專(zhuān)利名稱(chēng)：一種防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑cb28合劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28 合劑。
背景技術(shù)：
黃瓜是全球十大蔬菜栽培作物之一，在我國(guó)“菜籃子”工程中占有重要地位。其葉部病害很多，其中以霜霉病危害最重。因此，研究和防治日光大棚黃瓜病害刻不容緩。在黃瓜葉部病害中，霜霉病是極易發(fā)生的，一旦發(fā)生，面積大、流行性強(qiáng)，危害嚴(yán)重，防治上難度較大，是黃瓜日光大棚生產(chǎn)中最主要的一大病害。
ΙΙβ^Ι^ ' Efines· (Psedoperonspora cubensis (Berkis Curt) Rostov) 引起的一種真菌病害，在各地普遍發(fā)生。病菌的孢子囊可隨風(fēng)雨、黃瓜甲蟲(chóng)、農(nóng)器具等進(jìn)行傳播，是一種主要的氣傳病害；且為專(zhuān)性寄生菌，對(duì)寄主植物的專(zhuān)化選擇性很強(qiáng)。隨著我國(guó)日光大棚面積急劇增加，反季節(jié)黃瓜大棚栽培種植大量突現(xiàn)，合適的溫濕度等條件，給霜霉病病菌的越冬、傳播帶來(lái)有利條件，一年四季侵染黃瓜，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，全葉呈黃褐色干枯，最后導(dǎo)致植株干枯早死，縮短收瓜期，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量，損失可達(dá)20 % 到60%，是影響產(chǎn)量的主要制約因素之一。目前，對(duì)日光大棚黃瓜種植而言，控制此病害主要依靠化學(xué)藥劑，但是其發(fā)生期的預(yù)測(cè)預(yù)報(bào)精確度不高，很難在防治時(shí)間點(diǎn)上適期用藥，通常做法是不管發(fā)病與否，用藥次數(shù)急劇增加至每周一次，用藥量也急劇增加，藥劑種類(lèi)選擇也無(wú)法游刃有余，大多是一些保護(hù)類(lèi)化學(xué)藥劑如霜脲·錳鋅WP、啞酮·霜脲氰水分散粒劑、代森錳鋅·霜脲氰WP、氟菌·霜霉威懸浮劑等。另外化學(xué)藥劑的成倍使用，使得農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)易遭到嚴(yán)重破壞，收獲后的黃瓜農(nóng)藥殘留嚴(yán)重，給人們健康帶來(lái)不可忽視的嚴(yán)重威脅。同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥不易降解，高殘留，對(duì)人、畜的安全性都嚴(yán)重限制了在將來(lái)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的使用。因此，非化學(xué)性防治措施目前已成為防治黃瓜病害的核心方式，而生物防治則為其中最有前途的方法。由此可見(jiàn)，開(kāi)發(fā)新的、更為高效和安全的微生物殺菌劑控制黃瓜霜霉病是提高社會(huì)生產(chǎn)總量的需要，同時(shí)更是農(nóng)業(yè)安全及可持續(xù)發(fā)展的需要，符合社會(huì)發(fā)展需求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)利用生物防治解決農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中黃瓜霜霉病防治難度大，成本高，而化學(xué)農(nóng)藥抗性日益突出，農(nóng)藥殘留高等問(wèn)題提供一種防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑，該CB28合劑對(duì)黃瓜霜霉病防效為62. 00%以上。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑，含兩種有效細(xì)菌成分分別是巨大芽孢桿菌(Bacillus meqaterium)BS13，于2011年04月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0. 4734;腸桿菌(Enterobacter sp.)BJN15，于2011年04月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4733 ；該合劑中所述的保藏號(hào)為CGMCC NO. 4734的巨大芽孢桿菌 BS13與保藏號(hào)為CGMCC NO. 4733的腸桿菌BJN15的活菌數(shù)量比為1 1，總活菌總濃度為 IXlO9 10lclcfu/ml。所述的防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB^合劑的制備方法，包含如下步驟(1)種子菌液的培養(yǎng)分別將保藏號(hào)為CGMCC NO. 4734的巨大芽孢桿菌BS13和保藏號(hào)為CGMCC NO. 4733的腸桿菌BJN15接種到LB培養(yǎng)液中，在30 32°C、180 220rpm 條件下培養(yǎng)至600nm處的OD值為0. 5 0. 8之間時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，獲得種子菌液；(2)濕菌制備取步驟(1)中的種子菌液，以1 250體積比分別加入LB培養(yǎng)液中，30 32°C、180 220rpm振蕩培養(yǎng)45 48小時(shí)，然后4000rpm離心10 15min，棄上清得濕菌沉淀；(3)合劑復(fù)配分別取兩種濕菌與相應(yīng)的菌體保藏液按Ig 40ml配成兩種細(xì)菌單劑，再將兩種細(xì)菌單劑按照各菌活菌數(shù)量(CFU/ml)比1 1配成合劑。其中，步驟(3)所述的合劑中活菌總濃度為1Χ109 101(ι(3 νπι1。所述菌體保藏液配制方法為1)制備ρΗ 6. 8 10，每升含有0. 01 0. 2mol的無(wú)機(jī)鹽緩沖液或有機(jī)鹽緩沖液；2)在上述緩沖液中加入非離子型或天然物表面活性劑，至表面活性劑濃度為 0. 001 5mol/L即得菌體保藏液。所述的無(wú)機(jī)鹽緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、焦磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液；所述的有機(jī)鹽緩沖液選自甲酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、酒石酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷以及檸檬酸鹽有機(jī)緩沖液。所述的非離子型選自聚氧乙基脂肪酸酯、烷基聚氧乙基醚、Tween20等非離子型表面活性劑，天然物表面活性劑選自皂莢以及其它含有環(huán)戊烷菲基團(tuán)的天然物表面活性劑。本發(fā)明所述的CB^合劑在防治黃瓜霜霉病中的應(yīng)用。所述的CB^合劑可通過(guò)噴霧使用防治病害，也可以通過(guò)噴霧和灌根處理。有益效果本發(fā)明CB^合劑是針對(duì)黃瓜霜霉病的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒(méi)有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來(lái)的一系列問(wèn)題，因而能有效保護(hù)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，實(shí)施農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。且生產(chǎn)的黃瓜無(wú)農(nóng)藥殘留，為綠色黃瓜，食用也大可放心。同時(shí)，灌根處理的方式，也可有效控制一些土傳病害的發(fā)生，減少化學(xué)肥料的大量使用。該生防菌劑防效較高，價(jià)格較化學(xué)農(nóng)藥低，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開(kāi)支。同時(shí)，該菌劑還有促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)、增加產(chǎn)量的功能，生產(chǎn)的黃瓜質(zhì)量較好可為農(nóng)民增加收入。室內(nèi)孢子囊萌發(fā)試驗(yàn)表明，CB^合劑對(duì)霜霉病菌的孢子囊萌發(fā)有明顯的抑制作用；離體葉片試驗(yàn)顯示，CB^合劑對(duì)霜霉病的控制有明顯作用；日光大棚試驗(yàn)表明工8觀合劑能有效控制霜霉病菌對(duì)黃瓜的侵染，抑制孢子囊萌發(fā)，達(dá)到控制病情發(fā)生的效果。該菌劑用濕菌與菌體保藏液按1 40 (g/ml)配成菌劑，可室溫保存2 3年。生物樣品保藏信息巨大芽孢桿菌(Bacillus meqaterium)BS13，于2011年04月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0. 4734。
腸桿菌(Enterobacter sp. )BJN15，于2011年04月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4733。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌株來(lái)源BS13由廣東省東莞麻涌的香蕉根圍土壤中分離得到；BJN15由廣東省東莞市麻涌的香蕉假莖中分離得到。菌株分離方法平板稀釋法(中國(guó)科學(xué)院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京科學(xué)出版杜，1985.)菌株篩選依據(jù)水解五種酶活性(蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、嗜鐵素、 IAA 測(cè)定 Yang J. -H.，Liu H. X.，Zhu G. -M.，Xu L. -P.，Pan Y. -L.，and Guo J. -H.氺· 2008. Diversity analysis of antagonists from rice associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases. Journal of Applied Microbiology. 104(1) 91 104.)和對(duì)疫霉病病菌拮抗活性的測(cè)定(對(duì)峙培養(yǎng)法，林福呈，李德堡.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對(duì)植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003，33 (2) 174 177.)，通過(guò)細(xì)菌的賦值評(píng)估(Faltin等，2004)，最終選擇BS13 和BJN15作為本合劑的有效細(xì)菌成分。 菌株鑒定方法鑒定方法為16Sr DNA基因片段序列測(cè)序。表1 測(cè)序比對(duì)結(jié)果
菌株登錄號(hào)最相似菌株及登錄號(hào)相似度
BS13 HM161867Bacillus meqaterhm GUI91918.199
BJN15 HM161865Enterobacter sp. EF592491.199BS13(CGMCC NO. 4734)在PDA平板上，菌株幼齡時(shí)期菌落圓形、突起、表面光滑和有光澤、濕潤(rùn)、半透明、粘稠、易挑取。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)菌落粘性降低，表面光澤變暗，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)變成淺褐色，易挑取。營(yíng)養(yǎng)肉湯液體試管培養(yǎng)菌體聚集形成沉淀。在菌體形態(tài)上， 采用堿性復(fù)紅簡(jiǎn)單染色，顯微鏡下觀察到菌株兩端鈍圓，多以成對(duì)出現(xiàn)美蘭染色觀察，細(xì)胞內(nèi)有多個(gè)不著色的顆粒，革蘭氏染色陽(yáng)性，部分兩端著色較重，始時(shí)芽孢近端生、圓形，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，芽孢擴(kuò)大呈橢圓形，芽孢囊不膨大，無(wú)伴孢晶體。BJN15(CGMCC NO. 4733)在LB培養(yǎng)基上IOh產(chǎn)生單菌落，培養(yǎng)24h菌落乳白色，質(zhì)地均一，圓形，濕潤(rùn)，中間隆起，表面光滑，菌體為短直桿狀，G—。實(shí)施例2一種防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑，含兩種細(xì)菌成分分別是巨大芽孢桿菌 BS13 (CGMCC N0. 4734)和腸桿菌 Bjm5 (CGMCC N0. 4733)。該防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑的制備方法如下(1)種子菌液的培養(yǎng)分別將保藏號(hào)為CGMCC N0. 4734的巨大芽孢桿菌BS13和保藏號(hào)為CGMCC NO. 4733的腸桿菌BJN15接種到LB培養(yǎng)液中，在30 32°C、180 220rpm 條件下培養(yǎng)至600nm處的OD值為0. 5 0. 8之間時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，獲得種子菌液；(2)濕菌制備取步驟(1)中的種子菌液，以1 250體積比分別加入LB培養(yǎng)液中，30 32°C、180 220rpm振蕩培養(yǎng)45 48小時(shí)，然后4000rpm離心10 15min，棄上
清得濕菌沉淀；(3)菌體保藏液制備a.巨大芽孢桿菌BS13菌體保藏液的制備pH6. 8,0. 03mol/L的磷酸鹽緩沖液，向其中加入Tween20至Tween20在緩沖液中的終濃度為0. 02mol/L即得巨大芽孢桿菌BS13 的菌體保藏液。b.腸桿菌BJN15菌體保藏液的制備pH7. 0,0. 15mol/L的Tris緩沖液，向其中加入聚氧乙基脂肪酸酯至聚氧乙基脂肪酸酯在緩沖液中的終濃度為0. 01mol/L即得腸桿菌 BJNl5的菌體保藏液。(4)合劑復(fù)配取(2)中制備的巨大芽孢桿菌BS13濕菌與(3)中制備的巨大芽孢桿菌BS13菌體保藏液按Ig 40ml配成巨大芽孢桿菌BS13細(xì)菌單劑。取⑵中制備的腸桿菌BJN15濕菌與(3)中制備的腸桿菌BJN15菌體保藏液按Ig 40ml配成腸桿菌BJN15 細(xì)菌單劑。再將兩種細(xì)菌單劑按照各菌活菌數(shù)量(CFU/ml)比1 1配成合劑，合劑中活菌總濃度為lXlOtFU/ml。實(shí)施例3室內(nèi)孢子囊萌發(fā)試驗(yàn)方法玻片培養(yǎng)法(參考文獻(xiàn)NY/T 1156. 1-2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺菌劑第1部分抑制病原真菌孢子萌發(fā)試驗(yàn)凹玻片法)將按照實(shí)施例2方法制備的CB^ 合劑菌液配制成相應(yīng)濃度，分別滴加在滅菌的載玻片上，然后往菌液中滴加10 μ 1配制好的霜霉病菌孢子囊懸浮液，濃度為IO5個(gè)孢子囊/ml，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)，以滅菌的清水作為對(duì)照，置于25°C光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 后觀察孢子囊萌發(fā)率，鏡檢以視野中30個(gè)孢子囊為準(zhǔn)， 觀察標(biāo)準(zhǔn)為芽管長(zhǎng)度大于霜霉病菌孢子囊寬度的1/2，計(jì)算公式為抑制率(清水處理孢子囊萌發(fā)率-生防菌處理組孢子囊萌發(fā)率)*100/清水處理孢子囊萌發(fā)率霜霉病病原菌 Pseudoperonospora cubensis (Berkely et Curtis) Rosto wzew, 公知公用，見(jiàn)參照文獻(xiàn)“湯鈿.葡萄霜霉病離體接種方法的研究[J]微生物學(xué)通報(bào)，1994， (06).，，。病菌孢子囊懸浮液制備方法(參考文獻(xiàn)杜興蘭.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008)傍晚采集發(fā)病嚴(yán)重的新鮮黃瓜霜霉病病葉(近幾天未施過(guò)農(nóng)藥)，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室，沖去葉面上的雜物和原有的抱子囊，用浸水的脫脂棉包住葉柄，置于18°C培養(yǎng)箱中黑暗保濕培養(yǎng)，24h后待長(zhǎng)出新鮮孢子囊。用無(wú)菌水刷取新長(zhǎng)出的孢子囊，雙層紗布過(guò)濾，12000rpm 15min離心，棄去上清液，用滅菌水稀釋至IO5個(gè)孢子囊/ ml，在18°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-3h，待有大量游動(dòng)孢子囊出現(xiàn)時(shí)使用。結(jié)果顯示，CB28合劑對(duì)霜霉病菌孢子囊的萌發(fā)有明顯的抑制作用，如表2所示。表2 :CB28合劑對(duì)黃瓜霜霉病菌孢子囊抑制效果
權(quán)利要求
1.一種防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑，其特征在于含兩種有效細(xì)菌成分分別是巨大芽孢桿菌(Bacillus meqaterium)BS13，于2011年04月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4734 ；腸桿菌 (Enterobacter sp. )BJN15，于2011年04月02日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4733 ；該合劑中所述的保藏號(hào)為CGMCC NO. 4734 的巨大芽孢桿菌BS13與保藏號(hào)為CGMCC NO. 4733的腸桿菌BJN15的活菌數(shù)量比為1 1， 總活菌總濃度為IX IO9 101Qcfu/ml。
2.權(quán)利要求1所述的防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑的制備方法，其特征在于包含如下步驟(1)種子菌液的培養(yǎng)分別將保藏號(hào)為CGMCCNO. 4734的巨大芽孢桿菌BS13和保藏號(hào)為CGMCC N0. 4733的腸桿菌BJN15接種至Ij LB培養(yǎng)液中，在30 32°C、180 220rpm條件下培養(yǎng)至600nm處的OD值為0. 5 0. 8之間時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，獲得種子菌液；(2)濕菌制備取步驟(1)中的種子菌液，以1 250體積比分別加入LB培養(yǎng)液中， 30 32°C、180 220rpm振蕩培養(yǎng)45 48小時(shí)，然后4000rpm離心10 15min，棄上清得濕菌沉淀；(3)合劑復(fù)配分別取兩種濕菌與相應(yīng)的菌體保藏液按Ig 40ml配成兩種細(xì)菌單劑， 再將兩種細(xì)菌單劑按照各菌活菌數(shù)量(CFU/ml)比1 1配成合劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑的制備方法，其特征在于步驟(3)所述的合劑中活菌總濃度為IxiO9NlO1ciCfuAiltj
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑的制備方法，其特征在于，所述的菌體保藏液通過(guò)如下方法制備1)制備pH6. 8 10，每升含有0. 01 0. 2mol的無(wú)機(jī)鹽緩沖液或有機(jī)鹽緩沖液；2)在上述緩沖液中加入非離子型或天然物表面活性劑，至表面活性劑濃度為0.001 5mol/L即得菌體保藏液。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑的制備方法，其特征在于所述的無(wú)機(jī)鹽緩沖液選自磷酸鹽緩沖液、焦磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽緩沖液、硼酸鹽緩沖液；所述的有機(jī)鹽緩沖液選自甲酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、酒石酸鹽緩沖液、三羥甲基氨基甲烷以及檸檬酸鹽有機(jī)緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑的制備方法，其特征于所述的非離子型選自聚氧乙基脂肪酸酯、烷基聚氧乙基醚、Tween20，天然物表面活性劑選自皂莢以及其它含有環(huán)戊烷菲基團(tuán)的天然物表面活性劑。
7.權(quán)利要求1所述的CB28合劑在防治黃瓜霜霉病中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種防治黃瓜霜霉病的生防復(fù)合菌劑CB28合劑。CB28合劑主要由保藏號(hào)為CGMCC NO.4734的巨大芽孢桿菌BS13和保藏號(hào)為CGMCC NO.4733的腸桿菌BJN15組成。每個(gè)菌在LB培養(yǎng)液32℃200rpm振蕩培養(yǎng)18～20h，然后4000rpm離心15min，取濕菌與菌體保藏液按1∶40(g/ml)配成菌懸液。按照菌的活菌數(shù)量比1∶1配成混合制劑，合劑中活菌總濃度為1×109～1010cfu/ml。CB28合劑對(duì)黃瓜霜霉病防效為70％以上。該復(fù)合菌劑通過(guò)噴霧使用防治病害，也可以通過(guò)噴霧和根部處理同時(shí)使用。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102428964SQ20111028801
公開(kāi)日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者劉紅霞, 王云鵬, 鄭麗, 郭堅(jiān)華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)