專利名稱：狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于狂犬病疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽段抗原及其用途。
背景技術(shù)：
狂犬病是由狂犬病病毒(rabies virus, RV)引起的自然疫源性、高度致死性人獸共患傳染病，該病呈全球性分布。狂犬病病毒可以引起人和多種動物致死性中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染，狂犬病臨床表現(xiàn)主要為恐水、畏光、吞咽困難、狂躁等，病死率幾乎為100%。全世界每年因狂犬病死亡的人數(shù)大約55000人，是迄今為止病死率最高的急性傳染病。印度是狂犬病流行最嚴(yán)重的國家，中國的狂犬病例數(shù)僅次于印度，居世界第二位。狂犬病病毒屬于彈狀病毒科(rhabdoviridae)，狂犬病病毒屬(lyssa virus)，呈子彈狀?？袢〔《究赏ㄟ^破損的皮膚或黏膜侵入人體，經(jīng)神經(jīng)末梢上行進入人及所有溫血動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNQ而引發(fā)狂犬病?？袢〔《净蚪M核酸為不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，由11擬8或11932個核苷酸組成，相對分子量約4.6 X 106，3'到5'端依次排列著N、P、M、G、L基因，分別編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白核蛋白(nucleoprotein，NP)、磷酸化蛋白 (phosphoprotein，PP)、基質(zhì)蛋白(matrix protein, MP)、糖蛋白(glycoprotein, GP)禾口轉(zhuǎn)錄酶大蛋白(large protein,LP) 0完整的狂犬病病毒顆粒由核衣殼和包膜兩部分構(gòu)成，核衣殼由核蛋白、磷蛋白和轉(zhuǎn)錄酶大蛋白構(gòu)成，而包膜由糖蛋白和基質(zhì)蛋白構(gòu)成。近年來，隨著人民生活水平的提高，犬、貓作為寵物大量進入城市家庭，我國狂犬病發(fā)病率呈上升趨勢，死亡率居傳染病首位，至今尚無有效的治療方法，一旦被犬類咬傷后，迅速接種疫苗可快速刺激機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)。但由于現(xiàn)有疫苗的質(zhì)量、使用方法及人群個體差異等各種原因影響，并非所有人群免疫后均產(chǎn)生保護性抗體。因此，需要建立一種用于狂犬病毒抗體檢測方法，對免疫犬和免疫人群進行血清學(xué)檢測，評價疫苗的免疫效果。評價疫苗優(yōu)劣的方法是疫苗免疫機體后能否產(chǎn)生足夠的抗體，以及疫苗免疫后在免疫期內(nèi)能否抵抗致死性強毒的攻擊。當(dāng)前國際認(rèn)可檢測狂犬病抗體的方法有多種，如熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)、快速熒光灶抑制試驗(RFFIT)、小鼠病毒中和試驗(MNT)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)等。FAVN、RFFIT等方法檢測狂犬病抗體至少需要96h，MNT法檢測狂犬病抗體需要21d，這幾種方法都需要活病毒和培養(yǎng)細(xì)胞，操作繁瑣，對操作者的操作技能要求較高，存在生物安全和人為判讀誤差的問題。此外，熒光抗體質(zhì)量優(yōu)劣，如抗體的特異性、熒光素的標(biāo)記、操作人員對該方法的掌握程度都可以對熒光抗體病毒中和試驗造成很大的影響，甚至影響判讀結(jié)果。ELISA方法不需要特殊的實驗室設(shè)備和條件；操作簡單安全，不需要活病毒；快速，只需2 4h就可以檢測出疫苗接種后血清樣品中的狂犬病病毒抗體；不需要操作人員主觀判斷，通過酶標(biāo)板讀數(shù)，避免出現(xiàn)人為判讀誤差。臨床所采用的ELISA抗體檢測方法都是采用全病毒裂解抗原或全長G蛋白抗原進行包被的，存在假陰性率高、靈敏度低、特異性
差等問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原。本發(fā)明的目的還在于提供編碼上述狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原的基因。本發(fā)明的目的還在于提供含有狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原基因的原核表達載體。本發(fā)明的目的還在于提供含上述原核表達載體的基因工程菌。本發(fā)明的目的還在于提供狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原在制備用于評價狂犬疫苗免疫效果的試劑中的用途。一種狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原，所述抗原為如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 5 或 SEQ IDNO. 6 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。對所選擇狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原進行適當(dāng)?shù)男揎椚匀痪哂袡z測效果。例如對其中個別氨基酸進行保守替換、增加或缺失，個別氨基酸指少于10、9、8、7、6、5、4、3、2、1個氨基酸。保守氨基酸替換的實例例如Ala、Val、Leu和Ile間的替換；Ser和Thr間的替換； 酸性殘基Asp和Glu間的替換；Asn和Gln間的替換；和堿性殘基Lys和Arg間的替換；或者芳香族殘基Phe和Tyr間的替換。編碼狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原(a)或(b)的基因(a)由序列表中 SEQ ID NO. 1、SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 5 或 SEQ IDNO. 6 所示的
氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。含狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原基因的原核表達載體。所述原核表達載體為pBVILl、pGEX-4T-2或pET48a。含上述原核表達載體的基因工程菌。所述基因工程菌為大腸桿菌?？袢〔《緝?yōu)勢表位肽抗原在制備用于評價狂犬疫苗免疫效果的試劑中的用途。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明利用生物信息學(xué)軟件篩選優(yōu)勢表位抗原區(qū)段，通過 PCR擴增出優(yōu)勢表位抗原區(qū)段編碼基因，并在大腸桿菌中高效表達，獲得高純度抗原，經(jīng)間接ELISA實驗證明所獲得的抗原能夠檢測免疫人或犬血清中的保護性抗體。采用基因工程表達優(yōu)勢表位肽段抗原替代全病毒抗原提高檢測的特異性，組合應(yīng)用多種特異性抗原進行檢測，顯著提高檢測的敏感性。


圖1是狂犬病病毒G蛋白表位預(yù)測分析圖。圖2是狂犬病病毒N蛋白表位預(yù)測分析圖。圖3是狂犬病病毒8種表位肽段抗原純化后SDS-PAGE電泳圖；其中1為NP-I抗原，2為NP-2抗原，3為NP-3抗原，4為NP-4抗原，5為GP-1抗原，6為GP-2抗原，7為GP-3抗原，8為GP-4抗原，M為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實施例方式下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不應(yīng)構(gòu)成對本發(fā)明實施范圍的限定。實施例中未注明具體條件的實驗方法，參見《分子克隆實驗指南》(第三版)，科學(xué)出版社，2002，第 1217-1270頁。適宜的原核表達載體pBVILl、pEGX購買自Amersham Pharmacia公司、pET 系列原核表達載體購買自Novagen公司、pI^rxFus系列原核表達載體購買自hvitrogen公司。實施例1 狂犬病毒優(yōu)勢表位抗原區(qū)段的確定利用BIOSUN生物學(xué)分析軟件分別分析狂犬病毒G蛋白和N蛋白的表位分布情況， 首先輸入其氨基酸序列，然后尋找B細(xì)胞表位，所得表位分布圖如圖1和圖2所示。根據(jù)表位分布情況確定特異性優(yōu)勢表位抗原區(qū)段，分別為優(yōu)勢表位區(qū)段GP-I (l-200aa)，氨基酸序列為SEQ ID NO :1 ；優(yōu)勢表位區(qū)段GP-2(301-400aa)，氨基酸序列為SEQ ID NO :2 ；優(yōu)勢表位區(qū)段GP-3 (60-230aa)，氨基酸序列為SEQ ID NO 3 ；優(yōu)勢表位區(qū)段GP_4 (231-345aa)， 氨基酸序列為SEQ ID N0:4;優(yōu)勢表位區(qū)段NP-l(301-420aa)，氨基酸序列為SEQ ID N0:5 ；優(yōu)勢表位區(qū)段NP-2^)-180aa)，氨基酸序列為SEQ ID NO :6;優(yōu)勢表位區(qū)段 NP-3Q55-315aa)，氨基酸序列為SEQ ID NO 7 ；優(yōu)勢表位區(qū)段NP-4 (342_450aa)，氨基酸序列為 SEQ ID NO :8ο實施例2 狂犬病毒優(yōu)勢表位肽段抗原編碼基因的克隆1、引物設(shè)計根據(jù)G蛋白和N蛋白的全長核苷酸序列和8種優(yōu)勢表位肽段抗原的核苷酸序列分別設(shè)計并合成了上下游引物，所使用的限制性內(nèi)切酶分別為》io I.Xba I.BamH I或EcoR I。用于擴增G蛋白全長基因的引物為GF和GR，核苷酸序列分別如SEQ IDNO :9和SEQ ID NO 10 所示；用于擴增N蛋白全長基因的引物為NF和NR，核苷酸序列分別如SEQ IDNO :11和 SEQ ID NO 12 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段GP-I編碼基因的引物為GF-I和GR-200，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO 14 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段GP-2編碼基因的引物為GF-301和GR-400，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 15 和 SEQ ID NO 16 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段GP-3編碼基因的引物為GF-60和GR-230，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 17 和 SEQ ID NO 18 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段GP-4編碼基因的引物為GF-231和GR-345，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 19 和 SEQ ID NO 20 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段NP-I編碼基因的引物為NF-301和NR-420，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO :21 禾口 SEQ ID NO 22 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段ΝΡ-2編碼基因的引物為NF-20和NR-180，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 23 和 SEQ ID NO 24 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段NP-3編碼基因的引物為NF-255和NR-315，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 25 和 SEQ ID NO 26 所示；用于擴增優(yōu)勢表位區(qū)段NP-4編碼基因的引物為NF-342和NR-450，核苷酸序列分別如 SEQ ID NO 27 和 SEQ ID NO 28 所示。2、狂犬病病毒總RNA提取取狂犬病疫苗1支，加溶解液0. 3ml，于離心管中，加Trizol 0. 7ml混均，加入氯仿250 μ 1，室溫放置5分鐘，12000rpm離心4°C 15分鐘，取上清于另一離心管中，加入等體積異丙醇放置室溫10分鐘，離心12000rpm 4。C 10分鐘，棄上清，用75%乙醇洗一次，離心 12000rpm 4°C 10分鐘，晾干后加入50 μ 1 DEPC水溶解，_20°C保存。3、狂犬病病毒cDNA獲得反應(yīng)體系總體積為13 μ 1，其中 DEPC 7jC 10 μ 1、RNA 1 μ l、25mMol dNTP 1 μ 1、隨機引物 1 μ 1，65°C水浴 5 分鐘，冰浴 1 分鐘。加入 5XBuffer 4μ 1,0. IM DTT 1 μ 1、Rnasin 1 μ 1、逆轉(zhuǎn)錄酶1 μ 1，DEPC水20 μ 1，50 V水浴60分鐘，70 V水浴15分鐘，冰浴1分鐘。4、PCR擴增法獲得目的基因雙蒸水34μ IUOXBuffer 5 μ 1, DMSO 2. 5 μ l,25mMol dNTP 4μ1、弓| 物 GF 禾口 GR(或者引物NF和NR)各1 μ 1、cDNA 2 μ 1、Tag酶0. 5 μ 1混均后用以下條件進行95°C 預(yù)變性2分鐘，95°C 30 45秒、58°C 30 90秒、72°C 30 90秒，35個循環(huán)，72 °C 5分鐘，4°C保存。瓊脂糖電泳證明獲得了 G蛋白和N蛋白全長基因片段，長度分別為1575bp和 1353bp。以G蛋白和N蛋白全長基因為模板，加入相應(yīng)引物(GF-1和GR-200擴增GP-1， GF-301 和 GR-400 擴增 GP_2，GF-60 和 GR-230 擴增 GP_3，GF-231 和 GR-345 擴增 GP_4，NF-301 和 NR-420 擴增 NP-I，NF-20 和 NR-180 擴增 NP-2，NF-255 和 NR-315 擴增 NP-3，NF-342 和 NR-450擴增NP-4)擴增優(yōu)勢表位肽段抗原編碼基因，瓊脂糖電泳證明獲得了 8種優(yōu)勢表位肽段抗原的編碼基因，長度分別為 600bp (GP-I)、300bp (GP-2)、513bp (GP-3)、345bp (GP-4)、 360bp (NP-I) ,483bp (NP-2) U83bp (NP-3)和 327bp (NP_4)。測序由中美泰和生物技術(shù)有限公司完成，序列正確的克隆連接入經(jīng)相同酶切的pBVILl、pGEX-4T-2或pET48a，成功構(gòu)建原核表達載體。實施例3 狂犬病毒優(yōu)勢表位肽段抗原的表達和純化用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌菌株，熱誘導(dǎo)表達，收集菌體，將沉淀稱濕重， 用10倍體積的20mmol/L pH8. OTE緩沖液將沉淀懸起，加入溶菌酶(lmg/ml懸液)，在室溫下磁力攪拌10分鐘。在冰浴中超聲波破碎菌，每次超30秒鐘，間隔30秒鐘，共超10次。 8°C，1，2000rpm,離心20分鐘，棄上清，沉淀用lmol/LNaCl (用TE配制)洗一次，再用TE洗2 次，收集沉淀。沉淀用溶解液(25mM Tirs-HClU% β -巰基乙醇、8M脲，PH 7.8)將其溶解， 上Ni-kpharose Fast Flow柱，分別用3個柱體積的結(jié)合緩沖液QOmM Tirs-HCl.O. 1% β-巰基乙醇、6M脲，PH 7. 8)、4個柱體積的洗滌緩沖液QOmM Tirs-HCUO. 1% β -巰基乙醇、6Μ脲，PH 6. 0)洗滌柱體，用25mM咪唑(洗滌緩沖液配制)洗雜蛋白，用250mM咪唑 (洗滌緩沖液配制)洗脫目的蛋白。將收集的洗脫峰G-50凝膠過濾TE、 0. 1% SDS, PH8. 5)，收集第一峰。經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果表明8種優(yōu)勢表位肽段抗原在大腸桿菌中均獲得了表達，經(jīng)純化后獲得了純度較高的目的抗原(圖3)。
實施例4 狂犬病毒8種優(yōu)勢表位肽段抗原在狂犬疫苗免疫效果評價中的應(yīng)用分別以8種狂犬病毒優(yōu)勢表位肽段抗原包被酶聯(lián)板，以間接ELISA方法初步檢測了 74份狂犬病毒免疫犬血清樣本和20份未免疫犬血清樣本，檢測結(jié)果如表1和表2所示， 從表1和表2可以看出8種優(yōu)勢表位肽段抗原均能夠檢測出狂犬疫苗免疫犬血清中的抗體，其中GP-1、GP-2、NP-I和NP-2優(yōu)勢表位肽段抗原的檢測活性明顯高于其它4種，并且 GP-1、GP-2、NP-1和NP-2優(yōu)勢表位肽段抗原的檢測活性彼此之間存在互補性。因此，GP-1、 GP-2、NP-1和NP-2抗原有望用于狂犬疫苗免疫效果評價。表1 8種優(yōu)勢表位肽段抗原對狂犬疫苗免疫犬血清抗體的檢測(0D450nm)
權(quán)利要求
1.一種狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原，其特征在于，所述抗原為如下(a)或(b)所示的蛋白質(zhì)(a)由序列表中SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.編碼如權(quán)利要求1所述蛋白質(zhì)(a)或(b)的基因(a)由序列表中SEQ ID NO. USEQ ID NO. 2,SEQ ID NO. 5 或 SEQ ID NO. 6 所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有狂犬病病毒表位肽抗原活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
3.含權(quán)利要求2所述基因的原核表達載體。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的原核表達載體，其特征在于，所述原核表達載體為pBVILl、 PGEX-4T-2 或 pET-28a。
5.含權(quán)利要求3所述原核表達載體的基因工程菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌為大腸桿菌。
7.權(quán)利要求1所述狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽抗原在制備用于評價狂犬疫苗免疫效果的試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于狂犬病疫苗技術(shù)領(lǐng)域的狂犬病病毒優(yōu)勢表位肽段抗原及其用途。本發(fā)明利用生物信息學(xué)軟件篩選優(yōu)勢表位抗原區(qū)段，通過PCR擴增出優(yōu)勢表位抗原區(qū)段編碼基因，并在大腸桿菌中高效表達，獲得高純度抗原，經(jīng)間接ELISA實驗證明所獲得的抗原能夠檢測免疫人或犬血清中的保護性抗體。采用基因工程表達優(yōu)勢表位肽段抗原替代全病毒抗原提高檢測的特異性，組合應(yīng)用多種特異性抗原進行檢測，顯著提高檢測的敏感性。
文檔編號C12N15/47GK102329377SQ20111028460
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月22日
發(fā)明者何競, 修冰水, 馮曉燕, 宋曉國, 張賀秋, 朱翠俠, 楊錫琴, 王國華, 陳堃 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所