專利名稱：一種抑制蕓苔根腫菌的解淀粉芽胞桿菌及其活性物質(zhì)的分離與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株解淀粉芽胞桿菌，解淀粉芽胞桿菌的培養(yǎng)方法及從其分離對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的方法，活性物質(zhì)的用途，與微生物農(nóng)藥技術(shù)領(lǐng)域有關(guān)。
背景技術(shù)：
芽胞桿菌是自然界中廣泛存在的一種非致病性細(xì)菌，能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，其中大部分是多肽，主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌；有些還能抑制革蘭氏陰性菌、霉菌和酵母(劉靜等，枯草芽孢桿菌J A抗菌物特性的研究及抗菌肽的分離純化，微生物學(xué)報(bào)，2004， 44(4) :511-513) 0它們易于繁殖，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)，具有很大的開發(fā)利用價(jià)值。解淀粉芽胞桿菌能產(chǎn)生多種抑制植物病原真菌的抗菌物質(zhì)，因而在生物防治中起著重要的作用 (Chen XH et al. , Comparative analysis of the completegenome sequence of the plant growth-promoting bacterium Bacillusamyloliquefaciens FZB42,2007, Nat Biotechnol,25 :1007-1014)。這些抗菌物質(zhì)主要分為兩大類，一類是低分子量抗菌肽，包括環(huán)狀肽或環(huán)狀脂肽，也有些為線狀肽，另有少量為蛋白類抑菌物質(zhì)，這一類占解淀粉芽胞桿菌抑菌物質(zhì)的絕大部分；另一類主要包括聚酮類、氨基糖類以及脂肽類等的抗生素。 迄今為止國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)分離其發(fā)酵產(chǎn)物，得到了一些低分子量的抗菌物質(zhì)，并進(jìn)行了深入石if究(Arguelles-Arias A et al.，Bacillus amyIoliquefaciens GAl as a source ofpotent antibiotics and other secondary metabolites for biocontrol of plantpathogens，2009，Microb Cell Fact，8:63)。解淀粉芽胞桿菌通過(guò)成功定殖至植物根際、體表或體內(nèi)，同病原菌競(jìng)爭(zhēng)植物周圍的營(yíng)養(yǎng)、分泌抗菌物質(zhì)抑制病原菌生長(zhǎng)，同時(shí)誘導(dǎo)植物防御系統(tǒng)抵御病原菌入侵，從而達(dá)到生防目的。其主要防治對(duì)象大部分為絲狀真菌所引起的植物病害，如水稻紋枯病、番茄葉霉病、大豆根腐病、蘋果霉心病、棉花立枯病、棉花枯萎病等(程洪斌等，枯草芽胞桿菌防治植物真菌病害研究進(jìn)展，上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，22(1) 109-112)。對(duì)于蕓苔根腫菌具有抑制作用的解淀粉芽胞桿菌菌株的報(bào)道還比較少。此外，解淀粉芽胞桿菌能夠產(chǎn)生耐熱、耐干旱的芽胞，具有極強(qiáng)的抗逆能力，作為生防菌劑具有良好的應(yīng)用前景。目前商品化的解淀粉芽胞桿菌制劑種類較少，如有獲得有限商品化生產(chǎn)應(yīng)用許可的解淀粉枯草芽胞桿菌變種 (Bacillus subtilisvar. amyloliquefaciens)FZB24。白菜根腫病(clubroot)又稱根瘤病，1978年由俄國(guó)學(xué)者Worolin發(fā)現(xiàn)其病原，并命名為蕓苔根腫菌(plasmodiophora brassica)，屬真菌之鞭毛菌亞門，根腫菌綱。此病為世界性病害，多發(fā)生于溫帶地區(qū)而造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，至今仍是一大難題。根腫病主要發(fā)生在植株根部，促使根部形成腫瘤。腫瘤一般為紡綞形、平指形或不規(guī)則形，大的如雞蛋或更大些，小的只有小米粒大小。主根上的腫瘤一般大而少，側(cè)根上的則小而多。腫瘤初期表面光滑，后期常發(fā)生龜裂，變得十分粗糙，常因雜菌的浸染而腐爛，病株的地上部表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢，植株矮小如缺水癥狀。發(fā)病后期萎蔫低垂更甚，而且葉片黃，嚴(yán)重的可以引起植株死亡。根腫病病原菌可危害十字花科多種作物，其嚴(yán)重性因生理小種不同而異。病菌孢子囊在6-30°C均可發(fā)芽，但以18-25°C為最適宜，此適溫也是發(fā)病的最適溫度條件，當(dāng)溫度低于或高于此范圍時(shí)不發(fā)病或發(fā)病輕，發(fā)病最適土溫為21-22°C。土壤條件以PH值最具影響力，pH值4. 0-7. 0均可以發(fā)病，但以5. 4-6. 5為最適發(fā)病pH值，一般pH值7. 0或7. 2以上不發(fā)病，土中可交換性鈣離子濃度達(dá)到1200mg/kg時(shí)也不發(fā)病(楊蓮等，白菜根腫病田間發(fā)生消長(zhǎng)規(guī)律研究，植保技術(shù)與推廣，2003，23 (7) 17-18)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)狀，旨在提供一種解淀粉芽胞桿菌，解淀粉芽胞桿菌的培養(yǎng)方法及從其分離對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的方法，活性物質(zhì)的用途。本發(fā)明目的的實(shí)現(xiàn)方式為，一種解淀粉芽胞桿菌命名解淀粉芽胞桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens) HB-26，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2011 年7月18日，保藏中心編號(hào)CCTCC N0.M2011259。菌株的菌體大小為(0. 4 1.0) umx (1.0 1.5) um，細(xì)胞呈短桿狀，芽胞中生，革蘭氏染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，能運(yùn)動(dòng)。在LB瓊脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落橢圓形、表面隆起有皺褶。最適生長(zhǎng)溫度為30°C，pH6-8均生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)pH為7. 0-7. 2。一種解淀粉芽胞桿菌的培養(yǎng)方法，具體步驟如下1)將沼液進(jìn)行分離培養(yǎng)與保存稱取0. Ig 土樣及Iml沼液，分別加入滅菌去離子水至總體積為10ml，混勻后再依次取1ml，繼續(xù)稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀釋后的菌液200 μ 1涂布LB平板， 30°C培養(yǎng)過(guò)夜，分別挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 30°C活化8_10h，用 25%甘油保存在-80°C，LB平板配方蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、瓊脂粉20g ；補(bǔ)充水分至1L，pH 7. 2，121°C 滅菌 30min ；2)細(xì)菌的小量發(fā)酵將活化過(guò)夜的細(xì)菌單菌落按的接種量轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中， 200rpm30°C振蕩培養(yǎng) 24-36h,LB液體培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，補(bǔ)充水分1L，pH 7.2，121°C 滅菌30min ；3)抑菌活性檢測(cè)的白菜根腫病盆栽實(shí)驗(yàn)(1)將大白菜種子用溫水浸泡過(guò)夜，用70%酒精洗一遍，點(diǎn)播在裝有培養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，每缽放2顆種子，在20°C溫室中避光培養(yǎng)14d，每天澆水一次，模擬自然條件培育；(2)將生長(zhǎng)至3-4葉片的白菜幼苗移栽至花盆中，土壤分為混入蕓苔根腫菌的病土及沒(méi)有病原菌的健康土兩種，每個(gè)處理設(shè)置5次重復(fù)，20°C培養(yǎng)，每天澆水一次；(3)每2個(gè)星期灌根一次，共灌根3次，每次用IOOml步驟2)的菌液灌根，傍晚灌根；0)2個(gè)月后，將白菜根部拔出，根據(jù)沒(méi)有根腫的植株找出對(duì)應(yīng)灌根所用的菌株，即為對(duì)根腫菌有抑菌活性的菌株。一種從解淀粉芽胞桿菌分離對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的方法，具體
5步驟如下1)ΗΒ-26菌株的發(fā)酵與活性物質(zhì)提取LB液體培養(yǎng)基中接種HB-26，過(guò)夜培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)接至20L發(fā)酵罐中，進(jìn)行12L LB培養(yǎng)液的小量發(fā)酵，30°C培養(yǎng)，溶氧量20%-30%，通氣量1 0.3-1 0. 5，轉(zhuǎn)速?gòu)?200rpm-300rpm, pH 6. 5-7. 0，發(fā)酵24h后，取出發(fā)酵液，倒入凍干槽中，每槽狀菌液量為 IOOml，凍干機(jī)中凍干2-3天后，將凍干粉從凍干槽中取出裝入三角瓶中，每6個(gè)凍干槽的菌粉裝入1個(gè)三角瓶，每個(gè)三角瓶中加入IOOml乙酸乙酯，混勻后室溫ISOrpm振蕩lh，取上清液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到干粉，加入100%甲醇溶解；2)ΗΒ46菌株活性物質(zhì)的分離取5ml甲醇溶解的樣品進(jìn)行HPLC分離，所用色譜柱為反相柱，10 μ m，10X 250mm， 進(jìn)樣體積800 μ 1，柱溫為25°C，流速7. 5ml/min，流動(dòng)相為乙腈和水，采用梯度洗脫，乙腈的濃度在25min內(nèi)5%變至100%，每分鐘收集一個(gè)組分，共收集到36個(gè)組分；MS鑒定分離組分的分子量，質(zhì)譜檢測(cè)條件電噴霧電離，毛細(xì)管電壓為3. 5KV，錐孔電壓為45V，離子源溫度為100°C，干燥溫度為300°C，脫溶劑氣體流速500L/h，錐孔氣體流速為50L/h ；3)用盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證活性成分，盆栽實(shí)驗(yàn)依然采用上述條件，每個(gè)處理設(shè)置兩棵植株，根據(jù)白菜根腫發(fā)作的情況， 來(lái)判斷活性物質(zhì)為哪一個(gè)組分，結(jié)果顯示對(duì)白菜根腫病具有抑制效果的是組分17、20、30 分鐘收集的組分。一種從解淀粉芽胞桿菌分離出的對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的用途， 用作制備防治白菜根腫病的微生物制劑。本發(fā)明的菌株具有下列明顯特征(1)對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌活性；(2)能夠產(chǎn)生大小為1494. 0的糖類活性物質(zhì)，該物質(zhì)被命名為BA20 ；(3) BA20對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌活性。本發(fā)明制備的菌株按照常規(guī)甘油管保藏方法保藏。


圖1是本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌HB46菌株的白菜根腫病盆栽實(shí)驗(yàn)，圖2是本發(fā)明解淀粉芽胞桿菌HB-26的菌落形態(tài)圖及鏡檢圖，圖3是本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌HB-26的16s rDNA系統(tǒng)發(fā)生樹，圖4是本發(fā)明的HB46菌株代謝物HPLC圖，圖5是本發(fā)明的HB46菌株代謝物經(jīng)過(guò)HPLC分離后得到的36份組分物質(zhì)做的白菜根腫病盆栽實(shí)驗(yàn)，圖6是本發(fā)明的HB46菌株中BA20的LC-MS鑒定及核磁共振氫譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的解淀粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)HB-26，由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日2011年7月18日，保藏中心編號(hào)CCTCC N0.M2011259。菌株的菌體大小為(0. 4 1. 0) umx (1. 0 1. 5) um,細(xì)胞呈短桿狀，芽胞中生，革蘭氏染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，能運(yùn)動(dòng)。在LB瓊脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落橢圓形、表面隆起有皺褶。最適生長(zhǎng)溫度為30°C，pH6-8均生長(zhǎng)良好，最適生長(zhǎng)pH為7. 0-7. 2。下面詳述本發(fā)明一、解淀粉芽胞桿菌的培養(yǎng)方法，具體步驟如下1、細(xì)菌的分離與保存將采自全國(guó)各地的土壤樣品及液體樣品(如采自湖北荊州的沼液)，分別進(jìn)行分
離培養(yǎng)與保存。具體方法是稱取0. Ig 土樣及Iml沼液，分別加入滅菌去離子水至總體積為 IOml,混勻后再依次取1ml，繼續(xù)稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀釋后的菌液 200 μ 1涂布LB (配方蛋白胨10g，酵母粉5g,NaCl 10g，瓊脂粉20g，補(bǔ)充水分lL，pH 7. 2， 121°C滅菌30min)平板，30°C培養(yǎng)過(guò)夜。分別挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 30°C活化8_10h，用25% 甘油保存在-80°C。2、細(xì)菌的小量發(fā)酵將活化過(guò)夜的細(xì)菌單菌落按的接種量轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基(配方蛋白胨 10g，酵母粉 5g，NaCl 10g，補(bǔ)充水分 lL，pH 7. 2，121°C滅菌 30min)中，200rpm 30°C振蕩培養(yǎng)Μ-3Μι。3、抑菌活性檢測(cè)的白菜根腫病盆栽實(shí)驗(yàn)由于白菜根腫病原菌蕓苔根腫菌目前還無(wú)法在實(shí)驗(yàn)室條件下離體培養(yǎng)，因此要檢測(cè)其拮抗菌活性，只能通過(guò)盆栽實(shí)驗(yàn)。具體方法如下(1)白菜幼苗的培育將大白菜種子用溫水浸泡過(guò)夜，用70%酒精洗一遍，點(diǎn)播在裝有培養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，每缽放2顆種子。在20°C溫室中避光培養(yǎng)14d，每天澆水一次。苗子長(zhǎng)出后，打開植物生長(zhǎng)燈，模擬自然條件，早開燈，晚關(guān)燈。(2)白菜幼苗的移栽將生長(zhǎng)至3-4葉片的白菜幼苗移栽至花盆中，土壤分為混入蕓苔根腫菌的病土及沒(méi)有病原菌的健康土兩種，每個(gè)處理設(shè)置5次重復(fù)。秋冬季在室外環(huán)境下培養(yǎng)，春夏季在20°C溫室中培養(yǎng)，每天澆水一次，植物生長(zhǎng)燈設(shè)置為早8:00開燈，晚 20:00關(guān)燈。(3)細(xì)菌菌液灌根每2個(gè)星期進(jìn)行灌根一次，共灌根3次。每次菌液灌根量為 100ml，傍晚灌根。(4)拔根驗(yàn)證抑菌效果2個(gè)月后，將白菜根拔出，根據(jù)與對(duì)照(病土，沒(méi)有施藥的白菜及健康土)相比較，選出根部根系發(fā)達(dá)，主根與側(cè)根數(shù)量多，且根腫少或沒(méi)有的植株， 對(duì)號(hào)入座，找出灌根所用的菌株，即為對(duì)根腫菌有抑菌活性的菌株。根據(jù)根腫數(shù)量的多少， 獲得菌株HB46 (來(lái)源于沼液)，即為對(duì)根腫菌具有抑菌活性的菌株(見(jiàn)圖1)。圖1中的A 含有蕓苔根腫菌的病土栽培的白菜植株，只加水澆灌；B 含有蕓苔根腫菌的病土栽培的白菜植株，用HB46菌液灌根處理3次；C 不含有蕓苔根腫菌的健康土栽培的白菜植株，用培養(yǎng)基灌根處理3次；D 以上三種處理的白菜植株對(duì)比。從D的對(duì)比可看出，用HB46菌液灌根的白菜植株，根系健壯發(fā)達(dá)，沒(méi)有根瘤。4、細(xì)菌的菌種鑒定
細(xì)菌的顯微鏡觀察(1)挑取對(duì)蕓苔根腫菌有抑菌活性的單菌落，用蕃紅染色液(配置方法2. 5%蕃紅的乙醇溶液10ml，加蒸餾水稀釋至100ml，過(guò)濾)簡(jiǎn)單染色后置普通光學(xué)顯微鏡下觀察， 均為產(chǎn)芽胞的桿狀細(xì)菌(見(jiàn)圖2)。圖2中的A :HB-26的菌落形態(tài)圖；B 顯微鏡下的HB46桿狀芽胞。(2)細(xì)菌總DNA的抽提從顯微觀察的菌落中，挑取一個(gè)單菌落，用接種環(huán)通過(guò)無(wú)菌操作接種于5mL的LB 液體培養(yǎng)基中，置于30°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)過(guò)夜；然后通過(guò)無(wú)菌操作將50 μ L的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至5mL的LB液體培養(yǎng)基中，同樣條件培養(yǎng)3-4小時(shí)；然后以12000rpm，0. 5min 離心收集菌體,用 ImL STE[配方0. lmol/L NaCl, 10mmol/L Tris-HCl (pH 8. 0), lmmol/ L EDTA (pH8. 0)]洗滌一次，加 100 μ L 溶液 I [配方lmol/LTris-HCl (pH8. 0)，0. 5mol/L EDTA(pH8)，50mmol/L 葡萄糖]和 10 μ L 溶菌酶(濃度:50mg/mL)，在 37°C作用 30min 以上； 加入200 μ L 2%的十二烷基磺酸鈉(SDS)于55°C水浴30min ；加入200 μ L 5mol/L NaCl混和，再加入500yL苯酚/氯仿/異戊醇(按體積比25 24 1)，離心12000rpm，5min， 吸取上清液，重復(fù)抽提1-2次；將上層DNA溶液轉(zhuǎn)移至1. 5ml離心管，加入等體積95%乙醇， 室溫靜置5min后以12000印111離心51^11，沉淀用20(^1^ 70%乙醇洗滌一次，冷凍抽干后溶于50 μ L TE溶液中。(3)PCR擴(kuò)增細(xì)菌的rDNA根據(jù)真細(xì)菌16S rDNA保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物CW34667和CW34668(BW Eckloff, et al, A comparison of 16S ribosomal DNA sequences from five isolates ofHelicobacter pylori, International Journal of Systematic Bacteriology,1994, 44 :320-323)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。通用引物序列如下CW34667 :5， -CTCTCAAACTAGGACCGAGTC-3，CW34668 :5’ -TTCCTCCACTAGGTRGGCGT-3’PCR 反應(yīng)體系為10Xbuffer 2 μ l,2mmol/L dNTP 1. 5 μ 1，10 μ mol/L 通用引物各0.4 μ 1，Taq酶1U，拮抗細(xì)菌總DNA 1 μ 1，補(bǔ)加滅菌去離子H2O至20 μ 1。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)榈?步94°C預(yù)變性5min ；第2步94°C變性lmin，第3步58°C 復(fù)性lmin，第4步72°C延伸1. 5min ；第5步轉(zhuǎn)到第2步繼續(xù)運(yùn)行28個(gè)重復(fù)；第6步72°C延伸 5min。G) PCR產(chǎn)物的序列測(cè)定及分析將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，切下需要的DNA片段所在的瓊脂糖塊，使用X-gene公司DNA片段回收試劑盒回收DNA片段。將回收產(chǎn)物連接到大連寶生物公司的 T-載體連接試劑盒所提供的PMD19-T載體上，利用CaCl2轉(zhuǎn)化法(SambrookJ.，Molecular Cloning :A Laboratory Manual[Μ]. 3rd ed. New York : Co Id SpringHarbor Laboratory ft~eSS，2001.)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a中。篩選陽(yáng)性克隆，送至華大生物有限公司測(cè)序。通過(guò)兩個(gè)測(cè)序反應(yīng)獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的全長(zhǎng)1416bp，測(cè)序結(jié)果輸入NCBI，用Blastn 程序交送GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較分析，表明該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的解淀粉芽胞桿菌屬的不同菌株的16S rDNA同源性較高，相似性達(dá)到99%，鑒定該菌株屬于芽胞桿菌科(Bacillaceae)芽胞桿菌屬(Bacillus)，申請(qǐng)人將其命名為HB-26，16S rDNA序列已登錄至 NCBI (GenBankaccession no. HM138476)。根據(jù)多序列比對(duì)結(jié)果繪制成系統(tǒng)發(fā)生樹(見(jiàn)圖3)，圖中線段的長(zhǎng)度不同表示同源性的差異。本發(fā)明分離鑒定的HB-26菌株與已報(bào)道的解淀粉芽胞桿菌菌株 (FJ889054. 1)處于同一進(jìn)化分支，且與枯草芽胞桿菌(ETO67068. 1)和海洋細(xì)菌Bacillus velezensis(EU852930. 1)在進(jìn)化分支上相距較遠(yuǎn)。因此進(jìn)一步確證HB46為一株解淀粉芽胞桿菌。二、從HB-26中分離、提取抑菌活性物質(zhì)的方法UHB-26菌株的發(fā)酵與活性物質(zhì)提取LB液體培養(yǎng)基中接種HB-26，過(guò)夜培養(yǎng)。第二天轉(zhuǎn)接至20L發(fā)酵罐中，進(jìn)行12L LB培養(yǎng)液的小量發(fā)酵，30°C培養(yǎng)，溶氧量20%-30%，通氣量1 0.3-1 0. 5，轉(zhuǎn)速?gòu)?200rpm-300rpm, pH 6.5-7.0。發(fā)酵24h后，取出發(fā)酵液，倒入凍干槽中，每槽狀菌液量為 IOOml，凍干機(jī)中進(jìn)行凍干。2-3天后將凍干粉從凍干槽中取出裝入三角瓶中，每6個(gè)凍干槽的菌粉裝入1個(gè)三角瓶。每個(gè)裝有凍干粉的三角瓶中加入IOOml乙酸乙酯，混勻后室溫180rpm振蕩lh，取上清液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到干粉，加入100%甲醇溶解。2、HB-26菌株活性物質(zhì)的分離與初步鑒定取5ml甲醇溶解的樣品進(jìn)行HPLC分離，所用色譜柱為美國(guó)Sunfire C18反相柱 (10 μ m，10 X 250mm)，進(jìn)樣體積800 μ 1，柱溫為25 V，流速7. 5ml/min,流動(dòng)相為乙腈和水， 采用梯度洗脫，乙腈的濃度在25min內(nèi)5%變至100%，每分鐘收集一個(gè)組分，共收集到36 個(gè)組分(見(jiàn)圖4)。圖4中的A 代謝物的半制備圖，共分為36組分，每個(gè)組分為一分鐘內(nèi)收集的樣品；圖中的B 代謝物的HPLC全程圖，共測(cè)定到40min。MS鑒定分離組分的分子量，質(zhì)譜檢測(cè)條件電噴霧電離(ESI)，毛細(xì)管電壓為 3. 5KV，錐孔電壓為45V，離子源溫度為100°C，干燥溫度為300°C，脫溶劑氣體流速500L/h， 錐孔氣體流速為50L/h。用盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證活性成分。盆栽實(shí)驗(yàn)依然采用上述條件，每個(gè)處理設(shè)置兩棵植株。根據(jù)白菜根腫發(fā)作的情況，來(lái)判斷活性物質(zhì)為哪一個(gè)組分。結(jié)果顯示對(duì)白菜根腫病具有抑制效果的是組分17、20、30，其中組分BA20效果最好(見(jiàn)圖5)。圖5中的A 各個(gè)組分一棵植株；B 對(duì)照，含有蕓苔根腫菌的病土栽培的白菜植株，只加水澆灌；C 含有蕓苔根腫菌的病土栽培的白菜植株，用組分17灌根處理3次；D 含有蕓苔根腫菌的病土栽培的白菜植株，用組分20即BA20灌根處理3次；E 含有蕓苔根腫菌的病土栽培的白菜植株，用組分30灌根處理3次。其中各組分的使用濃度均為40 μ g/ ml ο三、從HB-26中分離、提取出的抑菌活性物質(zhì)BA20的結(jié)構(gòu)鑒定將HPLC半制備獲得的活性組分20進(jìn)行MS鑒定，結(jié)果顯示其分子量為1494. 0，命名為BA20。重新大量提純BA20，并做核磁共振分析，氫譜結(jié)果顯示該物質(zhì)為一糖類衍生物， 通過(guò)與已知糖類如葡萄糖、蔗糖等物質(zhì)的氫譜圖比較發(fā)現(xiàn)，BA20氫譜圖均與其他糖類物質(zhì)不同，所以推測(cè)可能為一新的糖類細(xì)菌素(見(jiàn)圖6)。圖6中的A :BA20的HPLC分離純化圖；B :BA20的MS質(zhì)譜圖；C :BA20的核磁共振氫譜圖。四、從HB-26中分離、提取出的抑菌活性物質(zhì)BA20的抑真菌活性測(cè)定將提純得到的BA20經(jīng)過(guò)定量測(cè)定其初始濃度為40 μ g/ml，分別用甲醇稀釋1倍、2 倍、3倍后，得到稀釋濃度為20 μ g/ml、10 μ g/ml、5 μ g/ml，分別進(jìn)行番茄早疫病菌、玉蜀黍赤霉、禾谷鐮刀菌、水稻紋枯病菌及立枯絲核菌等病原真菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)通過(guò)96孔板進(jìn)行，將不同濃度的BA20混入培養(yǎng)真菌生長(zhǎng)的PDA培養(yǎng)基(配方馬鈴薯浸出汁200g，葡萄糖20g，瓊脂粉20g，水1000ml，pH值7. 0)中，設(shè)置沒(méi)有放BA20的對(duì)照，25°C溫箱中培養(yǎng) 7d。根據(jù)病原真菌相對(duì)生長(zhǎng)狀況來(lái)判斷抑菌效果。菌株相對(duì)生長(zhǎng)情況對(duì)比如下(_)對(duì)照， 病原菌生長(zhǎng)良好；(+)病原菌生長(zhǎng)情況為100% -70% ； (++)69% -30% ； (+++)29% -1% ； (++++)完全抑制病原菌生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.一種解淀粉芽胞桿菌，其特征在于命名解淀粉芽胞桿菌HB-26，保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日2011年7月18日，保藏中心編號(hào)CCTCC N0.M2011259。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌，其特征在于菌體大小為0.4 1. Oumxl. 0 1. 5um,細(xì)胞呈短桿狀，芽胞中生，革蘭氏染色呈陽(yáng)性反應(yīng)，能運(yùn)動(dòng)，在LB瓊脂糖平板上形成的菌落呈乳白色、菌落橢圓形、表面隆起有皺褶，最適生長(zhǎng)溫度為30°C，pH6-8 生長(zhǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌，其特征在于菌體在pH7.0-7. 2生長(zhǎng)。
4.一種權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌的培養(yǎng)方法，其特征在于具體步驟如下1)將沼液進(jìn)行分離培養(yǎng)與保存稱取0. Ig 土樣及Iml沼液，分別加入滅菌去離子水至總體積為10ml，混勻后再依次取 Iml，繼續(xù)稀釋10倍、100倍、1000倍、10000倍，取稀釋后的菌液200 μ 1涂布LB平板，30 °C 培養(yǎng)過(guò)夜，分別挑取單菌落，轉(zhuǎn)接入5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm 30°C活化8_10h，用25% 甘油保存在-80°C，LB平板配方蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl 10g、瓊脂粉20g ；補(bǔ)充水分至1L，pH 7.2, 121 °C 滅菌 30min ；2)細(xì)菌的小量發(fā)酵將活化過(guò)夜的細(xì)菌單菌落按的接種量轉(zhuǎn)接于100ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm3(TC 振蕩培養(yǎng)M-3^1，LB液體培養(yǎng)基配方蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，補(bǔ)充水分1L，pH 7. 2，121°C滅菌 30min ；3)抑菌活性檢測(cè)的白菜根腫病盆栽實(shí)驗(yàn)(1)將大白菜種子用溫水浸泡過(guò)夜，用70%酒精洗一遍，點(diǎn)播在裝有培養(yǎng)土的培養(yǎng)缽中，每缽放2顆種子，在20°C溫室中避光培養(yǎng)14d，每天澆水一次，模擬自然條件培育；(2)將生長(zhǎng)至3-4葉片的白菜幼苗移栽至花盆中，土壤分為混入蕓苔根腫菌的病土及沒(méi)有病原菌的健康土兩種，每個(gè)處理設(shè)置5次重復(fù)，20°C培養(yǎng)，每天澆水一次；(3)每2個(gè)星期灌根一次，共灌根3次，每次用IOOml步驟2、的菌液灌根，傍晚灌根；(4)2個(gè)月后，將白菜根部拔出，根據(jù)沒(méi)有根腫的植株找出對(duì)應(yīng)灌根所用的菌株，即為對(duì)根腫菌有抑菌活性的菌株。
5.—種從權(quán)利要求1所述的解淀粉芽胞桿菌分離對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的方法，其特征在于具體步驟如下DHB-26菌株的發(fā)酵與活性物質(zhì)提取LB液體培養(yǎng)基中接種HB-26，過(guò)夜培養(yǎng)，第二天轉(zhuǎn)接至20L發(fā)酵罐中，進(jìn)行12L LB 培養(yǎng)液的小量發(fā)酵，30°C培養(yǎng)，溶氧量20% -30%，通氣量1 0.3-1 0.5，轉(zhuǎn)速?gòu)?200rpm-300rpm, pH 6. 5-7. 0，發(fā)酵24h后，取出發(fā)酵液，倒入凍干槽中，每槽狀菌液量為 100ml，凍干機(jī)中凍干2-3天后，將凍干粉從凍干槽中取出裝入三角瓶中，每6個(gè)凍干槽的菌粉裝入1個(gè)三角瓶，每個(gè)三角瓶中加入IOOml乙酸乙酯，混勻后室溫ISOrpm振蕩lh，取上清液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到干粉，加入100%甲醇溶解；2)HB-26菌株活性物質(zhì)的分離取5ml甲醇溶解的樣品進(jìn)行HPLC分離，所用色譜柱為反相柱，10 μ m, 10 X 250mm，進(jìn)樣體積800 μ 1，柱溫為25°C，流速7. 5ml/min，流動(dòng)相為乙腈和水，采用梯度洗脫，乙腈的濃度在25min內(nèi)5%變至100%，每分鐘收集一個(gè)組分，共收集到36個(gè)組分；MS鑒定分離組分的分子量，質(zhì)譜檢測(cè)條件電噴霧電離，毛細(xì)管電壓為3. 5KV，錐孔電壓為45V，離子源溫度為100°C，干燥溫度為300°C，脫溶劑氣體流速500L/h，錐孔氣體流速為 50L/h ；3)用盆栽實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證活性成分，盆栽實(shí)驗(yàn)依然采用上述條件，每個(gè)處理設(shè)置兩棵植株，根據(jù)白菜根腫發(fā)作的情況，來(lái)判斷活性物質(zhì)為哪一個(gè)組分，結(jié)果顯示對(duì)白菜根腫病具有抑制效果的是組分17、20、30分鐘收集的組分。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的從解淀粉芽胞桿菌分離對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的方法，其特征在于分離出的抑菌活性物質(zhì)命名為BA20，是糖類衍生物，分子量為 1494.0。
7.一種由權(quán)利要求5所分離的對(duì)蕓苔根腫菌具有抑菌作用的活性物質(zhì)的用途，其特征在于用作制備防治白菜根腫病的微生物制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株抑制蕓苔根腫菌的解淀粉芽胞桿菌及其活性物質(zhì)的分離與應(yīng)用，活性物質(zhì)的用途。解淀粉芽胞桿菌HB-26，保藏在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM2011259。培養(yǎng)方法是沼液分離菌接種LB液體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)過(guò)夜，發(fā)酵液對(duì)白菜灌根，找出對(duì)根腫菌有抑菌活性的菌株。分離活性物質(zhì)是LB液體培養(yǎng)基中接種HB-26，發(fā)酵液凍干，凍干菌粉加乙酸乙酯提取，振蕩旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用甲醇溶解后，進(jìn)行HPLC分離，收集組分，質(zhì)譜鑒定，根據(jù)白菜根腫病發(fā)作的情況，來(lái)判斷活性物質(zhì)為哪一個(gè)組分。抑菌活性物質(zhì)BA20，分子量大小為1494.0，核磁共振氫譜顯示其化學(xué)本質(zhì)是糖類細(xì)菌素?；钚晕镔|(zhì)用作制備防治白菜根腫病的微生物制劑。
文檔編號(hào)C12N1/20GK102382781SQ20111028474
公開日2012年3月21日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者萬(wàn)中義, 劉曉艷, 周榮華, 張志剛, 曹春霞, 楊自文, 江愛(ài)兵, 王開梅, 閔勇 申請(qǐng)人:湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心