專利名稱：一種防治溫室大棚黃瓜霜霉病的生防菌株cs23及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種防治日光大棚黃瓜霜霉病的生防菌株CS23及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
黃瓜霜霉病，俗稱“跑馬干”，是古巴假霜霉菌(Psedoperonspora cubensis (Berkis Curt) Rostov)引起的一種真菌病害，世界各地普遍發(fā)生。該病原物為專性寄生菌，對(duì)寄主植物的選擇?；院軓?qiáng)，其孢子囊可隨風(fēng)雨、黃瓜甲蟲(chóng)、農(nóng)用器具等傳播， 是一種重要的氣傳病害。隨著我國(guó)日光大棚面積急劇增加，其病菌一年四季可以侵染黃瓜；發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，全葉呈黃褐色干枯，最后導(dǎo)致植株早死，縮短收瓜期，嚴(yán)重影響黃瓜產(chǎn)量，損失可達(dá) 20 %-60%,此病害是日光大棚黃瓜產(chǎn)量的主要制約因素之一。化學(xué)農(nóng)藥的反復(fù)使用極易導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生。如1979年首次報(bào)道黃瓜霜霉菌對(duì)甲霜靈存在抗性，隨后有關(guān)其對(duì)乙磷鋁抗性的報(bào)道也出現(xiàn)。目前農(nóng)民主要依照經(jīng)驗(yàn)來(lái)噴施化學(xué)藥劑來(lái)防治這種病害，一周噴施一次化學(xué)藥劑，交替選擇不同種類藥劑。這樣雖然可以略微減輕抗藥性，但是單劑噴施的化學(xué)農(nóng)藥用量依然成遞增趨勢(shì)。同時(shí)，消費(fèi)者逐漸意識(shí)到化學(xué)農(nóng)藥殘留問(wèn)題對(duì)人體健康的影響，各界轉(zhuǎn)而開(kāi)始使用生物農(nóng)藥，如克菌康、武夷菌素、 綠盾豐、雙抗等，活體的生防菌劑主要有芽孢桿菌和假單胞類，但大多處于實(shí)驗(yàn)室研究開(kāi)發(fā)階段。且因霜霉病是活體寄生菌，大多完成簡(jiǎn)單的室內(nèi)測(cè)定試驗(yàn)，在我國(guó)主要黃瓜栽培區(qū)進(jìn)行日光溫室或者露天試驗(yàn)藥效廣譜性測(cè)試的生防研究微乎其微。綜上所述，開(kāi)發(fā)新的、更為高效和安全的微生物殺菌劑控制黃瓜霜霉病的發(fā)生是提高社會(huì)生產(chǎn)總量的需要，同時(shí)更是農(nóng)業(yè)安全及可持續(xù)發(fā)展的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中沒(méi)有對(duì)黃瓜霜霉病有較高防效的生防制劑的現(xiàn)狀，提供一種防治黃瓜霜霉病的單一生防菌菌株及其菌劑，該菌劑對(duì)其防效可達(dá)到60%以上。本發(fā)明的目的可通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種短小芽孢桿菌CS23 (Bacillus pumilus)，于2011年4月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC N0. 4735。所述的保藏號(hào)為CGMCC N0. 4735的短小芽孢桿菌CS23在防治黃瓜霜霉病中的應(yīng)用。優(yōu)選所述的保藏號(hào)為CGMCC N0. 4735的短小芽孢桿菌CS23在防治日光大棚黃瓜
霜霉病中的應(yīng)用。所述的保藏號(hào)為CGMCC N0. 4735的短小芽孢桿菌CS23制備的生防菌劑。其中，優(yōu)選該生防菌劑中保藏號(hào)為CGMCC N0. 4735的短小芽孢桿菌CS23活菌總濃度為 1 X IO9-I X 10nCFU/ml，進(jìn)一步優(yōu)選 8. 5 X 109_6· 5 X 1010CFU/ml。一種制備所述的生防菌劑的方法，將保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735的短小芽孢桿菌 CS23的種子菌液以1 500體積比接種至LB發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，32°C、180rpm培養(yǎng) 44 48h，然后離心，取沉淀即得所述的生防菌劑。所述的生防菌劑中活菌總濃度為IXIO9-IXIOiiCFUAiI,優(yōu)選 8. 5Χ109-6· 5X10lclCFU/ml。所述的離心條件為4000rpm離心15min。所述的保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735的短小芽孢桿菌CS23的種子菌液制備方法為將保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735的短小芽孢桿菌CS23菌株接種到LB培養(yǎng)液中32°C培養(yǎng)180rpm 振蕩培養(yǎng)至600nm處的OD值為0. 8時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。所述的生防菌劑稀釋100-1000倍后在日光溫室大棚黃瓜移栽后4葉期開(kāi)始進(jìn)行噴霧處理或者噴霧/灌根處理，在天氣因子適合黃瓜霜霉病流行前期，7d/10d—個(gè)間隔周期使用一次，第七天統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)在淮安丁集實(shí)驗(yàn)基地的黃瓜，噴霧處理和噴灌處理對(duì)黃瓜霜霉病的防達(dá)分別為65. 46%和60. 06%。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明是專門針對(duì)黃瓜霜霉病開(kāi)發(fā)的生防制劑。由于是生物制劑，完全沒(méi)有因化學(xué)農(nóng)藥的使用所帶來(lái)的一系列問(wèn)題，因而有利于日光大棚蔬菜的無(wú)公害生產(chǎn)，農(nóng)民可以不用或減少其他化學(xué)農(nóng)藥的用量，這不僅可為農(nóng)民節(jié)省開(kāi)支，而且減少化學(xué)藥劑的殘留，有利于蔬菜的出口。溫室實(shí)驗(yàn)表明該短小芽孢桿菌CS23(CGMCC NO. 4735)能顯著降低黃瓜霜霉病的發(fā)生。利用該菌制備的生防菌劑稀釋100倍在移栽時(shí)灌根/噴霧處理，在溫室條件下對(duì)于黃瓜霜霉病生防效果可以達(dá)65. 23%以上。生物樣品保藏信息一種短小芽孢桿菌CS23 (Bacillus pumilus)，于2011年4月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)大屯路中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1菌株來(lái)源CS23由江蘇省揚(yáng)州市黃瓜根圍土壤中分離得到。菌株分離方法平板稀釋法(中國(guó)科學(xué)院南京土壤所微生物室.土壤微生物研究法[M].北京科學(xué)出版杜，1985.)菌株篩選依據(jù)水解五種酶活性(蛋白酶、幾丁質(zhì)酶、纖維素酶、嗜鐵素、 IAA 測(cè)定 Yang J. -H.，Liu H. X.，Zhu G. -M.，Xu L. -P.，Pan Y. -L.，and Guo J. -H.氺· 2008. Diversity analysis of antagonists from rice associated bacteria and their application in biocontrol of rice diseases. Journal of Applied Microbiology. 104(1) :91 104.)和對(duì)疫霉菌頡頏作用(對(duì)峙培養(yǎng)法，林福呈，李德堡.枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)對(duì)植物病原真菌的溶菌作用[J].植物病理學(xué)報(bào)，2003， 33 (2) 174 177.)，通過(guò)細(xì)菌的賦值評(píng)估(Faltin等，2004)，最終選擇CS23作為有效細(xì)菌成分。菌株鑒定方法鑒定方法為16S r DNA基因片段序列測(cè)序。鑒定結(jié)果見(jiàn)表1 表1 測(cè)序比對(duì)結(jié)果
菌株最相似菌株相似度侈)CS23Bacillus pumilus99CS23形態(tài)學(xué)特征短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CS23為芽孢桿菌屬，菌體細(xì)桿狀，0. 6 0. 7ymX2. 0 3. 0 μ m，革蘭氏陽(yáng)性。B. pumilus存在半透明型和不透明型兩種不同的菌落形態(tài)，對(duì)兩種菌落分別進(jìn)行傳代，半透明菌落能產(chǎn)生半透明和不透明型菌落， 且基本各占一半。而不透明菌落在傳代過(guò)程中只產(chǎn)生少許的半透明菌落，且傳至第4代時(shí)半透明型菌落消失。實(shí)施例2CS23生防菌劑的制備將短小芽孢桿菌CS23 (CGMCC NO. 4735)菌株接種到LB培養(yǎng)液中32°C培養(yǎng)180rpm 振蕩培養(yǎng)I^i后，每隔在超凈工作臺(tái)中取樣測(cè)600nm處的OD值，當(dāng)OD值為0. 8時(shí)結(jié)束培養(yǎng)作為種子菌液。把種子菌液以1 500體積比接種至LB發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，32°C、 ISOrpm培養(yǎng)48h，然后4000rpm離心15min，取沉淀即得所述的CS23生防菌劑。所得生防菌劑中活菌總濃度為8. 5X 109CFU/ml。實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)室溫室試驗(yàn)本實(shí)驗(yàn)黃瓜品種采用“津優(yōu)30”。待長(zhǎng)出8片真葉時(shí)開(kāi)始噴施處理藥劑，設(shè)3個(gè)處理組，處理藥劑分別為A 用清水40倍稀釋的實(shí)施例2制備的CS23生防菌劑；B :20%霜霉威水劑；C:清水對(duì)照。每處理設(shè)4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)M棵苗。噴施處理藥劑后5d接種霜霉病菌孢子囊，濃度為IO5個(gè)孢子囊/ml，接種后8d時(shí)對(duì)照組發(fā)病。霜霉病病原菌 Pseudoperonospora cubensis (Berkely et Curtis) Rosto wzew, 公知公用，見(jiàn)參照文獻(xiàn)“湯鈿.葡萄霜霉病離體接種方法的研究[J]微生物學(xué)通報(bào)，1994， (06).，，。病菌孢子囊懸浮液制備方法(參考文獻(xiàn)杜興蘭.葡萄霜霉病和白粉病生物防治的研究[D]河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008)傍晚采集發(fā)病嚴(yán)重的新鮮黃瓜霜霉病病葉(近幾天未施過(guò)農(nóng)藥)，用冰壺帶回實(shí)驗(yàn)室，沖去葉面上的雜物和原有的孢子囊，用浸水的脫脂棉包住葉柄，置于18°C培養(yǎng)箱中黑暗保濕培養(yǎng)，24h后待長(zhǎng)出新鮮孢子囊。用無(wú)菌水刷取新長(zhǎng)出的孢子囊，雙層紗布過(guò)濾，12000rpm 15min離心，棄去上清液，用滅菌水稀釋至IO5個(gè)孢子囊/ ml，在18°C培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)2-3h，待有大量游動(dòng)孢子囊出現(xiàn)時(shí)使用。調(diào)查病害嚴(yán)重度并計(jì)算防效，生防效果為65. 23%，如表2。表2 :CS23菌劑對(duì)黃瓜霜霉病生防效果
權(quán)利要求
1.一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CS23，于2011年4月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735。
2.權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CGMCCNO. 4735的短小芽孢桿菌CS23在防治黃瓜霜霉病中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于所述的保藏號(hào)為CGMCCNO. 4735的短小芽孢桿菌CS23在防治溫室大棚黃瓜霜霉病中的應(yīng)用。
4.用權(quán)利要求1所述的保藏號(hào)為CGMCCNO. 4735的短小芽孢桿菌CS23制備的生防菌劑。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的生防菌劑，其特征在于該生防菌劑中保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735的短小芽孢桿菌CS23活菌總濃度為1 X IO9-I X 10nCFU/mL·
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的生防菌劑，其特征在于該生防菌劑中保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735的短小芽孢桿菌CS23活菌總濃度為8. 5X109-6. 5 X 10lclCFU/ml。
7.一種制備權(quán)利要求4所述的生防菌劑的方法，其特征在于將保藏號(hào)為CGMCC NO. 4735的短小芽孢桿菌CS23的種子菌液以1 500體積比接種至LB發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵培養(yǎng)，32°C、ISOrpm培養(yǎng)44 48h，然后離心，取沉淀即得所述的生防菌劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備權(quán)利要求4所述的生防菌劑的方法，其特征在于所述的生防菌劑中活菌總濃度為 IX IO9-I X IoiiCFUAiI,優(yōu)選 8. 5X109_6. 5 X 1010CFU/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備權(quán)利要求4所述的生防菌劑的方法，其特征在于所述的離心條件為4000rpm離心15min。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備權(quán)利要求4所述的生防菌劑的方法，其特征在于所述的保藏號(hào)為CGMCC N0. 4735的短小芽孢桿菌CS23的種子菌液的制備方法為將保藏號(hào)為 CGMCC N0. 4735的短小芽孢桿菌CS23菌株接種到LB培養(yǎng)液中32°C培養(yǎng)180rpm振蕩培養(yǎng)至600nm處的OD值為0. 8時(shí)結(jié)束培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，涉及一種防治溫室大棚黃瓜霜霉病的生防菌株CS23及其應(yīng)用。一種短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus FJ768456.1)CS23，于2011年4月2日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC NO.4735。用保藏號(hào)為CGMCC NO.4735的短小芽孢桿菌CS23制備的生防菌劑，其中短小芽孢桿菌CS23活菌總濃度為1×109-1×1011CFU/ml。該生防菌劑稀釋100倍后在黃瓜移栽后4葉期開(kāi)始進(jìn)行噴霧處理或者噴霧/灌根處理，對(duì)黃瓜霜霉病的防效可分別達(dá)到為66.19％和60.35％。
文檔編號(hào)C12R1/07GK102321559SQ201110288018
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年9月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月26日
發(fā)明者劉紅霞, 王云鵬, 鄭麗, 郭堅(jiān)華 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)