專利名稱：禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒囊膜蛋白的單克隆抗體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子免疫學(xué)和病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種由雜交瘤細胞分泌的禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒囊膜蛋白(ENV)保守序列的單克隆抗體及其制備方法。
背景技術(shù)：
禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥(RE)是由禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)引起的以網(wǎng)狀細胞增生為主要特征的一組綜合癥(Witter R. L，1997)，包括急性網(wǎng)狀細胞增生癥、矮小綜合征和淋巴組織及其它組織的慢性腫瘤增生性疾病，可引發(fā)為嚴重的生長抑制和免疫抑制。繼禽馬立克氏病和禽白血病之后，RE是迄今己經(jīng)確定的禽類第三種傳染性腫瘤病。除已知火雞、雞、鴨、鵝、日本鵪鶉等家禽可感染不同的REV毒株外，還從野鴨、野火雞以及野生鳥類中分離到該病毒。研究顯示，目前，我國商品化雞群REV抗體陽性率普遍偏高，有的地區(qū)更是高達80%。凈化雞群，減少REV對禽類生產(chǎn)的危害任重道遠。1、REV病毒的囊膜蛋白
REV基因組編碼gag、pol和env三個結(jié)構(gòu)蛋白。其中env基因編碼的囊膜蛋白(ENV) 包涵了 REV病毒99%以上的抗原位點。世界各地學(xué)者對REV研究發(fā)現(xiàn)，其env基因為該病毒的高變區(qū)域，極易發(fā)生突變?；趀rw表面蛋白基因gp90制備的單抗不能排除REV突變的影響，很大程度上影響了 RE疾病的診斷精準(zhǔn)率。以erw基因中保守區(qū)域制備單抗，既保留了病毒絕大部分的抗原位點又排除了因基因變異帶來的干擾，將有效的提高REV診斷的精準(zhǔn)率。2、禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的診斷方法研究現(xiàn)狀
目前對禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的診斷，可通過臨床剖檢和組織病理學(xué)檢查初步診斷， 進一步確診需要通過PCR、免疫組織化學(xué)、間接免疫熒光和ELISA等方法。PCR技術(shù)容易受到很多因素干擾，并可能出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果；目前我們使用的ELISA單克隆抗體試劑盒產(chǎn)于國外，價格昂貴，檢測成本高，不利于大規(guī)模的雞群檢測和凈化。免疫組織化學(xué)和間接免疫熒光方法檢測REV、制備國產(chǎn)化抗體檢測試劑盒均需要高特異性的單克隆抗體。研制出廉價高效且具有代表性的單克隆抗體，對凈化集群，減少REV對養(yǎng)禽業(yè)帶來的損失勢在必行。

發(fā)明內(nèi)容
針對于env基因編碼的囊膜蛋白因基因突變帶來的各種不便，本發(fā)明選取了 env 基因的相對保守區(qū)域共1200bp的基因片段，該片段表達的400個氨基酸包涵了 REV病毒 90%以上的抗原位點，這樣既保留了病毒絕大部分的抗原位點又排除了因基因變異帶來的干擾，利用含有該保守基因片段的env基因獲得原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白，免疫 Balb/C小鼠，經(jīng)瘤細胞SP2/0與被免疫小鼠的脾細胞融合，篩選和克隆得到REV ENV蛋白的單克隆抗體，該單克隆抗體可有效地防止因REV突變對診斷效果的影響，為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的診斷、預(yù)防提供科學(xué)基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。本發(fā)明提供的由雜交瘤細胞分泌的REV囊膜蛋白的單克隆抗體；是通過如下具體步驟獲得的
根據(jù)REV標(biāo)準(zhǔn)毒株SNV株的前病毒基因組DNA erw基因兩端的一段序列作為引物。上游引物為 5，-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3，其基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示，下游引物為 5，-CGACTCGA- GAACAATATGAGCCCAAACA- 3，其基因序列如 SEQ ID NO. 3 所示，并在引物中分別添加了 EcoR I和Xhol I酶切位點。PCR擴增，DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物， 利用pET-28a獲得重組載體pET-28a-env重組質(zhì)粒，將該重組質(zhì)粒按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入CaCl2 法制備的感受態(tài)細胞BL21，酶切法鑒定陽性克隆，陽性克隆送往測序公司測序，最終獲得的 env基因其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。將上述含有重組質(zhì)粒的BL21菌接種于含氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，使用0.4mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達出了帶有HIS標(biāo)簽的融合蛋白His-env，得到以包涵體形式表達His-env蛋白。通過透析得到的上清即為純化完成的His-env融合蛋白。使用 SDS-PAGE法檢測純化后的蛋白，其分子量為45KD。得到的蛋白經(jīng)過Bradford法測定蛋白含量，稀釋到0. 5mg/ml分裝_20°C保存?zhèn)溆?。將上述獲得的純化后的原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白免疫Balb/C小鼠，經(jīng)瘤細胞SP2/0與被免疫小鼠的脾細胞融合，通過生物免疫學(xué)技術(shù)，篩選和克隆得到能分泌禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒囊膜蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞，發(fā)明人將該雜交瘤細胞進行生物保藏，保藏號為CGMCC NO 5019，保藏于中國普通微生物保藏管理中心，保藏時間為 2011年7月18日。由上述雜交瘤細胞分泌的REV囊膜蛋白(ENV)的單克隆抗體(以下簡稱單抗1)， 可與REV的囊膜蛋白受體特異性結(jié)合；
長勢良好的該雜交瘤細胞在其培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)2-3天，培養(yǎng)液由橘紅色變?yōu)辄S色， 這就表明該培養(yǎng)液中含有該雜交瘤細胞株分泌出的單克隆抗體，即單抗1 ；經(jīng)間接免疫熒光方法檢測，該單抗1與接種REV的DF-I細胞特異性的結(jié)合，在熒光顯微鏡下觀察，細胞膜及細胞漿呈現(xiàn)明亮的熒光信號，細胞內(nèi)的細胞核區(qū)域無熒光；經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附方法檢測，酶標(biāo)儀測OD值單抗1與純化后的原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白可發(fā)生特異性結(jié)合，其OD 值與陰性對照的OD值得比值不小于2 ；通過轉(zhuǎn)印免疫印跡方法檢測單抗1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單抗1 能與目的蛋白特異性的結(jié)合，并確定表達蛋白的分子量。基于上述的理由，本發(fā)明所獲得的單克隆抗體為檢測、預(yù)防禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥奠定了基礎(chǔ)。在篩選雜交瘤細胞分泌的單克隆抗體時，為了獲得抗REV ENV蛋白的單克隆抗體， 可采用下述三種方法
1.將純化后的原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白與該單抗1在體外結(jié)合，采用酶聯(lián)免疫吸附方法篩選抗REVHis-env的單克隆抗體，篩選時發(fā)生了特異性結(jié)合的OD值與陰性對照的OD值比值不小于2 ；
2.將純化后的原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白與該單抗1在體外結(jié)合，采用轉(zhuǎn)印免疫印跡方法確定與抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的蛋白分子量，在45KD處出現(xiàn)一條特異性的蛋白條帶， 與預(yù)計的蛋白分子量相符，篩選獲得抗REV His-env的單克隆抗體。3.將REV SNV標(biāo)準(zhǔn)株接種DF-I細胞，使該單抗1與病毒結(jié)合，采用間接免疫熒光篩選抗REV His-env的單克隆抗體，篩選時與接種REV SNV的特異性結(jié)合的，在熒光顯微鏡下觀察，細胞膜呈現(xiàn)明亮的熒光信號，細胞內(nèi)的細胞核區(qū)域無熒光。通過上述方法篩選出的單克隆抗體，具有如下的優(yōu)點
1雖然國外特異性檢測REV抗體的單克隆抗體檢測試劑盒已經(jīng)商品化，但由于昂貴， 很難大范圍使用。REV嚢膜蛋白(ENV)包涵了 REV病毒99%以上的抗原位點，是作為檢測 REV抗體的首選抗原。但是經(jīng)世界各地學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，erw基因?qū)儆谠摬《镜母咦儏^(qū)域，極易發(fā)生突變。因此經(jīng)過比對REV病毒多個毒株，本發(fā)明選取了 erw基因的相對保守區(qū)域共 1200bp的基因片段，該片段表達的400個氨基酸包涵了 REV病毒90%以上的抗原位點，這樣既保留了病毒絕大部分的抗原為點又排除了因基因變異帶來的干擾。2本發(fā)明適用于大規(guī)模批量生產(chǎn)，經(jīng)過進一步的研究會根據(jù)該單克隆抗體開發(fā)出針對REV的治療藥物和疫苗，一旦得到有利推廣，可針對禽白血病廣泛性的開展研究、預(yù)防、治療等工作?？傊?，本發(fā)明所提供的REV囊膜蛋白的單克隆抗體在今后的科技和生產(chǎn)中具有很大的開發(fā)潛力。發(fā)明人對本發(fā)明所制備的雜交瘤進行了生物保藏，具體保藏信息如下 保藏信息
保藏時間2011年7月18日
保藏單位名稱中國普通微生物保藏管理中心 CGMCC 保藏編號CGMCC NO 5019
保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院中科院微生物研究所分類命名雜交瘤細胞。


圖1為PCR法擴增REV His-env基因電泳圖，
圖中M為DL5000 marker, 1為DFl細胞感染REV，2為正常DFl細胞； 圖2為pET-28a-env重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖，
1 為使用 EcoR I 和 Xhol I 酶切 pET18a-env，2 為使用 EcoR I 和 Xhol I 酶切 pFastHTb 空質(zhì)粒，M 為 Ikb DNA Ladder ；
圖3為pET-28a-env重組質(zhì)粒表達的融合蛋白SDS-PAGE電泳圖， M為 Protein marker(KD);2 為 pET-28a_env/BL21 破碎產(chǎn)物沉淀；3和 4均為 pET_28a_ env/BL21破碎產(chǎn)物上清；5為pET48a-env/BL21全菌體； 圖4為His-env蛋白純化后的SDS-PAGE電泳圖， M為Protein marker (KD) ； 1為His-env融合蛋白純化產(chǎn)物； 圖5為間接免疫熒光檢測法檢測單克隆抗體OOO倍)檢測結(jié)果圖， A 為 Positive control ； B 為 Negative control ； C 禾口 D 均為單抗 1。圖6為Western blot法檢測單抗1硝酸纖維素膜雜交圖， M. Protein Marker (KD) ； 1 和 2 均為單抗 1。
具體實施例方式
(1)主要試劑
PEG-1500, HT, HAT 為 Sigma 公司產(chǎn)品；弗氏不完全佐劑、弗氏完全佐劑購自北京美科美生物有限公司； DMEM高糖培養(yǎng)基為hvitrogen公司產(chǎn)品； 胎牛血清為Hyclone公司產(chǎn)品；
HRP酶標(biāo)二抗，F(xiàn)ITC標(biāo)記熒光二抗為博奧森生物有限公司產(chǎn)品； TMB單組份底物顯色溶液，DAB顯色試劑盒為天根公司產(chǎn)品；
Taq 聚合酶，限制性內(nèi)切酶 Ecol I, Xhol I、BamH I、Pst I、T4 連接酶、dNTP、DNA Marker為大連寶生物有限公司產(chǎn)品；
PCR產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；
蛋白預(yù)染Marker為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；
胰蛋白胨(Tryptone)及酵母抽提物(Yeast Extract)為Oxiod公司產(chǎn)品；
蛇皮透析袋(SnakeSkin Pleated)為Thermo公司產(chǎn)品；
其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。
(2)主要儀器
細胞培養(yǎng)箱為Healforce公司產(chǎn)品； PCR儀、分光光度計為Eppendorf公司產(chǎn)品；
低溫高速離心機為湖北湘儀公司產(chǎn)品；熒光倒置顯微鏡為Nikon公司產(chǎn)品； 凝膠成像系統(tǒng)為北京君意公司產(chǎn)品； 酶標(biāo)儀為Hiermo公司產(chǎn)品； 恒溫搖床為上海申能博彩公司產(chǎn)品； 恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺為上海博迅公司產(chǎn)品；
電泳儀、SDS-PAGE電泳槽、Western-blot膜轉(zhuǎn)印裝置為北京六一公司產(chǎn)品； 細胞超聲波粉碎機為寧波新芝生物有限公司產(chǎn)品。實施例1 REV env基因的克隆及測序
根據(jù)REV標(biāo)準(zhǔn)毒株SNV株前病毒基因組DNA env基因兩端的一段序列作為引物。上游引物為 5，-CCGGAATTCGCCATCCTACAGAAAACAAA-3，其基因序列如 SEQ ID NO. 2 所示，下游引物為 5，-CGACTCGA- GAACAATATGAGCCCAAACA- 3，其基因序列如 SEQ ID NO. 3 所示，并在引物中分別添加了 EcoR I和Biol I酶切位點。PCR反應(yīng)條件為95°C 5min，充分變性后進入循環(huán)體系95°C 30 s，56°C 1 min,72°C 2 min，共 30 個循環(huán)；然后 72°C延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，使用DNA純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物。將pET_28a載體與PCR純化產(chǎn)物分別用限制性內(nèi)切酶EcoR I.Xhol I雙酶切6h， 按照膠回收試劑盒說明分別回收大片段，于16°C下連接過夜。連接體系為pET-28a載體lPL，雙蒸水3μ ，純化的DNA目的片段4μ ，Τ4連接酶 μ ，IOXbuffer μ ，總體積為 ΙΟμ ο轉(zhuǎn)化產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化入CaCl2法制備的感受態(tài)細胞BL21，酶切法鑒定陽性克隆，結(jié)果如圖2所示，出現(xiàn)兩條條帶的為陽性克隆，陽性克隆送往測序公司測序，最終獲得的env基因其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。所采用的EcoR I和B10I I酶切法均為現(xiàn)有技術(shù)。實施例2 His-env蛋白的表達和純化
將含有重組質(zhì)粒的BL21菌接種于含卡鈉霉素的LB固體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過挑取單菌落接種于含Kan (終濃度為30 μ g/ml)的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩QOOrpm)，培養(yǎng)至 0D600=0. 6，加入IPTG至終濃度為0. 4mmol/L，37°C繼續(xù)培養(yǎng)3h，同時設(shè)未誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌作為對照。經(jīng)SDS-PAGE分析顯示，目的蛋白His-env以包涵體形式表達，檢測步驟如下 收集培養(yǎng)的工程菌菌液，5000rpm，離心5min，棄上清；稱取30g收集到的濕菌于500ml
燒杯中，加入300ml的重懸液，加入轉(zhuǎn)子在磁力攪拌器上攪拌20min，使菌體分散均勻；將上述燒杯置于冰浴，用超聲破菌儀超聲破菌，120W,工作4s，間歇如，超聲Ih左右，用槍頭吹吸菌液，待菌體不再黏著時，第一次超聲破菌結(jié)束；將超聲破菌液轉(zhuǎn)入500ml離心管中，配平， 放入高速冷卻離心機中，12000rpm，4°C，離心20min ；取沉淀，加入200ml的重懸液，用上述方法進行第二次超聲粉碎，離心，超聲粉碎2 4次后，去沉淀，處理后用SDS-PAGE電泳檢測，其結(jié)果如圖3所示，在45KD處出現(xiàn)明顯的蛋白條帶。His-env蛋白的純化步驟如下
將上述沉淀用9倍體積的洗滌液I重懸沉淀，靜置5min后，12000rpm, 15min棄上清。 用9倍體積的洗滌液II重懸沉淀，靜置5min后，12000rpm, 15min，棄上清，保留粘稠上清。 用9倍體積的洗滌液III重懸沉淀，靜置5min后，12000rpm, 15min，棄上清，保留粘稠上清。 按IOOml菌液加細1溶解液，劇烈震蕩lh。12000rpm，離心15min。取上清，即為溶解的包涵體。包涵體純化所述試劑配制方法
(1)細菌重懸液(250ml) PBS (NaCl 2g, KCl 0. 05g, Na2HPO4 0. 36g KH2P04 0. 06g)， 1 mm/L EDTA.
(3)洗滌液 I (250ml) :500mmol/L Tris-Cl (PH=8. 0), lOOmmol/L NaCl, 1 OOmmo 1/L
EDTA
(3)洗滌液II(250ml):洗滌液I，2M尿素
(4)洗滌液III(250ml):洗滌液I，4M尿素
(5)包涵體溶解液(250ml):洗滌液I，8M尿素
將上述溶解的包涵體裝入透析袋中，依次使用20mmol/L Tris_Cl(PH=8. 0)，4M尿素透析 2h，20mmol/L Tris-Cl (ΡΗ=8· 0)，2Μ 尿素透析 2h，20mmol/L Tris-Cl (PH=8. 0), 4M 尿素透析 lh，20mmol/L Tris-C1(PH=8. 0), 0· 5M尿素透析2h, 20mmol/L Tris-C1(PH=8. 0), 透析6h，12000rpm離心aiiin棄掉沉淀，得到的上清極為純化完成的His-env融合蛋白。使用SDS-PAGE法檢測純化后的蛋白，結(jié)果如圖4所示，純化后應(yīng)不含其它雜帶。得到的蛋白經(jīng)過Bradford法測定蛋白含量，稀釋到0. 5mg/ml分裝_20°C保存?zhèn)溆谩Ｆ渲兴捎玫腟DS-PAGE操作步驟如下
1)將玻璃板洗干凈，用夾子固定，垂直放置，配置1 分離膠，快速注入到兩玻璃板之間，膠上部加ImL蒸餾水封口，保持膠平整。待分離膠凝固后(約40min)，倒去分離膠表面的液體，用濾紙吸去殘留水。注入濃縮膠，快速插入梳子，并注意防止氣泡的產(chǎn)生。等待其凝固。2)取純化后的 His-env 蛋白 100 μ 1 等量 2X SDS 上樣 buffer，煮沸 5-lOmin。3)往電泳槽加入IXTris-甘氨酸緩沖液，待濃縮膠凝固后(約30min)，小心拔掉梳子，用緩沖液沖洗加樣孔，用微量進樣器上樣，10 μ 1/孔，正確連接電泳槽正負極，打開電源。先用80V電壓電泳，待樣品濃縮成一條線并進入分離膠后，提高電壓至150V，電泳至溴酚藍到達膠的底部時停止電泳。4)染色取下凝膠，用蒸餾水沖洗，放入考染溶液中，染色4h以上。5)脫色將凝膠放入脫色液中，置于搖床上脫色，期間更換3次以上脫色液，待凝膠藍色背景全部脫去停止，將凝膠放入蒸餾水中終止脫色。拍照保存。使用上述純化得到的His-env融合蛋白包被ELISA板，使用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測該蛋白的生物學(xué)活性。以IDEXX公司生產(chǎn)的REV抗體檢測試劑盒檢測為陽性的雞血清為陽性對照，健康SPF雞血清為陰性對照，HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗按說明書使用。結(jié)果顯示陽性對照與陰性對照的OD值比值大于2，說明該蛋白有良好的生物學(xué)活性和抗原性。ELISA具體步驟如下
1)包被取純化的重組蛋白His-env，以碳酸鹽緩沖液(每200ml碳酸鹽緩沖液含 Na2C03 0. 32g，NaHC03 0. 58g)稀釋至最佳濃度，包被反應(yīng)板，100 μ 1/孔，4°C過夜。2)洗滌甩去酶標(biāo)板中的包被液，用PBST (PBS，0. 05%Tween-20)加滿各孔，室溫靜置3min,棄去PBST，洗滌3次，3min/次，拍干。3)封閉各孔加入稀釋液(5%脫脂乳)，350μ 1/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育2h，洗洚 3次，3min/次，拍干。4)加樣將待待檢血清按梯度稀釋后加入包被板，100 μ 1/孔，同時設(shè)立陰陽性血清對照。置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，3min/次，拍干。5)用封閉液將HRP羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗按1:3000稀釋，ΙΟΟμΙ/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育Ih,洗滌3次，3min/次，拍干。6)顯色使用TMB單組份顯色試劑盒(TIANGEN公司產(chǎn)品)按100 μ /孔加入包被板，室溫下避光顯色20min加終止液，2M H2S04終止顯色。7)用酶聯(lián)免疫檢測儀測其在波長450nm檢測各個孔的OD值，陰性對照0D450值為N，陽性對照0D450值為P。若P/N>2. 0判為陽性。實施例3動物免疫
以上述提純的His-env融合蛋白免疫6周齡Balb/C雌性小鼠，每次每只的免疫劑量為 40ug，免疫方法為腹腔注射，共免疫四次。第一次免疫使用上述蛋白為抗原與等量弗氏完全佐劑乳化，兩周后進行二次免疫，免疫時將滅活抗原與等量弗氏不完全佐劑乳化，兩周后進行三次免疫，免疫方法及劑量同二次免疫。三次免疫一周后，小鼠眼眶采血測其效價，監(jiān)測血清抗體效價。三免兩周后，選擇效價最高的小鼠，用不加佐劑的抗原腹腔注射加強免疫一次，3d后取小鼠脾細胞與SP2/0細胞融合。實施例4 細胞融合
融合前1 2d按照常規(guī)方法制備腹腔巨噬細胞作為飼養(yǎng)細胞，將其密度調(diào)整為 2-5X IO5個/ml，按照IOOul/孔鋪入96孔板。將培養(yǎng)板放入37°C 5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。融合用免疫小鼠眼球采血，制備血清備用。按照常規(guī)方法去得小鼠脾臟，取出脂肪組織后，用無抗無血清DMEM反復(fù)沖洗脾臟。使用IOml注射器內(nèi)芯在200目細胞篩上輕輕研磨，用DMEM沖洗，使細胞充分分散，將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，SOOrpm離心lOmin，用適量的DMEM懸浮細胞，活細胞計數(shù)后備用。用無抗無血清DMEM培養(yǎng)基將處于對數(shù)生長期的SP2/0吹下，加入融合管內(nèi)；將免疫小鼠摘眼球處死，收集脾細胞懸液，加入融合管內(nèi)；IOOOrpm離心IOmin后棄上清，將融合管置手掌上來回輕輕震動以使沉淀松散。4 內(nèi)加入1 mL預(yù)熱的濃度為50%的PEG1500， 再于90s內(nèi)先慢后快加入無抗無血清DMEM培養(yǎng)基30mL，37°C溫育15min后800rpm離心 IOmin,用60mLHAT培養(yǎng)基懸浮，滴加于提前鋪入飼養(yǎng)細胞的96孔細胞培養(yǎng)板，置37°C， 5-6%C02的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5d后每個細胞培養(yǎng)孔補加原孔一半體積的新鮮配置的HAT 培養(yǎng)基，然后每天觀察SP2/0細胞和脾細胞對照孔，當(dāng)SP2/0細胞和脾細胞全部死亡時，用新鮮配制的HT培養(yǎng)基全部置換出HAT培養(yǎng)基。逐日觀察，待融合的雜交瘤細胞生長至孔底十分之一，且上清變黃時進行檢測。實施例5 陽性克隆的篩選與亞克隆克隆的篩選主要采用如下3種方法
(1)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)
使用純化得到的Hi s-env包被ELISA板，25ng/孔，以免疫小鼠血清為陽性對照，未免疫昆明小鼠血清為陰性對照。HRP標(biāo)記羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗按說明書使用。具體方法如下 1)包被取純化的重組蛋白His-env，以碳酸鹽緩沖液(每200ml碳酸鹽緩沖液含 Na2CO3 0. 32g，NaHCO3 0. 58g)稀釋至最佳濃度，包被反應(yīng)板，100 μ 1/孔，4°C過夜。2)洗滌甩去酶標(biāo)板中的包被液，用PBST (PBS，0. 05%Tween-20)加滿各孔，室溫靜置3min,棄去PBST，洗滌3次，3min/次，拍干。3)封閉各孔加入稀釋液(5%脫脂乳)，350μ 1/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育2h，洗洚 3次，3min/次，拍干。4)加樣將待待檢血清按梯度稀釋后加入包被板，100 μ 1/孔，同時設(shè)立陰陽性血清對照。置37°C培養(yǎng)箱孵育lh，洗滌3次，3min/次，拍干。5)用封閉液將HRP羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗按1:3000稀釋，ΙΟΟμΙ/孔，置37°C培養(yǎng)箱孵育Ih,洗滌3次，3min/次，拍干。6)顯色使用TMB單組份顯色試劑盒(TIANGEN公司產(chǎn)品)按100 μ /孔加入包被板，室溫下避光顯色20min加終止液，2M H2SO4終止顯色。7)用酶聯(lián)免疫檢測儀測其在波長450nm檢測各個孔的OD值，陰性對照OD45tl值為 N，陽性對照OD450值為P。若P/N>2. 0判為陽性。(2)間接免疫熒光檢測法(IFA)
使用DF-I細胞，鋪入96孔細胞培養(yǎng)板，使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)待細胞長成單層時接種REV SNV毒株，37°C作用池后，更換含1%胎牛血清的DMEM，維持7天后做IFA 檢測，步驟如下
倒出細胞培養(yǎng)液，用PBS洗3次每次:3min ；丙酮乙醇(3:2)固定細胞7-8 min，用PBS 洗3次，每次5min ；以細胞培養(yǎng)上清為一抗按100 μ L/孔加入，37°C溫箱撫育60 min,用PBS 洗3次，每次5min ；以FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，37°C溫箱60 min,用PBS洗3次，每次 5min ；每孔加入100 μ 1 50%甘油；倒置熒光顯微鏡下觀察，拍照，其結(jié)果如圖5所示，陽性細胞膜及細胞漿應(yīng)出現(xiàn)綠色熒光。
(3) Western-blot 檢測法
1)取ImL誘導(dǎo)表達的菌液，12000r/min，離心anin，棄上清，加100 μ 1滅菌雙蒸水，懸浮沉淀，加100 μ 1 2χ上樣緩沖液，煮沸5-lOmin。取20 μ 1/孔加樣，進行SDS-PAGE電泳。2)剪一張與凝膠大小相同的NC膜，用去離子水浸透，同時將與凝膠大小相同的兩張濾紙及纖維墊用轉(zhuǎn)印緩沖液浸透。3)按三明治法安裝轉(zhuǎn)印裝置，即負極夾-纖維墊-濾紙-凝膠-NC膜-濾紙-纖維墊-正極夾，使NC膜位于轉(zhuǎn)印的正極面，凝膠位于負極面，其間無任何氣泡間隙。將轉(zhuǎn)印裝置放入轉(zhuǎn)移電泳儀中，加入轉(zhuǎn)移緩沖液，140mA電泳池。4)轉(zhuǎn)印結(jié)束后，將轉(zhuǎn)移后的NC膜用去離子水漂洗一遍，將NC膜浸泡于封閉液中， 4°C封閉過夜。5)用PBST洗滌NC膜三遍，每次10 min。7)使用免疫小鼠陽性血清為一抗，NC膜與一抗37°C反應(yīng)lh，用PBST洗膜三次，10 min/ 次。8)NC膜置于過HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG中，37°C反應(yīng)lh，用PBST洗膜三次，10 min/ 次。9)使用DAB顯色試劑盒避光顯色；此時應(yīng)密切觀察顯色過程，并在較淺本底且達到適當(dāng)顯色強度時流水終止顯色。在45KD處應(yīng)出現(xiàn)特異的雜交帶，拍照結(jié)果如圖6所示，保存。
權(quán)利要求
1.一種禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒囊膜蛋白的單克隆抗體，其特征在于是由保藏號為CGMCC NO 5019的雜交瘤產(chǎn)生的。
2.如權(quán)利要求1所述的單克隆抗體的制備方法，其特征在于該方法是純化后的原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白免疫Balb/C小鼠，經(jīng)瘤細胞SP2/0與被免疫小鼠的脾細胞融合，篩選和克隆得到禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒囊膜蛋白的單克隆抗體，簡稱單抗1。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的篩選方法為將純化后的原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白與該單抗1在體外結(jié)合，采用酶聯(lián)免疫吸附方法篩選REV His-env的單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的篩選方法為將純化后的原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白與該單抗1在體外結(jié)合，采用轉(zhuǎn)印免疫印跡方法確定與抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的蛋白分子量，進一步篩選REV His-env的單克隆抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的篩選方法為將REV SNV標(biāo)準(zhǔn)株病毒接種DF-I細胞，使該單抗1與病毒結(jié)合，采用間接免疫熒光篩選REV His-env的單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的純化后的原核表達產(chǎn)物 His-env融合蛋白是通過如下方法獲得的將REV SNV標(biāo)準(zhǔn)株的env基因克隆入表達載體 pET-28a質(zhì)粒，得到了重組載體pETj8a-env重組質(zhì)粒，使用0. 4mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達出了帶有His標(biāo)簽的融合蛋白His-env，其分子量為45KD，之后采用SDS-PAGE法檢測純化。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述的erw基因其基因序列如SEQ ID NO. 1 所示。
全文摘要
本發(fā)明屬于分子免疫學(xué)和病毒學(xué)交叉技術(shù)領(lǐng)域，具體選取了禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥病毒(REV)env基因相對保守區(qū)域共1200bp的基因片段，該片段表達的400個氨基酸包涵了REV病毒90%以上的抗原位點，這樣既保留了病毒絕大部分的抗原位點又排除了因基因變異帶來的干擾，利用含有該保守基因片段的env基因獲得原核表達產(chǎn)物His-env融合蛋白，免疫Balb/C小鼠，經(jīng)瘤細胞SP2/0與被免疫小鼠的脾細胞融合，篩選和克隆得到REVENV蛋白的單克隆抗體，該單克隆抗體為禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生癥的診斷預(yù)防及科學(xué)研究提供技術(shù)支撐。
文檔編號C12N15/34GK102304180SQ201110284909
公開日2012年1月4日 申請日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者于琳琳, 姜艷萍, 張利, 成子強, 王峰, 王曉偉, 王桂花, 王玥, 陳洪博 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)