專利名稱：金黃色葡萄球菌免疫捕捉pcr的檢測試劑盒和試劑盒使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種金黃色葡萄球菌的基因檢測試劑盒，屬于食源性致病菌的檢測領(lǐng)域，專一針對金黃色葡萄球菌(steZ^i^ococcM的檢測。適用于食品中金黃色葡萄球菌的快速檢測。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌、Staphyloccocus aureus, SA)是人類的一種重要病原菌，隸屬于葡萄球菌屬，可引起多種嚴(yán)重感染。有“嗜肉菌"的別稱。典型的金黃色葡萄球菌為球型，直徑0. 8 μ m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽胞、鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性。金黃色葡萄球菌營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37° C，最適生長pH 7.4，干燥環(huán)境下可存活數(shù)周。平板上菌落厚、有光澤、圓形凸起，直徑l_2mm。血平板菌落周圍形成透明的溶血環(huán)。金黃色葡萄球菌有高度的耐鹽性，可在10_15%NaCl肉湯中生長?？煞纸馄咸烟?、麥芽糖、乳糖、蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。甲基紅反應(yīng)陽性，VP反應(yīng)弱陽性。許多菌株可分解精氨酸，水解尿素，還原硝酸鹽，液化明膠。金黃色葡萄球菌具有較強(qiáng)的抵抗力，對磺胺類藥物敏感性低，但對青霉素、紅霉素等高度敏感。對堿性染料敏感，十萬分之一的龍膽紫液即可抑制其生長。食源性致病菌是影響食品安全的主要原因之一，檢測食源性致病菌是食源性疾病預(yù)防與控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的檢測方法如分離培養(yǎng)、生化鑒定等5-7d的時間，而且存在特異性不高、靈敏度低、操作煩瑣耗時，不能實現(xiàn)及時有效的監(jiān)測。因此，發(fā)展新的快速檢測與鑒定食源性致病菌的方法為及時有效地控制和預(yù)防致病菌傳播所必需。近年來， 隨著PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外已經(jīng)將這一技術(shù)引入食源性致病菌檢測領(lǐng)域。發(fā)展一種將病原富集和基因水平檢測有效結(jié)合的方法，是金黃色葡萄球菌檢測急需解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR 檢測試劑盒。以克服現(xiàn)有的食源性致病菌檢測方法靈敏性低、特異性差、費(fèi)時不穩(wěn)定的不足，將病原富集和基因水平檢測有效結(jié)合的方法，用免疫學(xué)方法先將樣品中的病原富集，然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以極大的提高檢測靈敏度，同時大大提高了檢測的效率。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒，其主要特點是包括有10X PCR buffer 5uL，dNTPs 2 .5mmo 1/L 2uL, Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL,正向弓 | 物 IOp mo 1/ L 2uL，弓丨物 5 ‘ -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 ‘；反向引物 IOp mo 1/L 2uL，弓丨物 5 ‘ -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ‘；雙蒸水99% 100% ；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測PCR管；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陽性對照PCR管(滅活的金黃色葡萄球菌菌液)；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陰性對照PCR管(滅菌的PBS)；陽性對照1管；陰性對照1管。一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒的使用方法，其主要特點是，所述使用方法的步驟為
(1)加樣品孵育3小時，抗體會特異性捕捉和富集樣品中的金黃色葡萄球菌病菌；
(2)PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增條件是99°G高溫裂解細(xì)菌lOmin，釋放DNA作為擴(kuò)增模板；再加入 IOX PCR buffer 5uL, dNTPs 2 . 5mmo 1/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L O . 25uL, 正向引物 IOp mo 1/L 2uL，引物 5' -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 ‘；反向引物 IOp mo 1/ L 2uL，引物 5 ‘ -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ‘；雙蒸水 99% 100% ；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測PCR管；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陽性對照PCR管(滅活的金黃色葡萄球菌菌液)；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陰性對照PCR管(滅菌的 PBS) ;PCR 擴(kuò)增條件94。C 2m in ； 94 oC Imin，61 0C 30 s , 72 0C lmin30s，35 個循環(huán)；72 °C 3 m i n30s，最后 4°C保持。(3) 1-1. 5%瓊脂糖電泳檢測目標(biāo)條帶并成像分析；
(4)對條帶進(jìn)行分析得出結(jié)論；若有279bp擴(kuò)增條帶，則判斷為金黃色葡萄球菌。所述的金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒的使用方法，所述的包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測PCR管的具體步驟為
(a)用包被緩沖液按照1 :1000-1500稀釋金黃色葡萄球菌多克隆抗體，抗體濃度為 1. 0-1. :3ug/ml，將稀釋好的抗體按照每管50 μ L加入PCR管室溫4小時或4°C過夜包被抗體；
(b)包被緩沖液配方為碳酸鈉1.59g，碳酸氫鈉2. 93 g，疊氮化鈉0.2 g，溶于 1000ml PBST緩沖液中，調(diào)pH值到9. 6 ；配制PBST 氯化鈉8. 0 g，無水磷酸氫二鈉1. 15 g, 無水磷酸二氫鉀0. 2 g，氯化鉀0. 2 g，吐溫-20 0. 5毫升，加雙蒸水到1000ml，調(diào)pH值到 7. 4。所述的金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒的使用方法，所述的加樣品孵育 3小時，抗體會特異性捕捉和富集樣品中的金黃色葡萄球菌的具體步驟為
a)樣品制備方法為按國標(biāo)GB/T4789.10-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗——金黃色葡萄球菌檢驗法》取25g樣品加入225ml磷酸鹽緩沖液，作為食品勻漿，然后對勻漿液人工污染不同濃度的金黃色葡萄球菌，人工污染的勻漿液中金黃色葡萄球菌的濃度依次為 107-10°cfu/ml ；
b)磷酸鹽緩沖液配方為磷酸二氫鉀34g，蒸餾水500ml，PH7. 2，作為貯存液存于 4°C，每次用時取1. 25ml蒸餾水稀釋至1000ml，121°C高壓滅菌15min。一種金黃色葡萄球菌快速免疫捕捉PCR檢測試劑盒模板DNA快速獲取方法，其主要特征步驟為
取檢測樣品50ul置于已經(jīng)包被好金黃色葡萄球菌特異性抗體的PCR管中，37 放置3h 或4°C過夜，37°C孵育3h，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次2Min，扣干殘液，加入33. 75ul雙蒸水，將處理液于PCR儀上以99°C裂解lOmin，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再經(jīng)5000r/min離心aiiin后，其上清液即為可用于PCR擴(kuò)增的 DNA。使用該試劑盒對參試細(xì)菌進(jìn)行免疫PCR擴(kuò)增，金黃色葡萄球菌產(chǎn)生分子量為279bp的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。金黃色葡萄球菌(Staphylococcus, aureus, SA)免疫捕捉PCR檢測試劑盒，屬于食源性致病菌檢測領(lǐng)域。使用本發(fā)明試劑盒對10個參試菌株進(jìn)行檢測，金黃色葡萄球菌得到 279bp特異性目標(biāo)條帶，其余菌株無產(chǎn)物；該試劑盒集病原濃縮、特異性抗體識別、PCR擴(kuò)增為一體，是一種靈敏度極高、檢測速度快、結(jié)果準(zhǔn)確、使用方便的試劑盒，尤其適用于質(zhì)撿部門和進(jìn)出口檢疫部門，對食品樣品進(jìn)行快速金黃色葡萄球菌的鑒定。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明金黃色葡萄球菌的檢測試劑盒，涉及一種檢測危險性食物病原菌的分子技術(shù)，尤其是能快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測病原菌在數(shù)小時內(nèi)就可以完成檢測。本發(fā)明提供了一種依賴PCR的分子檢測試劑盒，克服現(xiàn)有的食源性致病菌檢測方法靈敏性低、特異性差、費(fèi)時不穩(wěn)定的不足。該試劑盒能快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測到病原菌， 并直接可從食品中檢測病原菌。大大簡化了檢測程序，提高了我國口岸的檢疫水平，同時為食品致病菌大量快速檢測提供了依據(jù)。通過對金黃色葡萄的特異性檢測，引物nucl和rmC2和優(yōu)化的PCR條件對目標(biāo)菌株擴(kuò)增得到了一段長279bp的PCR產(chǎn)物，可以特異的檢測目標(biāo)菌。但是對于6種類非目標(biāo)菌，均無擴(kuò)增產(chǎn)物。通過靈敏度的檢測，對金黃色葡萄純菌液模擬帶菌樣品勻漿的直接PCR和免疫捕捉PCR檢測比較，發(fā)現(xiàn)直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增的最低檢出限為3. 25X IO4Cfu /ml，而免疫捕捉 PCR的最低檢出量是3. 25X IO2Cfu /ml。對于純菌液，免疫捕捉PCR靈敏度是直接PCR的 100 倍。


圖1金黃色葡萄球菌快速免疫捕捉檢測試劑盒原理圖； 圖2試劑盒使用流程圖3試劑盒特異性驗證結(jié)果；
其中M:100bp DNA ladder ； 1_11號泳道金黃色葡萄球菌ATCC 27660，金黃色葡萄球菌ATCC四213，單核細(xì)胞增生性李斯特菌ATCC 43251，單核細(xì)胞增生性李斯特菌ATCC 7644，坂崎腸桿菌ATCC四004，坂崎腸桿菌ATCC四554，腸炎沙門氏菌ATCC 13076，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC 23715，副溶血性弧菌ATCC 17802，蠟樣芽胞桿菌ATCC 11778，陰性對照
圖4梯度稀釋純菌液直接PCR結(jié)果；
其中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 35X 108-2· 35X IO1CFUAiI, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNAladder。圖5梯度稀釋純菌液免疫捕捉PCR結(jié)果；
其中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 35X 108-2· 35X IO1CFUAiI, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNAladder。圖6梯度稀釋模擬帶菌雪糕樣品PCR結(jié)果； Al模擬帶菌雪糕樣品直接PCR結(jié)果；
Α2.模擬帶菌雪糕樣品免疫捕捉PCR結(jié)果；其中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 35X 107_2· 35X IO1CFUAiI, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNAladder。圖7梯度稀釋模擬帶菌酸奶樣品免疫捕捉PCR結(jié)果； Bi.模擬帶菌酸奶樣品直接PCR結(jié)果；
Β2.模擬帶菌酸奶樣品免疫捕捉PCR結(jié)果；
其中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 35X 107_2· 35X IO1CFUAiI, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNAladder。圖8梯度稀釋模擬帶菌果汁樣品免疫捕捉PCR結(jié)果； Cl.模擬帶菌果汁樣品直接PCR結(jié)果；
C2.模擬帶菌果汁樣品免疫捕捉PCR結(jié)果；
其中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 35X 107_2· 35X IO1CFUAiI, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNAladder。圖9梯度稀釋模擬帶菌牛奶樣品免疫捕捉PCR結(jié)果； Dl.模擬帶菌牛奶樣品直接PCR結(jié)果；
D2.模擬帶菌牛奶樣品免疫捕捉PCR結(jié)果；
其中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 35X 107_2· 35X IO1CFUAiI, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNAladder。圖10梯度稀釋模擬帶菌香腸樣品免疫捕捉PCR結(jié)果； El.模擬帶菌香腸樣品直接PCR結(jié)果；
Ε2.模擬帶菌香腸樣品免疫捕捉PCR結(jié)果；
其中1-7號泳道細(xì)菌濃度為2. 35X 107_2· 35X IO1CFUAiI, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNAladder。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實施例1 一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒，包括有
IOX PCR buffer 5uL, dNTPs 2 . 5mmo 1/L 2uL, Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL, 正向引物 IOp mo 1/L 2uL，引物 5' -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 ‘；反向引物 IOp mo 1/ L 2uL，引物 5 ‘ -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ‘；雙蒸水 99% 100% ；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測PCR管3個；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陽性對照PCR管 (滅活的金黃色葡萄球菌菌液)管3個；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陰性對照PCR 管(滅菌的PBS)管3個；陽性對照1管；陰性對照1管。實施例2 —種金黃色葡萄球菌直接PCR檢測試劑盒的使用方法，其主要特點是步驟為
待標(biāo)準(zhǔn)菌培養(yǎng)1 后，取此菌液Iml依次10倍稀釋到無菌PBS中，并分別標(biāo)記為10人 10_2、10_3、10_4、10_5、10_6、10_7、，然后取 10_5、10_6、1()-7 梯度純菌液各 IOOul 于培養(yǎng)皿中進(jìn)行平板菌落計數(shù)。濃度為:2. 35X 108-2· 35 X IOiCFUAIL取梯度菌液勻漿5ul于PCR管中，加入37. 25ul去離子水，在PCR儀上99 裂解IOmin,然后迅速置于冰上冷卻5Min，離心后加入10XPCR buffer 5ul、2. 5uMdNTPs 4 ul、 5U/ulTaqDNA聚合酶0. 25ul、2ul 上游引物 5' -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 ‘ 8-10 pmol/ μ L ；2ul 引物 5 ' -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ‘ 8-10 pmol/ μ L ；然后再進(jìn)行 PCR 擴(kuò)
+曰O實施結(jié)果如圖4所示，圖中1-5號泳道均可見特異性目標(biāo)條帶，片段大小約為 279bp，且亮度依次減弱；6-8號泳道未見特異性目標(biāo)條帶。試驗結(jié)果表明，在純菌液中直接 PCR的檢測靈敏度為104cfu/ml。實施例3 免疫捕捉PCR特異性的檢測，見圖5，
供試菌株金黃色葡萄球菌ATCC 27660，金黃色葡萄球菌ATCC四213，單核細(xì)胞增生性李斯特菌ATCC 43251，單核細(xì)胞增生性李斯特菌ATCC 7644，坂崎腸桿菌ATCC四004，坂崎腸桿菌ATCC 295M，腸炎沙門氏菌ATCC 13076，小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌ATCC 23715，副溶血性弧菌ATCC 17802，蠟樣芽胞桿菌ATCC 11778，陰性對照。檢測結(jié)果表明，以上十株供試菌，只有金黃色葡萄球菌檢出目標(biāo)條帶，其它均未檢出目標(biāo)條帶，說明試劑盒有比較好的專一性。實施例4 一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒的使用方法，其主要特點是步驟為
(1)病原富集取檢測樣品50ul置于已經(jīng)包被好金黃色葡萄球菌特異性抗體的PCR管中，(37 放置3h或4 過夜)37 孵育3h，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次2Min，扣干殘液，加入33. 75ul雙蒸水，將處理液于PCR儀上以99 · V 裂解IOmin然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再經(jīng)5000r/min離心^iin后，其上清液即為為可用于PCR擴(kuò)增的DNA。其擴(kuò)增條件是94。C2m in ； 94 0C Imin，61 0C 30 s , 72 0C lmin30s，35 個循環(huán)；72。C 3 m i n30s，最后4°C保持。結(jié)果分析灌制1. 5%瓊脂糖凝膠，取IOul PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，在凝膠成像系統(tǒng)下進(jìn)行拍照并分析。實施結(jié)果如圖6至圖10中Al-Bl-Cl-Dl-El所示，圖中1_7號泳道均可見特異性目標(biāo)條帶，片段大小約為279bp，且亮度依次減弱；8-9號泳道未見特異性目標(biāo)條帶。試驗結(jié)果表明，在純菌液中直接PCR的檢測靈敏度為102CfU/ml。實施例5 梯度稀釋模擬帶菌食品樣品直接PCR結(jié)果；
按國標(biāo)GB/T4789. 10-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗——金黃色葡萄球菌檢驗法》取25g樣品加入225ml磷酸鹽緩沖液，作為食品勻漿，然后對勻漿液人工污染 2. 35X 108-2. 35 X IO1CFUAiI的梯度金黃色葡萄球菌純菌液，使人工污染的勻漿液中金黃色葡萄球菌的濃度依次為2. 35X 107-2. 35X 10°cfu/ml。取模擬帶菌好的梯度食品勻漿5ul于PCR管中，加入37. 25ul去離子水，在PCR儀上99 裂解lOmin，然后迅速置于冰上冷卻5Min，離心后力口入 10XPCR buffer 5ul、2. 5uMdNTPs 4 ul、5U/ulTaqDNA 聚合酶 0.25ul、 2ul 上游弓丨物 5 ‘ -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 ‘ 8-10 pmol/μ L ；2ul 弓丨物 5 ‘ -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ‘ 8-10 pmol/μ L ；然后再進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。實施結(jié)果如圖6至圖10中Al-Bl-Cl-Dl-El所示，食品模擬帶菌的直接PCR檢測靈敏度可達(dá)IO5一 106cfu/ml
實施例6 梯度稀釋模擬帶菌食品樣品免疫捕捉PCR結(jié)果；按國標(biāo)GB/T4789. 10-2008 《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗——金黃色葡萄球菌檢驗法》取25g樣品加入225ml磷酸鹽緩沖液，作為食品勻漿，然后對勻漿液人工污染不同濃度的金黃色葡萄球菌，人工污染的勻漿液中金黃色葡萄球菌的濃度依次為107-10°cfu/ml。取檢測樣品50ul置于已經(jīng)包被好金黃色葡萄球菌特異性抗體的PCR管中，(37°C 放置池或4 過夜)37 孵育3h，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管 3次，每次2Min，扣干殘液，加入33. 75ul雙蒸水，將處理液于PCR儀上以99 裂解IOmin 然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再經(jīng)5000r/min離心aiiin后，其上清液即為為可用于PCR 擴(kuò)增的 DNA。94。C 2m in ； 94 0C Imin，61 0C 30 s，72 0C lmin30s，35 個循環(huán)；72 oC 3 m i n30s，最后 4°C保持。實施結(jié)果如圖6至圖10中A2-B2-C2-D2-E2所示，食品模擬帶菌的免疫捕捉PCR 檢測靈敏度可達(dá)IO4一 103cfu/ml
本試劑盒不需提取樣本DNA，減少了提取DNA的繁瑣操作，方法敏感，可靠和快速，在本實驗中人工污染樣品沒有進(jìn)行增菌便進(jìn)行檢測，樣品靈敏度達(dá)104cfu/ml，有的樣品甚至達(dá)到進(jìn)行103CfU/ml其靈敏度是直接PCR的10-100倍。同時試驗表明，本試劑盒在實際的食品樣本檢測中具有較高的實用價值，能直接對食品樣品進(jìn)行檢測，具有較大的推廣應(yīng)用基石出。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒，其特征是包括有10X PCR buffer 5uL, dNTPs 2 . 5mmo 1/L 2uL, Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL，正向引物 IOp mo 1/L 2uL，引物 5' -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 ‘；反向引物 IOp mo 1/L 2uL，引物 5 ‘ -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ‘；雙蒸水99% 100% ；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陽性對照PCR管為滅活的金黃色葡萄球菌菌液1管；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陰性對照PCR管為滅菌的PBS陽性對照1管；陰性對照1管。
2.一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征是，所述使用方法的步驟為(1)加樣品孵育3小時，抗體會特異性捕捉和富集樣品中的金黃色葡萄球菌病菌；(2)PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增條件是99°G高溫裂解細(xì)菌lOmin，釋放DNA作為擴(kuò)增模板；再加入 IOX PCR buffer 5uL, dNTPs 2 . 5mmo 1/L 2uL，Taq DNA 聚合酶 5U /L 0 . 25uL, 正向引物 IOp mo 1/L 2uL，引物 5' -GCGATTGATGGTGATACGGTT-3 ‘；反向引物 IOp mo 1/ L 2uL，引物 5 ‘ -AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3 ‘；雙蒸水 99% 100% ；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測PCR管；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陽性對照PCR管為滅活的金黃色葡萄球菌菌液；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陰性對照PCR管為滅菌的 PBS ;PCR擴(kuò)增條件94。C 2m in ； 94 oC Imin，61 0C 30 s , 72 0C lmin30s，35 個循環(huán)；72 °C 3 m i n30s，最后 4°C保持；(3)1-1. 5%瓊脂糖電泳檢測目標(biāo)條帶并成像分析；(4)對條帶進(jìn)行分析得出結(jié)論；若有279bp擴(kuò)增條帶，則判斷為金黃色葡萄球菌。
3.如權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征是，所述的包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測PCR管的具體步驟為用包被緩沖液按照1 :1000-1500稀釋金黃色葡萄球菌多克隆抗體，抗體濃度為 1. 0-1. :3ug/ml，將稀釋好的抗體按照每管50 μ L加入PCR管室溫4小時或4°C過夜包被抗體；包被緩沖液配方為碳酸鈉1. 59g，碳酸氫鈉2. 93 g，疊氮化鈉0. 2 g，溶于1000ml PBST緩沖液中，調(diào)pH值到9. 6 ；配制PBST 氯化鈉8. 0 g，無水磷酸氫二鈉1. 15 g，無水磷酸二氫鉀0.2 g，氯化鉀0.2 g，吐溫-20 0.5毫升，加雙蒸水到1000ml，調(diào)pH值到7. 4。
4.如權(quán)利要求2所述的金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒的使用方法，其特征是，所述的加樣品孵育3小時，抗體會特異性捕捉和富集樣品中的金黃色葡萄球菌的具體步驟為a)樣品制備方法為按國標(biāo)GB/T4789.10-2008《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗——金黃色葡萄球菌檢驗法》取25g樣品加入225ml磷酸鹽緩沖液，作為食品勻漿，然后對勻漿液人工污染不同濃度的金黃色葡萄球菌，人工污染的勻漿液中金黃色葡萄球菌的濃度依次為 107-10°cfu/ml ；b)磷酸鹽緩沖液配方為磷酸二氫鉀34g，蒸餾水500ml，PH7. 2，作為貯存液存于 4°C，每次用時取1. 25ml蒸餾水稀釋至1000ml，121°C高壓滅菌15min。
5.一種金黃色葡萄球菌快速免疫捕捉PCR檢測試劑盒模板DNA快速獲取方法，其特征步驟為取檢測樣品50ul置于已經(jīng)包被好金黃色葡萄球菌特異性抗體的PCR管中，37 放置3h或4°C過夜，37°C孵育3h，用移液器小心吸去檢測樣品，然后再用PBST洗滌離心管3次，每次2Min，扣干殘液，加入33. 75ul雙蒸水，將處理液于PCR儀上以99°C裂解lOmin，然后迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻5min，再經(jīng)5000r/min離心aiiin后，其上清液即為可用于PCR擴(kuò)增的 DNA。
全文摘要
本發(fā)明是一種金黃色葡萄球菌的基因檢測試劑盒，屬于食源性致病菌的檢測領(lǐng)域，專一針對金黃色葡萄球菌(staphylococcus.aureus.SA)的檢測。一種金黃色葡萄球菌免疫捕捉PCR檢測試劑盒，其主要特點是包括有10×PCRbuffer5uL，dNTPs2.5mmol/L2uL，TaqDNA聚合酶5U/L0.25uL，正向引物10pmol/L2uL，引物5＇-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3＇；反向引物10pmol/L2uL，引物5＇-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3＇；雙蒸水99%～100%；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的檢測PCR管；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陽性對照PCR管(滅活的金黃色葡萄球菌菌液)；包被了金黃色葡萄球菌多克隆抗體的陰性對照PCR管(滅菌的PBS)；陽性對照1管；陰性對照1管。本發(fā)明的優(yōu)點是能快速、簡便、準(zhǔn)確的檢測病原菌。
文檔編號C12N15/10GK102304585SQ20111028377
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者劉箐, 夏俊芳 申請人:劉箐, 夏俊芳