專(zhuān)利名稱(chēng)：一種酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突變體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域；更具體地，本發(fā)明涉及一種酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突變體及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
青蒿素是中國(guó)科學(xué)家首次從青蒿(Artemisia annua)中分離鑒定的一種含過(guò)氧橋的倍半萜內(nèi)酯，是目前最有效的治療腦型瘧疾和抗氯喹惡性瘧疾的藥物。以青蒿素為基礎(chǔ)的綜合療法已受到世界衛(wèi)生組織和西方國(guó)家的確認(rèn)和推薦。青蒿中青蒿素含量低(0. 01-1 %干重)，且受品種和地域性種植影響大，資源緊缺。在青蒿素生物合成中，倍半職成分紫穗槐二烯(Amorphadiene, Amorpha-4,11-diene)由青蒿中的紫穗槐二烯合酶(amorpha-4,11-diene synthase ；ADS)催化 FPP 環(huán)化形成，它是青蒿酸和青蒿素生物合成的共同前體。增加紫穗槐二烯的產(chǎn)量可以促進(jìn)青蒿酸和青蒿素的合成和積累。人工全合成青蒿素工藝復(fù)雜、成本高。因此，目前世界上青蒿素原料主要依靠從野生和栽培青蒿中直接提取。青蒿素生物合成途徑研究近年來(lái)取得許多進(jìn)展，已經(jīng)克隆了紫穗槐二烯合酶(ADS)、青蒿酸合成酶(CYP71AV1)和青蒿醛還原酶Dbr2。科學(xué)家們利用代謝工程技術(shù)嘗試通過(guò)微生物發(fā)酵合成青蒿素前體青蒿酸，然后通過(guò)有機(jī)半合成生產(chǎn)青蒿素，以降低青蒿素的生產(chǎn)成本。2006年，Jay Keasling對(duì)酵母菌進(jìn)行了遺傳工程改造，使之產(chǎn)生出高水平的青蒿酸。目前認(rèn)為，利用微生物生產(chǎn)青蒿酸是一個(gè)切實(shí)可行的方法，可以降低青蒿素的生產(chǎn)成本。另外，也可以通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物過(guò)量表達(dá)青蒿素生物合成的相關(guān)基因，以期提高代謝產(chǎn)物的含量。發(fā)酵工程菌種的遺傳改造需要將青蒿酸生物合成途徑中的基因ADS和CYP701AV1整合到工程酵母或者工程細(xì)菌染色體中。并且，ADS的酶活性直接關(guān)系到青蒿酸的生物合
成的產(chǎn)量。因此，如何有效地提高ADS的酶活性是本領(lǐng)域需要深入研究的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突變體及其應(yīng)用。在本發(fā)明的第一方面，提供一種突變型紫穗槐二烯合酶，其對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO 2(野生型)氨基酸序列的第399位由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。在另一優(yōu)選例中，該蛋白是(a)具有SEQ ID NO :3(突變型)所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)(如1-20個(gè) ’較佳地1-10個(gè)；更佳地1-5個(gè)；更佳地1-3個(gè))氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且該蛋白的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO 3第399位位置的氨基酸為絲氨酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種分離的多核苷酸，該多核苷酸選自下組
(i)編碼所述的突變型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或(ii)與(i)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO 3所示氨基酸序列的多肽。在本發(fā)明的另一方面，提供一種載體，它含有所述的多核苷酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，它含有所述的載體，或基因組中整合有所述的多核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞是酵母、細(xì)菌或植物細(xì)胞。更優(yōu)選地，所述的宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)突變型紫穗槐二烯合酶的方法，包括步驟
(I)培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；和(2)從培養(yǎng)物中分離突變型紫穗槐二烯合酶。在本發(fā)明的另一方面，提供所述的突變型紫穗槐二烯合酶的用途，用于生產(chǎn)紫穗槐二烯和/或青蒿酸。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)紫穗槐二烯的方法，所述的方法包括利用所述的突變型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)環(huán)化,從而獲得紫穗槐二烯。在另一優(yōu)選例中，所述的突變型紫穗槐二烯合酶催化FPP環(huán)化在胞內(nèi)或胞外進(jìn)行。在另一優(yōu)選例中，所述的突變型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸環(huán)化在胞內(nèi)進(jìn)行，包括步驟將所述的突變型紫穗槐二烯合酶的編碼基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞，從而生產(chǎn)紫穗槐二烯。在另一優(yōu)選例中，所述的突變型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸環(huán)化在胞內(nèi)進(jìn)行，包括步驟將所述的突變型紫穗槐二烯合酶的編碼基因以及法尼基焦磷酸產(chǎn)生酶(MVA/MEP途徑中的酶；選自但不限于乙酰輔酶A硫解酶、HMG-CoA合成酶、HMG-CoA還原酶、甲羥戊酸激酶、磷酸甲羥戊酸激酶、焦磷酸甲羥戊酸脫羧酶、IPP異構(gòu)酶、5-磷酸-D-I-脫氧木酮糖合成酶5-磷酸-D-I-脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶、異戊烯二磷酸異構(gòu)酶、5-磷酸-D-I-脫氧木酮糖合成酶、5-磷酸-D-I-脫氧木酮糖還原異構(gòu)酶、4-磷酸-2C-甲基赤蘚醇4-胞苷磷酸合酶、2C-甲基赤蘚醇4-胞苷磷酸激酶、2C-甲基赤蘚醇_2，4-焦磷酸合酶、I-羥基-2-甲基-2- 丁烯-4-焦磷酸合酶、I-羥基-2-甲基-2- 丁烯-4-焦磷酸還原酶、FPP合成酶、I-脫氧-D-木酮糖5-磷酸合酶、HMG-CoA還原酶、香葉基轉(zhuǎn)移酶等)的編碼基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞，從而生產(chǎn)紫穗槐二烯。在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)青蒿酸的方法，所述的方法包括將所述的突變型紫穗槐二烯合酶的編碼基因，法尼基焦磷酸產(chǎn)生酶(MVA/MEP途徑中的酶)編碼基因，青蒿酸合成酶編碼基因，細(xì)胞色素P450還原酶編碼基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；培養(yǎng)該細(xì)胞，從
而生產(chǎn)青蒿酸。在另一優(yōu)選例中，還包括將獲得的青蒿酸通過(guò)有機(jī)半合成生產(chǎn)青蒿素。在另一優(yōu)選例中，在25_45°C下培養(yǎng)所述的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，在35-43°C下培養(yǎng)所述的細(xì)胞；更佳地，在38-42°C下培養(yǎng)所述的細(xì)胞。
在另一優(yōu)選例中，在PH下6. 0-10. 5下培養(yǎng)所述的細(xì)胞。在另一優(yōu)選例中，在PH下8. 5-10下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；更佳地，在PH下9-10下培養(yǎng)所述的宿主細(xì)胞；最佳地為PH9. 8。本發(fā)明的其它方面由于本文的公開(kāi)內(nèi)容，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


圖1、ADS及突變克隆的序列對(duì)比結(jié)果。從結(jié)果中可以看出，399位氨基酸殘基T突變成了中性氨基酸殘基S、A、N，和帶電荷的氨基酸殘基R、D0圖2、ADS及其突變體的GC-MS圖。A-F分別代表野生型和不同突變體GC-MS圖；G和H分別代表E圖和F圖的放大圖。I顯示了 a-Gur junene (I)和Zingiberene (2)的結(jié)構(gòu)圖。其中AMO代表紫穗槐二烯。 圖3、溫度(上圖)、pH(下圖)對(duì)野生型和突變體ADS(T399S)活力的影響。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明人經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的研究，意外地獲得了一種突變型紫穗槐二烯合酶，所述的突變型紫穗槐二烯合酶在保持催化產(chǎn)物不變的情況下，酶活性大大高于野生型?；诖送瓿闪吮景l(fā)明。本發(fā)明的多肽(突變型紫穗槐二烯合酶)可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。本發(fā)明還包括突變型紫穗槐二烯合酶的片段、衍生物和類(lèi)似物。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“片段”、“衍生物”和“類(lèi)似物”是指基本上保持本發(fā)明的突變型紫穗槐二烯合酶相同的生物學(xué)功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類(lèi)似物可以是a)有一個(gè)或多個(gè)保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或ai)在一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基中具有取代基團(tuán)的多肽，或an)成熟多肽與另一個(gè)化合物(比如延長(zhǎng)多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導(dǎo)序列或分泌序列或用來(lái)純化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根據(jù)本文的定義這些片段、衍生物和類(lèi)似物屬于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員公知的范圍。在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“突變型紫穗槐二烯合酶”或“突變型紫穗槐二烯合酶蛋白”指具有突變型紫穗槐二烯合酶活性的SEQ ID NO :3序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與突變型紫穗槐二烯合酶相同功能的、SEQ ID NO :3序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè)，還更佳如1-8個(gè)、1-5個(gè)、1-3個(gè)、或1-2個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以?xún)?nèi)，較佳地為10個(gè)以?xún)?nèi)，更佳地為5個(gè)以?xún)?nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括突變型紫穗槐二烯合酶的活性片段和活性衍生物。但是，這些變異形式中，對(duì)應(yīng)于SEQ ID N0:2氨基酸序列第399位的氨基酸為絲氨酸。多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊度條件下能與所述的突變型紫穗槐二烯合酶DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗突變型紫穗槐二烯合酶的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含突變型紫穗槐二烯合酶或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長(zhǎng)的多肽外，本發(fā)明還包括了突變型紫穗槐二烯合酶蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有突變型紫穗槐二烯合酶序列的至少約20個(gè)連續(xù)氨基酸，通常至少約30個(gè)連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個(gè)連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個(gè)連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個(gè)連續(xù)氨基酸。 發(fā)明還提供突變型紫穗槐二烯合酶或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與所述的突變型紫穗槐二烯合酶的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如P、Y-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。但是，這些多肽類(lèi)似物中，對(duì)應(yīng)于SEQ IDNO 2氨基酸序列第399位的氨基酸為絲氨酸。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本發(fā)明中，“突變型紫穗槐二烯合酶的保守性變異多肽”指與SEQ ID NO 3的氨基酸序列相比，有至多20個(gè)，較佳地至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)，最佳地至多3個(gè)(如I個(gè)、2個(gè)或3個(gè))氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表I進(jìn)行氨基酸替換而產(chǎn)生。表I
權(quán)利要求
1.一種突變型紫穗槐二烯合酶，其對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2氨基酸序列的第399位由蘇氨酸突變?yōu)榻z氨酸。
2.如權(quán)利要求I所述的蛋白，其特征在于，該蛋白是 (a)具有SEQID NO 3所不的氣基酸序列的蛋白；或 (b)由(a)所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且保留(a)蛋白活性的由(a)衍生的蛋白；且該蛋白的氨基酸序列中對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :3第399位上的氨基酸為絲氨酸。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸選自下組 (i)編碼權(quán)利要求I或2所述的突變型紫穗槐二烯合酶蛋白的多核苷酸；或 (ii)與(i)中的多核苷酸互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQIDNO 3所示氨基酸序列的多肽。
5.—種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸。
6.一種遺傳工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體，或基因組中整合有權(quán)利要求3或4所述的多核苷酸。
7.—種生產(chǎn)突變型紫穗槐二烯合酶的方法，其特征在于，包括步驟 (1)培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，獲得培養(yǎng)物；和 (2)從培養(yǎng)物中分離突變型紫穗槐二烯合酶。
8.權(quán)利要求I所述的突變型紫穗槐二烯合酶的用途，用于生產(chǎn)紫穗槐二烯和/或青蒿酸。
9.一種生產(chǎn)紫穗槐二烯的方法，其特征在于，所述的方法包括利用權(quán)利要求I所述的突變型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸環(huán)化，從而獲得紫穗槐二烯。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的突變型紫穗槐二烯合酶催化法尼基焦磷酸環(huán)化在胞內(nèi)進(jìn)行，包括步驟將權(quán)利要求I所述的突變型紫穗槐二烯合酶的編碼基因轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，培養(yǎng)該細(xì)胞，從而生產(chǎn)紫穗槐二烯。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，還在所述的宿主細(xì)胞中轉(zhuǎn)化法尼基焦磷酸產(chǎn)生酶的編碼基因。
12.—種生產(chǎn)青蒿酸的方法，其特征在于，所述的方法包括將權(quán)利要求I所述的突變型紫穗槐二烯合酶的編碼基因，法尼基焦磷酸產(chǎn)生酶的編碼基因，青蒿酸合成酶編碼基因，細(xì)胞色素P450還原酶編碼基因轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞；培養(yǎng)該細(xì)胞，從而生產(chǎn)青蒿酸。
13.如權(quán)利要求7、9-12任一所述的方法，其特征在于，在25-45°C下培養(yǎng)所述的細(xì)胞。
14.如權(quán)利要求7、9-12任一所述的方法，其特征在于，在PH下6.0-10. 5下培養(yǎng)所述的細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種酶活性提高的青蒿紫穗槐二烯合酶突變體及其應(yīng)用。所述的紫穗槐二烯合酶突變體在保持催化產(chǎn)物不變的情況下，酶活性大大高于野生型。與傳統(tǒng)方法相比，采用本發(fā)明的青蒿紫穗槐二烯合酶突變體酶促生產(chǎn)青蒿素的效率高且成本低。
文檔編號(hào)C12P17/18GK102732499SQ20111028501
公開(kāi)日2012年10月17日 申請(qǐng)日期2011年9月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月2日
發(fā)明者李建戌, 楊長(zhǎng)青, 毛穎波, 洪高潔, 王凌健, 胡文利, 阮菊新, 陳曉亞 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院