pAAV2ne0-dhfr-HA-T4質(zhì)粒BHK21細(xì)胞裂解液中的HA表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。圖13WB檢測(cè)三種篩選策略重組蛋白表達(dá)強(qiáng)弱。WesternBlot檢測(cè)pAAV2neo-dhfr-HA-T4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后，三種不同的篩選策略獲得穩(wěn)定表達(dá)HA-T4融合蛋白細(xì)胞株，細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)HA-T4融合蛋白表達(dá)強(qiáng)弱。圖中泳道I和4分別表示的是800μg/ml的G418選擇培養(yǎng)基篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)HA-T4的表達(dá)水平；泳道2和5分別表示的是IOOnM的MTX選擇培養(yǎng)基篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)HA-T4的表達(dá)水平；泳道3和6分別表示的是800μg/ml的G418和IOOnM的MTX選擇培養(yǎng)基篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞內(nèi)HA-T4的表達(dá)水平。圖14WB檢測(cè)MTX進(jìn)一步加壓培養(yǎng)后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的重組蛋白表達(dá)強(qiáng)弱。圖中泳道I表示的是先用800μg/ml的G418選擇培養(yǎng)基篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，再用MTX加壓后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HA-T4表達(dá)水平；泳道2表示的是先用IOOnM的MTX選擇培養(yǎng)基篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，再用MTX加壓后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HA-T4表達(dá)水平；泳道3表示的是先用800μg/ml的G418和IOOnM的MTX選擇培養(yǎng)基篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，再用MTX加壓后，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HA-T4表達(dá)水平。圖15WB檢測(cè)El和E2表達(dá)。圖A表示的是El的檢測(cè)結(jié)果，泳道I表示的G418篩選獲得細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中El的表達(dá)水平；泳道2表示的是先用G418篩選再用MTX加壓后的細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中El的表達(dá)水平；圖B表示的是E2的檢測(cè)結(jié)果，泳道I表示的G418篩選獲得細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中E2的表達(dá)水平；泳道2表示的是先用G418篩選再用MTX加壓后的細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中E2的表達(dá)水平。圖16WB檢測(cè)E1-T4和E2-T4表達(dá)。圖A表示的是E1-T4的檢測(cè)結(jié)果，泳道I表示的是先用G418篩選再用MTX加壓后的細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中E1-T4的表達(dá)水平，泳道2表示的G418篩選獲得細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中E1-T4的表達(dá)水平；圖B表示的是E2-T4的檢測(cè)結(jié)果，泳道I表示的是先用G418篩選再用MTX加壓后的細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中E2-T4的表達(dá)水平，泳道2表示的G418篩選獲得細(xì)胞株細(xì)胞培養(yǎng)上清中E2-T4的表達(dá)水平。以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的攜帶dhfr和neo基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建及其應(yīng)用作了詳細(xì)說(shuō)明，但并不意味著限制本發(fā)明的內(nèi)容。實(shí)施例lpAAV2neo_dhfr載體的構(gòu)建1、pAAV2neo載體的改造為了構(gòu)建pAAV2neo-dhfr載體，我們首先對(duì)本實(shí)驗(yàn)室原有的表達(dá)載體譜pAAV2neo(具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖1)進(jìn)行了改造，消除pAAV2neo載體中原有的HindIII酶切位點(diǎn)。具體的過(guò)程為pAAV2ne0用HindIII酶切消化后，回收大小為7074bp的片段，用Klenow酶(NEB，美國(guó))補(bǔ)平酶切后產(chǎn)生的粘性末端，再用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5aMaxEfficiency(Invitrogen,美國(guó))細(xì)胞,挑取克隆,提取質(zhì)粒,酶切測(cè)序鑒定正確。在此基礎(chǔ)上，我們繼續(xù)在消除了HindIII的pAAV2neo載體的ITR和CMV啟動(dòng)子之間插入MluI酶切位點(diǎn)，方便外源基因的插入。具體過(guò)程為將消除了HindIII酶切位點(diǎn)的pAAV2neo表達(dá)載體用XhoI消化后，回收該片段備用。然后，設(shè)計(jì)并由Invitrogen公司合成以下序列Pl5ftcgaggtgactgtcattacgcgf3P25ftcga^cgcgiaatgacagtcacc3>在Pl和P2中，斜體且下劃線標(biāo)記處為MluI酶切位點(diǎn)。將合成的Pl和P2退火后，形成含有MluI酶切位點(diǎn)和XhoI酶切后產(chǎn)生的粘性末端的接頭，將該接頭與XhoI酶切消化后的消除了HindIII酶切位點(diǎn)的pAAV2neo表達(dá)載體用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5aMaxEfficiency感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得改造后的pAAV2neo載體pAAV2neo'(具體結(jié)構(gòu)見(jiàn)附圖2)。2、pAAV2neo-Fluc表達(dá)載體的構(gòu)建為了構(gòu)建pAAV2ne0-Fluc表達(dá)載體，我們首先構(gòu)建了攜帶片段“Insulator-PGK-Fluc_SV401atepolyA”的質(zhì)粒pGL4.14-PGK。具體的構(gòu)建過(guò)程為以PPGK-El(本公司構(gòu)建并保存)為模板，設(shè)計(jì)并合成引物P3:5，cagggtaccattctaccgggtagg3，P4:5，attgaattctcgaaaggcccggag3，下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，P3中的酶切位點(diǎn)為KpnI，P4為EcoRI;將PGK(humanphosphoglycerasekinase)啟動(dòng)子PCR擴(kuò)增后，定向插入pGL4.14[Luc2/hugro]vector(Promega),獲得包含Insulator-PGK-Fluc_SV401atepolyA片段的質(zhì)粒pGL4.14-PGK。然后，以PGL4.14-PGK為模板，設(shè)計(jì)并合成以下引物P5:5，gaactcgagtggacaggccgcaat3>P6:5，caaacscstgagcgcccaatacgc3>下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，P5中的酶切位點(diǎn)為XhoI，P6中的為MluI;然后，以pGL4.14-PGK為模板，以P5和P6為引物，PCR擴(kuò)增Insulator-PGK-Fluc_SV401atepolyA片段，定向插入ρΑΑν2ηθο'中XhoI和MluI位點(diǎn)之間，獲得pAAV2neo_Fluc(見(jiàn)附圖3)。3、pAAV2neo-PGK-MCS載體的構(gòu)建將pAAV2ne0-Fluc用XbaI和HindIII消化后，瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收8100多bp片段(片段I)備用。然后，設(shè)計(jì)并合成以下序列P7:5’ctagaaggtcgsctasctgtcgta3>P8:5，aecttacgacasctasccgacctt3>下劃線標(biāo)記處為NheI酶切位點(diǎn)。P7和P8退火后形成包含NheI酶切位點(diǎn)和Xba1、HindIII酶切后產(chǎn)生的粘性末端的接頭，將該接頭與片段I用T4DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5aMaxEfficiency感受態(tài)細(xì)胞，挑取克隆，提取質(zhì)粒，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-PGK-MCS(見(jiàn)附圖4)。4、pAAV2neo-dhfr表達(dá)載體構(gòu)建設(shè)計(jì)并合成以下引物P9:5，tccaascttgccacaagcatggtt3>PlO:5，cgctctasagcatcttcctgttag3>下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，其中P9中為HindIII，PlO中為Xbal。以pREC-1RES-DHFR(本公司構(gòu)建并保存)為模板，P9和PlO為引物，PCR擴(kuò)增獲得dhfr基因片段，將該片段用HindIII和XbaI消化后，與HindIII和XbaI消化后的pAAV2neo-PGK_MCS載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5aMaxEfficiency感受態(tài)細(xì)胞,挑取克隆,提取質(zhì)粒,酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-dhfr(見(jiàn)附圖5)。實(shí)施例2pAAV2neo-dhfr_T4載體的構(gòu)建為了將pAAV2neo_dhfr載體進(jìn)一步應(yīng)用于蛋白質(zhì)的三聚體的表達(dá)，我們?cè)趐AAV2neo-dhfr載體的基礎(chǔ)上進(jìn)一步構(gòu)建了表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr-T4。該載體攜帶T4曬菌體FibritinC端三聚化結(jié)構(gòu)域的編碼序列,在該序列和啟動(dòng)子之間插入多克隆位點(diǎn)，將需要表達(dá)蛋白序列克隆入多克隆位點(diǎn)，使表達(dá)蛋白和4噬菌體FibritinC端三聚化結(jié)構(gòu)域融合表達(dá)，促進(jìn)表達(dá)蛋白形成三聚體。首先，我們根據(jù)Yang等報(bào)道的T4噬菌體FibritinC端三聚化結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列GYIPEAPRDGQAYVRKDGEWVLLSTFL(YangX.Ζ·，LeeJ.,MahonyΕ·Μ·，etal.HighlystabletrimersformedbyhumanimmunodeficiencyvirustypeIenvelopeglycoproteinfusedwiththetrimericmotifofT4bacteriophagefibritin，J.Virol.，2002，4634-4642)，按照人密碼子偏愛(ài)性(http://www.uky.edu/Pharmacy/ps/porter/CodonUsage/preferred_codons.htm)推算出T4嗷菌體FibritinC端三聚化結(jié)構(gòu)域的編碼核苷酸序列5’ggcagcggctacatccccgaggcccccagagacggccaggcctacgtgagaaaggacggcgagtgggtgctgctgagcaccttcctg3’，然后根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則推算出該序列的互補(bǔ)序列5!caggaaggtgctcagcagcacccactcgccgtcctttctcacgtaggcctggccgtctctgggggcctcggggatgtagccgctgcc3!。在此基礎(chǔ)上，在T4噬菌體FibritinC端三聚化結(jié)構(gòu)域的編碼核苷酸序列的5,端引入EcoRV、Sal1.Not1.SacII和EcoRI等酶切位點(diǎn)，方便表達(dá)外源基因的插入，在T4噬菌體FibritinC端三聚化結(jié)構(gòu)域的編碼核苷酸序列的V端引入編碼5個(gè)組氨酸的序列5'catcatcatcatcat3,，用于表達(dá)融合蛋白的檢測(cè)和純化。因此需要合成的序列為T4，5!gaattcgcctttccgcggtttggggcggccgcccctttgtcgacgggtttgatatcgggggcagcggctacatccccgaggcccccagagacggccaggcctacgtgagaaaggacggcgagtgggtgctgctgagcaccttcctgcatcatcatcatcatcattaaaagcttgagcagatct3!。然后將該序列交由寶生物工程(大連)有限公司(大連，中國(guó))合成，將合成序列克隆入pAAVSneo-dhfr載體的BglII和EcoRI位點(diǎn)之間，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-dhfr~T4(見(jiàn)附圖6)。實(shí)施例3pAAV2neo-dhfr-HA-T4表達(dá)載體構(gòu)建以pDC316-HA(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))為模板，設(shè)計(jì)并合成以下引物Pll:5，aat紐巡^gccaccatgaaggccatcctg3，P12:5，acg_gtcgacgctggccacggtgct3^下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，其中Pll的限制性酶切位點(diǎn)為EcoRI，P12的限制性酶切位點(diǎn)為SalI。以PDC316-HA為模板，Pll和P12為引物，PCR擴(kuò)增HA片段，將HA片段用EcoRI和SalI消化后，克隆入pAAVSneo-dhfl·的EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)之間，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-dhfr-HA-T4(見(jiàn)附圖7)。實(shí)施例4pAAV2neo-dhfr_El和pAAV2neo-dhfr_E2表達(dá)載體構(gòu)建1、pAAV2neo-dhfr_El構(gòu)建以pDC316-El(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))為模板，設(shè)計(jì)并合成以下引物P13:5'agggaattcgccaccatggatgcaatgaagaga3'P14:5'cgcagatcttcagccgggatagattgagca3'下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，其中P13的限制性酶切位點(diǎn)為EcoRI，P14的限制性酶切位點(diǎn)的為BglII。以pDC316-El為模板，P13和P14為引物，PCR擴(kuò)增El片段，將獲得El片段用EcoRI和BglII消化后，克隆入pAAV2neo_dhfr載體的BglII和EcoRI位點(diǎn)之間，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-dhfr-El(見(jiàn)圖8)。2、pAAV2neo-dhfr_E2構(gòu)建以pDC316_E2(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))為模板，設(shè)計(jì)并合成以下引物P15:5'tgggaattcgccaccatggatgcaatgaagaga3'P16:5'cgcagatcttcagctgagctctgatctatc3'下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，其中P15的限制性酶切位點(diǎn)為EcoRI，P16的限制性酶切位點(diǎn)為BglII。以pDC316-E2為模板，P15和P16為引物，PCR擴(kuò)增E2片段，將獲得E2片段用EcoRI和BglII消化后，克隆入pAAV2neo_dhfr載體的BglII和EcoRI位點(diǎn)之間，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-dhfr-E2(見(jiàn)圖9)。實(shí)施例5pAAV2neo-dhfr-El_T4和pAAV2neo-dhfr-E2_T4表達(dá)載體構(gòu)建1、pAAV2neo-dhfr-El_T4載體構(gòu)建以pDC316-El(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))為模板，設(shè)計(jì)并合成以下引物P175;ggggcggccgcaccgccatggatgcaatgaagaga3'P18:5'cccgatatcgccgggatagattgag3'下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，其中P17的限制性酶切位點(diǎn)為NotI，P18的限制性酶切位點(diǎn)為EcoRV。以pDC316-El為模板，P17和P18為引物，PCR擴(kuò)增El片段，將獲得El片段用EcoRV和NotI消化后，克隆入pAAV2neo-dhfr_T4載體的EcoRV和NotI位點(diǎn)之間，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-dhfr-El-T4(見(jiàn)圖10)。2、pAAV2neo-dhfr-E2_T4載體構(gòu)建以pDC316_E2(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))為模板，設(shè)計(jì)并合成以下引物P19:5，aatccgcggaccgccatggatgcaatgaag3>P20:5，cgggsatatcgctgagctctgatct3>下劃線標(biāo)記處為限制性酶切位點(diǎn)，其中P19的限制性酶切位點(diǎn)為SacII，P20的限制性酶切位點(diǎn)為EcoRV。以pDC316-E2為模板，P19和P20為引物，PCR擴(kuò)增E2片段，將獲得E2片段用EcoRV和SacII消化后，克隆入pAAV2neo-dhfr_T4載體的EcoRV和SacII位點(diǎn)之間，酶切測(cè)序鑒定正確，獲得pAAV2neo-dhfr-E2-T4(見(jiàn)圖11)。實(shí)施例6HA-T4融合蛋白的表達(dá)UBHK21為宿主細(xì)胞的HA-T4融合蛋白表達(dá)為了驗(yàn)證pAAV2ne0-dhfr-HA-T4表達(dá)載體的功能，我們首先將該表達(dá)載體轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后分別檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中的HA-T4融合蛋白量，判斷HA-T4的表達(dá)水平和分布。BHK21細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(50000個(gè)細(xì)胞/孔，10%FBSDMEM)。轉(zhuǎn)染前4hr換新鮮的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基(300μL/孔)，轉(zhuǎn)染過(guò)程參見(jiàn)Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)。每孔具體轉(zhuǎn)染過(guò)程為0.8μg質(zhì)粒DNA加入50μLOPT1-MEM培養(yǎng)液(Invitrogen，美國(guó))，2μLIipofectamine2000加入50μL0ΡΤΙ-ΜΕΜ培養(yǎng)液，分別混勻，于室溫放置5min。然后將兩種液體混勻，于室溫放置20min后,加入細(xì)胞中，并前后搖晃24孔細(xì)胞培養(yǎng)板使液體混勻，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6hr后，棄掉每孔中的培養(yǎng)液，重新加入新的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(800μL/孔)，然后將細(xì)胞繼續(xù)置于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。48hr后，收集所有細(xì)胞培養(yǎng)上清，將細(xì)胞用PBS2_清洗3次后，每孔加A200uLPR0-PREP蛋白提取溶液(賽百盛，北京，中國(guó))并按照該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，獲得細(xì)胞裂解液。用WesternBlot檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中的HA-T4含量。具體的過(guò)程為將15yL細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解液和5yLNuPAGELDSSampleBuffer(4X)(Invitrogen,美國(guó))混勻后，于70°C水浴中溫育5min,冷卻至室溫,獲得處理好的樣品。然后，將處理好的樣品上樣于預(yù)制的12%的NuPAGENovexBis-TrisGels(Invitrogen,美國(guó))中，于135V電壓下電泳Ihr后,取出凝膠切掉多余部分。利用TE77Semi_drytransferunit(AmershamBiosciences,美國(guó))，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(RPN303D，GEHealthcare)上。然后，將轉(zhuǎn)移蛋白的硝酸纖維素膜放入含5%(w/v)脫脂奶的TBST(含0.1%Tween20的TBS)(封閉液)中，于室溫溫育lhr，接著用封閉液1:200稀釋鼠源HA單抗(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))配成一抗工作液，將膜放入一抗工作液中，于37°C溫育2hr。把膜從一抗工作液中取出，用TBST清洗3次，用封閉液1:500稀釋堿磷酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG單抗(中杉金橋，北京，中國(guó))配成二抗工作液，將膜放入二抗工作液中，室溫溫育Ihr后，把膜從二抗工作液中取出，用TBST清洗3次后，將膜放入顯色液(CB203790，Calbiochem，德國(guó))中顯色15min，蒸餾水終止顯色過(guò)程。避光干燥，待膜完全干燥后，掃描獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖12，圖12的結(jié)果顯示泳道4和7均未見(jiàn)顯色的蛋白條帶而泳道2、3、5和6均有特異性的蛋白條帶顯色，這表明我們使用的鼠源HA抗體特異性好，可以特異性地檢測(cè)表達(dá)的HA-T4融合蛋白。進(jìn)一步，泳道2、3中HA-T4的量明顯多于泳道5和6，這表明表達(dá)的HA-T4融合蛋白主要以分泌的形式存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清中。同時(shí)，圖12的結(jié)果還顯示在細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中表達(dá)的HA-T4均已三種形式存在，即單體、三聚體和高聚體，但不論是細(xì)胞培養(yǎng)上清還是細(xì)胞裂解液中HA-T4形成的三聚體和高聚體均較少，這表明雖然T4卩遼菌體Fibritin的三聚化結(jié)構(gòu)域有助于三聚體的形成但形成效率較低。2、CHO/dhfr—為宿主細(xì)胞的HA-T4融合蛋白表達(dá)在驗(yàn)證了質(zhì)粒pAAV2neo-dhfr-HA-T4能夠有效表達(dá)HA-T4融合蛋白的基礎(chǔ)上，我們利用多種加壓篩選策略，簡(jiǎn)單快速地獲得了穩(wěn)定、高效表達(dá)HA-T4的CHO細(xì)胞株。具體的過(guò)程如下首先，將pAAV2neo-dhfr-HA_T4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程參考Lipofectamine2000(Invitrogen，美國(guó))說(shuō)明書(shū)。具體為，轉(zhuǎn)染前一天將CHO細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(50000個(gè)細(xì)胞/孔)，第二天待細(xì)胞融合度達(dá)到8090%時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染過(guò)程。以每孔為例，示意轉(zhuǎn)染過(guò)程，0.8ygDNA加入50yLOPT1-MEM(Invitrogen，美國(guó))培養(yǎng)液，2μLIipofectamine2000加入50μLOPT1-MEM培養(yǎng)液，分別混勻，于室溫放置5min。然后將兩種液體混勻，于室溫放置20min后,加入細(xì)胞中，并前后搖晃24孔細(xì)胞培養(yǎng)板使液體混勻，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6hr后，棄掉每孔中的培養(yǎng)液，重新加入新的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(800μL/孔)，然后將細(xì)胞繼續(xù)置于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第二天，細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，根據(jù)不同的篩選策略利用相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基對(duì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行選擇培養(yǎng)。本研究中，我們共設(shè)置了G418、MTX(氨甲喋呤，Sigma)單獨(dú)篩選和G418、MTX同時(shí)篩選三種策略，因此對(duì)應(yīng)的選擇培養(yǎng)基為G418終濃度為800μg/ml的10%FBSDMEM培養(yǎng)基、MTX終濃度為50nM的10%FBSDMEM培養(yǎng)基以及G418和MTX終濃度分別為800μg/ml和50nM的10%FBSDMEM培養(yǎng)基。消化后的CHO細(xì)胞分別用這三種培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)15d，獲得相應(yīng)的細(xì)胞株。然后我們比較了這三種細(xì)胞株表達(dá)目的蛋白HA-T4的強(qiáng)弱，將消化后的細(xì)胞株細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用相應(yīng)的選擇培養(yǎng)基稀釋成相同濃度(IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml)的細(xì)胞懸液，等量的細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(lml/孔)，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)48hr后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。并將細(xì)胞用PBS2_清洗3次后，每孔加入200μLPR0-PREP蛋白提取溶液(賽百盛，北京，中國(guó))。并按照該產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作，獲得細(xì)胞裂解液。用WesternBlot(WB)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中的HA-T4含量。具體的過(guò)程如下將15μL細(xì)胞培養(yǎng)上清或細(xì)胞裂解液和5μLNuPAGELDSSampleBuffer(4X)(Invitrogen,美國(guó))混勻后，于70°C水浴中溫育5min,冷卻至室溫,獲得處理好的樣品。然后，將處理好的樣品上樣于預(yù)制的12%的NuPAGENovexBis-TrisGels(Invitrogen,美國(guó))中，于135V電壓下電泳Ihr后,取出凝膠切掉多余部分。利用TE77Semi_drytransferunit(AmershamBiosciences,美國(guó))，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū),將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(RPN303D，GEHealthcare)上。然后，將轉(zhuǎn)移蛋白的硝酸纖維素膜放入含5%(w/v)脫脂奶的TBST(含0.1%Tween20的TBS)(封閉液)中，于室溫溫育lhr，接著用封閉液1:200稀釋鼠源HA單抗(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))配成一抗工作液，將膜放入一抗工作液中，于37°C溫育2hr。把膜從一抗工作液中取出，用TBST清洗3次，用封閉液1:500稀釋堿磷酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG單抗(中杉金橋，北京，中國(guó))配成二抗工作液，將膜放入二抗工作液中，室溫溫育Ihr后，把膜從二抗工作液中取出，用TBST清洗3次后，將膜放入顯色液(CB203790，Calbiochem，德國(guó))中顯色15min，蒸餾水終止顯色過(guò)程。避光干燥，待膜完全干燥后，掃描獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)的具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖13，圖13的結(jié)果顯示泳道1、2和3中HA-T4的含量明顯多于泳道4、5和6，這表明表達(dá)的HA-T4融合蛋白主要以分泌的形式存在于細(xì)胞培養(yǎng)上清中。同時(shí)，泳道1、2和3間以及泳道4、5和6間未見(jiàn)明顯的HA-T4蛋白含量差異，這表明3種篩選策略得到的細(xì)胞株表達(dá)目的蛋白的未見(jiàn)明顯差異?？紤]到提高M(jìn)TX的濃度可能會(huì)導(dǎo)致HA-T4表達(dá)基因的擴(kuò)增，我們對(duì)三種策略獲得的細(xì)胞株采用逐步提高培養(yǎng)基中MTX的濃度至500nM，利用上面相同的策略評(píng)價(jià)MTX進(jìn)一步加壓后三種細(xì)胞的HA-T4蛋白表達(dá)強(qiáng)弱，即將消化后的細(xì)胞株細(xì)胞計(jì)數(shù)后，用MTX濃度為500nM的選擇培養(yǎng)基稀釋成相同濃度(IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml)的細(xì)胞懸液，等量的細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(lml/孔)，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)48hr后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。用WesternBlot(WB)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清HA-T4含量。具體過(guò)程同上。WB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示。從圖14的結(jié)果可知，泳道I比泳道2和3中HA-T4的蛋白含量均要高，這表明先用G418篩選，再用MTX篩選能夠獲得更高的目的基因蛋白表達(dá)量。實(shí)施例7E1、E2、E1-T4和E2-T4在CHO細(xì)胞中的表達(dá)1、E1和E2在CHO細(xì)胞中的表達(dá)為獲得El和E2的高表達(dá)CHO細(xì)胞株，我們首先將實(shí)施例4中構(gòu)建好的pAAV2neo-dhfr-El和pAAV2neo-dhfr_E2質(zhì)粒利用Iipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,美國(guó))轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程參考Lipofectamine2000(Invitrogen,美國(guó))說(shuō)明書(shū)。具體為，轉(zhuǎn)染前一天將CHO細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(50000個(gè)細(xì)胞/孔)，第二天待細(xì)胞融合度達(dá)到8090%時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染過(guò)程。以每孔為例，示意轉(zhuǎn)染過(guò)程，O.8μgDNA加入50μLOPT1-MEM(Invitrogen，美國(guó))培養(yǎng)液，2μLlipofectamine2000加入50μLOPT1-MEM培養(yǎng)液，分別混勻，于室溫放置5min。然后將兩種液體混勻，于室溫放置20min后，加入細(xì)胞中，并前后搖晃24孔細(xì)胞培養(yǎng)板使液體混勻，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6hr后，棄掉每孔中的培養(yǎng)液，重新加入新的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(800μL/孔)，然后將細(xì)胞繼續(xù)置于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第二天，消化細(xì)胞，用含800μg/ml的G418選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，15d后獲得穩(wěn)定表達(dá)El和E2的細(xì)胞株。了提高細(xì)胞株El和E2的表達(dá)量，我們采用逐步加壓的方法，將選擇培養(yǎng)基中MTX的濃度提高至500nM。然后我們比較了500nM的MTX選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)前后，細(xì)胞株El和E2表達(dá)量的高低。將G418篩選后獲得的細(xì)胞株以及先G418后MTX篩選獲得的細(xì)胞株分別消化并計(jì)數(shù)，然后用G418濃度為800μg/ml或MTX濃度為500nM的選擇培養(yǎng)基稀釋成相同濃度(IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml)的細(xì)胞懸液，等量的細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(lml/孔)，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)48hr后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。用WesternBlot(WB)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清El和E2含量。具體過(guò)程如下將15μL細(xì)胞培養(yǎng)上清和5μLNuPAGELDSSampleBuffer(4X)(Invitrogen，美國(guó))混勻后，于70°C水浴中溫育5min，冷卻至室溫，獲得處理好的樣品。然后，將處理好的樣品上樣于預(yù)制的12%的NuPAGENovexBis-TrisGels(Invitrogen,美國(guó))中，于135V電壓下電泳Ihr后，取出凝膠切掉多余部分。利用TE77Semi_drytransferunit(AmershamBiosciences，美國(guó))，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(RPN303D，GEHealthcare)上。然后，將轉(zhuǎn)移蛋白的硝酸纖維素膜放入含5%(w/v)脫脂奶的TBST(含0.1%Tween20的TBS)(封閉液)中，于室溫溫育Ihr，接著用封閉液1:200稀釋鼠源El或E2單抗(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))配成一抗工作液，將膜放入一抗工作液中，于37°C溫育2hr。把膜從一抗工作液中取出，用TBST清洗3次，用封閉液1:500稀釋堿磷酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG單抗(中杉金橋，北京，中國(guó))配成二抗工作液，將膜放入二抗工作液中，室溫溫育Ihr后，把膜從二抗工作液中取出，用TBST清洗3次后，將膜放入顯色液(CB203790，Calbiochem，德國(guó))中顯色15min，蒸餾水終止顯色過(guò)程。避光干燥，待膜完全干燥后，掃描獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。WB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖15所示。圖15A表示的是El的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，圖15B表示的是E2的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。從圖15A和B的結(jié)果可知，相比于用G418單獨(dú)篩選，先用G418篩選再用MTX篩選能夠獲得更高的目的基因蛋白表達(dá)量。2、E1_T4和E2-T4在CHO細(xì)胞中的表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)一步，為獲得E1-T4和E2-T4的高表達(dá)CHO細(xì)胞株，我們首先將實(shí)施例4中構(gòu)建好的pAAV2neo-dhfr-El_T4和pAAV2neo-dhfr-E2_T4質(zhì)粒利用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen,美國(guó))轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染過(guò)程參考Lipofectamine2000(Invitrogen,美國(guó))說(shuō)明書(shū)。具體為，轉(zhuǎn)染前一天將CHO細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(50000個(gè)細(xì)胞/孔)，第二天待細(xì)胞融合度達(dá)到8090%時(shí)，開(kāi)始轉(zhuǎn)染過(guò)程。以每孔為例，示意轉(zhuǎn)染過(guò)程，O.8μgDNA加入50yLOPT1-MEM(Invitrogen，美國(guó))培養(yǎng)液，2μLIipofectamine2000加入50μLOPT1-MEM培養(yǎng)液，分別混勻，于室溫放置5min。然后將兩種液體混勻，于室溫放置20min后，加入細(xì)胞中，并前后搖晃24孔細(xì)胞培養(yǎng)板使液體混勻，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染6hr后，棄掉每孔中的培養(yǎng)液，重新加入新的含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液(800μL/孔)，然后將細(xì)胞繼續(xù)置于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染后第二天，消化細(xì)胞，用含800μg/ml的G418選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，15d后獲得穩(wěn)定表達(dá)El和E2的細(xì)胞株。為了提高細(xì)胞株El和E2的表達(dá)量，我們采用逐步加壓的方法，將選擇培養(yǎng)基中MTX的濃度提高至500nM。然后我們比較了500nM的MTX選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)前后，細(xì)胞株El和E2表達(dá)量的高低。將G418篩選后獲得的細(xì)胞株以及先G418后MTX篩選獲得的細(xì)胞株分別消化并計(jì)數(shù)，然后用G418濃度為800μg/ml或MTX濃度為500nM的選擇培養(yǎng)基稀釋成相同濃度(IxlO5個(gè)細(xì)胞/ml)的細(xì)胞懸液，等量的細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(lml/孔)，于37°C的5%CO2孵箱中培養(yǎng)48hr后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。用WesternBlot(WB)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清El和E2含量。具體過(guò)程如下將15μL細(xì)胞培養(yǎng)上清和5μLNuPAGELDSSampleBuffer(4X)(Invitrogen，美國(guó))混勻后，于70°C水浴中溫育5min，冷卻至室溫，獲得處理好的樣品。然后，將處理好的樣品上樣于預(yù)制的12%的NuPAGENovexBis-TrisGels(Invitrogen,美國(guó))中，于135V電壓下電泳Ihr后,取出凝膠切掉多余部分。利用TE77Semi_drytransferunit(AmershamBiosciences，美國(guó))，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，將凝膠中蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(RPN303D，GEHealthcare)上。然后,將轉(zhuǎn)移蛋白的硝酸纖維素膜放入含5%(w/v)脫脂奶的TBST(含0.1%Tween20的TBS)(封閉液)中，于室溫溫育Ihr，接著用封閉液1:200稀釋鼠源El或E2單抗(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所譚文杰研究員惠贈(zèng))配成一抗工作液，將膜放入一抗工作液中，于37°C溫育2hr。把膜從一抗工作液中取出，用TBST清洗3次，用封閉液1:500稀釋堿磷酶標(biāo)記的馬抗鼠IgG單抗(中杉金橋，北京，中國(guó))配成二抗工作液，將膜放入二抗工作液中，室溫溫育Ihr后，把膜從二抗工作液中取出，用TBST清洗3次后，將膜放入顯色液(CB203790，Calbiochem，德國(guó))中顯色15min，蒸餾水終止顯色過(guò)程。避光干燥，待膜完全干燥后，掃描獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果。WB的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖16所示。圖16A表示的是E1-T4的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果，圖16B表示的是E2-T4的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。從圖16A和B的結(jié)果可知，相比于用G418單獨(dú)篩選，先用G418篩選再用MTX篩選能夠獲得更高的目的基因蛋白表達(dá)量。同時(shí)，圖16的結(jié)果還顯示在細(xì)胞培養(yǎng)上清和細(xì)胞裂解液中表達(dá)的E1-T4和E2-T4均已三種形式存在，即單體、三聚體和高聚體,而且三聚體和高聚體均較少,這再次表明雖然T4噬菌體Fibritin的三聚化結(jié)構(gòu)域有助于三聚體的形成但形成效率較低。名詞及縮寫(xiě)詞解釋1、AAV:adeno_associatedvirus,腺相關(guān)病毒。2>ITRinvertedterminalrepeat,倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)。3、AAV2病毒2型AAV病毒(adeno-associatedvirusserotype2)。4、pAAV2neo質(zhì)粒是一種攜帶了AAV2病毒ITR的質(zhì)粒DNA。所述的AAV載體質(zhì)粒一般由AAV2ITR、啟動(dòng)子、目的基因或阻斷序列、ployA、AAV2ITR以及E.coli質(zhì)粒骨架組成。質(zhì)粒骨架上攜帶了neo基因的表達(dá)單位。5、Dl和D2AAV2病毒ITR中的部分序列。6、CMVpromoter:人巨細(xì)胞病毒的啟動(dòng)子。7、PGKpromoter:人甘油酸磷酸激酶啟動(dòng)子。8,BGHpolyA:牛生長(zhǎng)激素基因的加尾信號(hào)序列。9、Neo:氨基糖轉(zhuǎn)移酶基因。10、dhfr:二氫葉酸還原酶基因。IUampR:氨芐青霉素抗性基因。12、Fluc:螢火蟲(chóng)螢光素酶基因，為常用報(bào)告基因。13、SV401atepolyASV40病毒晚期蛋白加尾信號(hào)。序列表<110)北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司〈120〉攜帶雙篩選基因的真核表達(dá)載體構(gòu)建及其應(yīng)用〈160〉21〈210〉I〈211〉23(212)DNA〈213〉人工序列(220)<223)Pl<400)ItcgaggtgactgtcattacgCgt23(210)2〈211〉23〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223)P2<400)2tcgaacgcgtaatgacagtcacc23<210)3〈211〉24〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉(223)P3〈400〉3權(quán)利要求1.一種攜帶dhfr和neo基因的真核表達(dá)載體pAAV2neo_dhfr,該表達(dá)載體的技術(shù)特征主要由AAV2的ITR、neo基因表達(dá)框、dhfr基因表達(dá)框和外源基因表達(dá)框組成。2.如權(quán)利要求1所述，使用時(shí)將外源基因插入到外源基因表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)之間，獲得外源基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)細(xì)胞，多種策略篩選獲得外源基因的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株。3.如權(quán)利要求1所述，該載體包含兩種篩選基因，適用于多種表達(dá)細(xì)胞并縮短穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的篩選過(guò)程。4.如權(quán)利要求1所述，該載體攜帶AAV2的ITR序列，因此有利于外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得。5.如權(quán)利要求1所述,本載體用于多種外源基因的高效率的真核細(xì)胞表達(dá)。6.如權(quán)利要求1所述，外源基因可以是蛋白編碼基因、shRNA、siRNA、miRNA等多種基因。7.如權(quán)利要求1所述，該載體可應(yīng)用于以HSVl為輔助病毒的rAAV載體包裝系統(tǒng)。全文摘要本發(fā)明具體涉及一種攜帶dhfr和neo基因的真核表達(dá)載體pAAV2neo-dhfr，該表達(dá)載體主要由AAV2的ITR、neo基因表達(dá)框、dhfr基因表達(dá)框和外源基因表達(dá)框組成，其中外源基因表達(dá)框中含有多克隆位點(diǎn)MCS，用于表達(dá)外源基因的插入。使用時(shí)將外源基因插入其表達(dá)框的多克隆位點(diǎn)之間，獲得外源基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染表達(dá)細(xì)胞，多種策略篩選獲得外源基因的穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株。由于該載體攜帶AAV2的ITR序列，因此有利于外源基因穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株的獲得。同時(shí)，該載體包含兩種篩選基因，適用于多種表達(dá)細(xì)胞并縮短穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的篩選過(guò)程。本載體可高效地真核表達(dá)多種外源基因，為真核蛋白的表達(dá)提供了新的選擇。文檔編號(hào)C12N15/79GK103014055SQ201110283158公開(kāi)日2013年4月3日申請(qǐng)日期2011年9月22日優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日發(fā)明者董小巖,田文洪,吳小兵,董哲岳申請(qǐng)人:北京五加和分子醫(yī)學(xué)研究所有限公司