專利名稱：基因突變和hiv-1耐藥突變位點(diǎn)檢測(cè)方法及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及PCR技術(shù)、反向雜交技術(shù)和單核苷酸延伸標(biāo)記技術(shù)。
背景技術(shù)：
據(jù)中國(guó)衛(wèi)生部統(tǒng)計(jì)結(jié)果，截至2010年，全國(guó)累計(jì)報(bào)告人獲得性免疫缺陷病毒 (Human Immunodeficiency Virus, HIV)感染者禾口艾滋病(Acquired Immunodeficiency Syndrome, AIDS)病人約75萬(wàn)例，全國(guó)每年有大量的艾滋病感染者接受免費(fèi)高效聯(lián)合抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(HighlyActive Antiretroviral Therapy, HAART)治療，HAART 治療能夠有效控制病毒復(fù)制，延長(zhǎng)患者的生命，大大地降低HIV/AIDS相關(guān)疾病的發(fā)病率和病死率。但是HIV 耐藥性的出現(xiàn)卻極大地限制了抗病毒治療的效果。選擇一個(gè)能最大限度地抑制HIV-I復(fù)制的藥物治療方案已成為一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的任務(wù)。因此，了解HIV感染者病毒耐藥變異情況， 有針對(duì)性的選擇抗病毒藥物組合，成為艾滋病治療工作中的一個(gè)重要內(nèi)容。HIV-I逆轉(zhuǎn)錄酶的不忠實(shí)性復(fù)制會(huì)造成錯(cuò)誤堿基的摻入，同時(shí)逆轉(zhuǎn)錄酶不具備校正功能，所以在病毒復(fù)制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量變異。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，每天艾滋病人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大約IO7 IO8子代病毒，逆轉(zhuǎn)錄酶的錯(cuò)配幾率約為3. 4X IO5/堿基。HIV基因全長(zhǎng)約10kb， 因此每天會(huì)產(chǎn)生IO4 IO5個(gè)單點(diǎn)突變。在數(shù)量眾多的突變中，對(duì)抗病毒藥物具有抵抗作用的基因突變株在藥物選擇壓力下逐漸成為優(yōu)勢(shì)病毒株，會(huì)導(dǎo)致病毒學(xué)治療失敗，進(jìn)而發(fā)展成免疫學(xué)失敗，最終導(dǎo)致臨床失敗。研究證明，根據(jù)耐藥檢測(cè)結(jié)果選擇抗病毒治療方案可有效地降低病毒載量，升高CD4細(xì)胞含量，從而極大地改善HIV-I感染者抗病毒治療的效果。 1999年耐藥性協(xié)作研究組(Resistance Collaborative Group,RCG)的一項(xiàng)用藥方案與病毒耐藥基因型表型之間關(guān)系的研究結(jié)果表明，有針對(duì)性的對(duì)基因型或表型預(yù)測(cè)失敗者更改用藥方案可以使治療失敗率降低30% 50%。因而在抗病毒治療的過(guò)程中對(duì)每一個(gè)患者進(jìn)行耐藥突變檢測(cè)是提高治療效果、延長(zhǎng)病人生命、降低發(fā)病率和病死率的重要手段。目前HIV耐藥檢測(cè)方法主要有3種基因型耐藥檢測(cè)(GART)、表型耐藥檢測(cè) (PART)和虛擬耐藥檢測(cè)(virtual phenotype，vPT)。傳統(tǒng)的基因型耐藥檢測(cè)以核酸序列測(cè)定為基礎(chǔ)，首先通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出HIV的蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因的核酸序列，然后與參比毒株的核酸序列比較了解耐藥位點(diǎn)是否發(fā)生變異。以RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序?yàn)榛A(chǔ)的檢測(cè)方法準(zhǔn)確性高、信息全面，是HIV耐藥臨床檢測(cè)金標(biāo)準(zhǔn)。但是測(cè)序方法存在如下缺點(diǎn)檢測(cè)靈敏度不高，一般要求檢測(cè)樣本病毒拷貝數(shù)> lOOOcp/ml ；分辨率低，不能檢出相對(duì)含量小于20%的病毒突變株；不能直接提供耐藥信息，且無(wú)法定量；由于耐藥位點(diǎn)變異多且較為分散，需要同時(shí)進(jìn)行多個(gè)測(cè)試反應(yīng)。HIV耐藥位點(diǎn)表型檢測(cè)首先需要對(duì)HIV感染者進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)，然后再進(jìn)行藥物敏感實(shí)驗(yàn)。近年來(lái)出現(xiàn)了利用重組病毒進(jìn)行HIV-I表型耐藥檢測(cè)。該方法主要是將HIV感染者體內(nèi)的病毒蛋白酶和逆轉(zhuǎn)錄酶基因插入載體，同時(shí)與骨架質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞包裝重組病毒，應(yīng)用重組病毒進(jìn)行耐藥表型檢測(cè)。表型檢測(cè)具有如下優(yōu)點(diǎn)可以對(duì)病毒耐藥情況進(jìn)行定量分析；對(duì)B亞型和非B亞型均可進(jìn)行分析；可以檢測(cè)病毒序列中所有突變的作用，結(jié)果易于解釋。但是表型檢測(cè)由于受到價(jià)格昂貴、周期長(zhǎng)、生物安全級(jí)別要求高等缺點(diǎn)很難大范圍推廣使用。虛擬表型檢測(cè)首先需要建立基因型和表型之間的對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)對(duì)比測(cè)序結(jié)果，在數(shù)據(jù)庫(kù)找出與感染者體內(nèi)病毒序列相同或相似的序列，即可以給出藥物敏感的參考意見(jiàn)。虛擬表型分析的可靠性依賴于數(shù)據(jù)庫(kù)資料的準(zhǔn)確性，要求隨時(shí)更新耐藥位點(diǎn)與表型之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系。但是虛擬表型檢測(cè)仍然需要進(jìn)行序列測(cè)定，同樣受到基因型檢測(cè)適用范圍的限制。許多研究表明，各種表型耐藥檢測(cè)和基因型耐藥檢測(cè)的結(jié)果具有較高的一致性，并提出用基因型代替表型耐藥檢測(cè)。無(wú)論是表型檢測(cè)還是基因型檢測(cè)目前只能在有條件的實(shí)驗(yàn)室中小范圍使用，因此研發(fā)一種實(shí)驗(yàn)周期短，準(zhǔn)確性好，靈敏度高，同時(shí)能夠進(jìn)行多位點(diǎn)檢測(cè)，價(jià)格便宜，能夠在基層醫(yī)療單位使用的耐藥檢測(cè)試劑在艾滋病防治工作中具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因突變的方法和一種HIV-I耐藥突變位點(diǎn)基因檢測(cè)試劑盒。此方法整合了基因擴(kuò)增、反向雜交和單核苷酸延伸標(biāo)記技術(shù)。本發(fā)明的第一方面提供一種可以同時(shí)檢測(cè)多種基因突變的檢測(cè)方法，該方法通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)1)按照突變位點(diǎn)的堿基將突變位點(diǎn)分為A/T/C/G四組；2)設(shè)計(jì)探針，探針序列3’末端與突變位點(diǎn)相鄰但不包括突變位點(diǎn)，將探針按照檢測(cè)位點(diǎn)的分組固定在雜交芯片的四個(gè)獨(dú)立分區(qū)上；’3)多重PCR獲得含有待檢測(cè)基因突變位點(diǎn)的核酸片段；4)將反應(yīng)3)獲得的基因片段按照突變位點(diǎn)的分組分別與含有不同探針的芯片進(jìn)行雜交；5)雜交結(jié)束后將含有標(biāo)記物的四種核苷酸分別加入到芯片上，在DNA合成酶的作用下進(jìn)行單核苷酸延伸；6)通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物判斷待檢測(cè)基因中是否含有突變位點(diǎn)。在一個(gè)實(shí)施方案中步驟3)中的擴(kuò)增引物Tm值控制在M_56°C ；在另一個(gè)實(shí)施方案中步驟2)中的探針Tm值控制在42-45°C ；在另一個(gè)實(shí)施方案中步驟2、中的探針序列3’末端與突變位點(diǎn)相鄰但不包括突變位點(diǎn)，雜交后探針可以作為延伸引物；在另一個(gè)實(shí)施方案中，待檢測(cè)突變位點(diǎn)針對(duì)HIV耐藥突變位點(diǎn)M184V、M41L、K70R、 T215Y、D67N、K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I中的一個(gè)或多個(gè)(氨基酸位置編號(hào)根據(jù) GenBank :K03455. 1)在另一個(gè)實(shí)施方案中常規(guī)克隆的方法制備以上耐藥突變位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；本發(fā)明所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向書(shū)寫。本發(fā)明還涉及一種用于檢測(cè)HIV耐藥突變位點(diǎn)的寡核苷酸引物對(duì)和探針的組合物。本發(fā)明的另一方面是提供一種HIV耐藥突變位點(diǎn)M184V、M41L、K70R、T215Y、D67N、 K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I的一個(gè)或多個(gè)的檢測(cè)試劑盒，包括擴(kuò)增引物、雜交芯片、生物素標(biāo)記的四種核苷酸、雜交體系和延伸體系。
在一個(gè)實(shí)施方案中，還包括聚合酶及其緩沖液。優(yōu)選地，所述聚合酶為Taq酶。本發(fā)明的顯著特點(diǎn)是高靈敏度和高分辨率，反向雜交結(jié)合標(biāo)記延伸的方法可以檢測(cè)出的突變基因；同時(shí)操作步驟相對(duì)簡(jiǎn)單，可以在一個(gè)工作日內(nèi)完成。


圖1是HIV耐藥突變位點(diǎn)分布情況。黃色部分為延伸dATP區(qū)域；綠色部分為延伸 dCTP區(qū)域；藍(lán)色部分延伸dGTP區(qū)域；紅色部分為延伸dUTP區(qū)域，在檢測(cè)過(guò)程中，四個(gè)區(qū)域分別加相應(yīng)的底物，顯色后通過(guò)顯色點(diǎn)的有無(wú)判斷是否存在某一種突變位點(diǎn)。圖2為檢測(cè)質(zhì)粒樣品的檢測(cè)結(jié)果。如圖所示，雜交膜上的特定位置與某一種突變相互對(duì)應(yīng)，如圖2中V32I所顯示，在第一排第二列的顯色點(diǎn)表明檢測(cè)樣品中含有V32I的突變，而沒(méi)有其他突變體存在。
具體實(shí)施例方式下列實(shí)施例中的常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法，參見(jiàn)Sambrook等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(北京科學(xué)出版社，2002)，儀器的使用參照儀器操作說(shuō)明書(shū)。實(shí)施例1多重RT-PCR引物設(shè)計(jì)根據(jù)所選擇的12種待檢HIV耐藥突變附近的基因序列，設(shè)計(jì)出特異的針對(duì)目標(biāo)基因的擴(kuò)增引物，擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)區(qū)域在中國(guó)主要流行HIV病毒株的相對(duì)保守位置。首先根據(jù)在HIV基因序列上的位置將待檢測(cè)的耐藥突變位點(diǎn)分為3組，然后分別對(duì)3組序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使擴(kuò)增產(chǎn)物包含待檢測(cè)的突變位點(diǎn)；如果引物序列對(duì)應(yīng)基因序列存在較多基因多態(tài)性，則在相應(yīng)的序列上設(shè)計(jì)定向簡(jiǎn)并，以便對(duì)中國(guó)主要流行株都能高效擴(kuò)增。同時(shí)針對(duì)人 β actin基因設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增引物，在引物5’端標(biāo)記生物素，作為檢測(cè)方法的內(nèi)參照。本發(fā)明設(shè)計(jì)的針對(duì)所述12個(gè)待檢HIV耐藥突變位點(diǎn)的擴(kuò)增引物參見(jiàn)表1，探針序列參見(jiàn)表2。表1 :12個(gè)待檢HIV耐藥突變位點(diǎn)和參照基因的擴(kuò)增引物。
權(quán)利要求
1.一種能夠檢測(cè)單核苷酸突變的方法，其特征包括1)通過(guò)PCR擴(kuò)增含有單核苷酸突變位點(diǎn)的基因片段；2)雜交探針探針與擴(kuò)增片段互補(bǔ)，探針3’端最后一個(gè)堿基位于突變位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，所有探針退火溫度控制在42至45攝氏度；3)雜交探針固定在雜交膜的特定位置；4)雜交探針能夠作為引物在DNA聚合酶的作用下延伸；5)探針延伸到堿基即為檢測(cè)的突變位點(diǎn)；6)雜交膜分為4個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)區(qū)間，每個(gè)反應(yīng)區(qū)間分別加入不同的標(biāo)記的dNTP或 ddNTP ；7)延伸反應(yīng)在雜交膜上進(jìn)行；8)用四種不同標(biāo)記物分別標(biāo)記dATP、dCTP、dGTP、dUTP時(shí)，延伸反應(yīng)也可以在同一個(gè)雜交膜上進(jìn)行；9)雜交的固相載體可以是尼龍膜、硝酸纖維素膜等膜，也可以是玻璃芯片或其他高聚物；10)通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物判斷樣品中是否含有特定的單核苷酸突變。
2.一種能夠檢測(cè)HIV耐藥突變位點(diǎn)的RT-PCR方法，其特征包括1)通過(guò)文獻(xiàn)檢索確定HIV-I耐藥主要突變位點(diǎn)為M184V、M41L、K70R、T215Y、D67N、 K103N、Y181C、K65R、I47A、L76V、V32I 其中之一或多個(gè)；2)用序列分析軟件分析序列并設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物；3)設(shè)計(jì)捕獲探針，探針與擴(kuò)增片段互補(bǔ)，探針3’端最后一個(gè)堿基位于突變位點(diǎn)的前一個(gè)堿基，所有探針退火溫度控制在44至46攝氏度；4)使用常規(guī)克隆的方法制備耐藥突變位點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；5)摸索探針點(diǎn)樣濃度對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響；6)優(yōu)化RT-PCR體系；7)建立延伸反應(yīng)體系；8)對(duì)建立的方法進(jìn)行靈敏度和特異性考核；9)臨床考核并與其他方法進(jìn)行對(duì)比。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)HIV耐藥突變位點(diǎn)的RT-PCR方法，其特征在于所述的特異性擴(kuò)增引物如SEQ ID NO 1-13所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測(cè)HIV耐藥突變位點(diǎn)的RT-PCR方法，其特征在于所述的捕獲探針如SEQ ID NO 14-25所示。
5.用于延伸反應(yīng)的單核苷酸用任意一種生物素或熒光素標(biāo)記，可選自FAM、VIC,HEX、 JOE、NED、TAMRA、CY3、ROX 或 CY5。
6.一種用于檢測(cè)HIV耐藥突變位點(diǎn)的寡核苷酸引物對(duì)和探針的組合物。
7.一種包括權(quán)利要求5所述組合物的試劑盒。
8.權(quán)利要求6的試劑盒在檢測(cè)HIV耐藥突變位點(diǎn)的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種HIV-1耐藥突變位點(diǎn)基因檢測(cè)方法、試劑盒和應(yīng)用，公開(kāi)了用于基因突變特別是HIV-1耐藥突變位點(diǎn)基因檢測(cè)的核苷酸引物、探針序列及方法，以及該方法在臨床上檢測(cè)HIV-1耐藥突變位點(diǎn)中的應(yīng)用。本發(fā)明的方法具有快速簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、敏感性高、可靠性好的特點(diǎn)，適于HIV-1耐藥突變位點(diǎn)的快速檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102312004SQ20111028559
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年9月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月23日
發(fā)明者張曉光, 曾毅, 馬晶 申請(qǐng)人:張曉光, 曾毅