專利名稱：一種高效表達(dá)且易于純化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
發(fā)明涉及一種高效表達(dá)且易于純化β -甘露聚糖酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法， 屬于分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
β -甘露聚糖酶(β -mannanase EC3. 2. 1. 78)是一種半纖維素水解酶，以內(nèi)切方式降解β _1，4糖苷鍵，降解產(chǎn)物的非還原末端為甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖， 半乳甘露聚糖及甘露聚糖等，甘露聚糖酶的來源非常廣泛，包括植物、細(xì)菌、真菌、 放線菌甚至軟體動物。β-甘露聚糖酶可消除食料中甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，改善飼料的營養(yǎng)價值，以及配合其他的酶(木聚糖酶、蛋白酶)進(jìn)一步提高家畜的生產(chǎn)性能。是一種很有開發(fā)前景的新型飼料添加劑。此外，甘露聚糖酶在食品、保健、醫(yī)藥、造紙、紡織、石油開采和生物技術(shù)等方面有很大的應(yīng)用價值。利用產(chǎn)酶的微生物，采用基因工程技術(shù)進(jìn)行酶基因的克隆并使其高效表達(dá)，然后采用發(fā)酵技術(shù)大規(guī)模生產(chǎn)是國內(nèi)外酶制劑研究的熱點領(lǐng)域，但高效表達(dá)的產(chǎn)物在分離純化的過程中依然存在困難，傳統(tǒng)的分離純化過于復(fù)雜，給工業(yè)化帶來額外的成本支出。枯草芽孢桿菌作為一種外源表達(dá)的宿主菌被廣泛的應(yīng)用到基因的克隆及過量的表達(dá)，本發(fā)明是根據(jù)NCBI公布的基因序列設(shè)計引物，在下游引物上添加了組氨酸序列， 克隆得到的β -甘露聚糖酶基因manA^i與表達(dá)載體pMA5連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Bacillus subtilis 168菌株，獲得重組菌株命名為BPM1003，成功構(gòu)建了一株高效表達(dá)且易于純化 β-甘露聚糖酶基因工程菌株命名為BPM1003，實現(xiàn)了 β-甘露聚糖酶的高效表達(dá)同時由于含有His-Tag而利于β-甘露聚糖酶的分離純化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要研究內(nèi)容利用分子生物學(xué)技術(shù)獲得含有組氨酸序列的β -甘露聚糖酶基因，將其連與表達(dá)載體上轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌，成功構(gòu)建基因工程菌株。在此基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)化Bacillussubtilis 168，構(gòu)建了一株高效表達(dá)的β -甘露聚糖酶基因工程菌株命名為 ΒΡΜ1003，利用親和層析法對表達(dá)的β -甘露聚糖酶通過Ni-NTA株純化，成功得到了純的 β -甘露聚糖酶，經(jīng)測定純化后的酶活力為3768. 7u/ml，并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以便為酶的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。本發(fā)明的技術(shù)方案從Bacillus subtilis JNA(保藏號CTCC M 2009200)中提取染色體作為模板，根據(jù)設(shè)計好的引物及提前設(shè)計好的PCR擴(kuò)增條件和擴(kuò)增體系進(jìn)行PCR，利用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化和回收。用PCR回收產(chǎn)物和質(zhì)粒pMA5進(jìn)行雙酶切，利用凝膠回收試劑盒回收雙酶切產(chǎn)物，利用T4DNA連接酶16°C過夜連接重組質(zhì)粒pMA5-manA2a，用連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌168，挑取陽性轉(zhuǎn)化子到IOml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后加入甘油，_20°C保藏備用，即成功構(gòu)建了基因工程菌BPM1003。 將凍管保藏的基因工程菌BPM1003按的接種量轉(zhuǎn)接到IOml液體LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜。次日按2%的接種量轉(zhuǎn)接至50ml液體LB培養(yǎng)基中37°C搖床培養(yǎng)。發(fā)酵完成后，將發(fā)酵液4°C 8000r/min離心5min后棄上沉淀，將上清通過親和層析得到純酶液，粗酶液蛋白含量采用Bradford法測定，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。酶活的測定采用DNS法，經(jīng)測定純酶液的酶活力為3768. 7u/ml,比酶活是4579. 2u/mg，說明一株易于純化的β -甘露聚糖酶基因工程菌株構(gòu)建成功。本發(fā)明的有益效果甘露聚糖酶可消除食料中甘露聚糖的抗?fàn)I養(yǎng)作用，改善飼料的營養(yǎng)價值，以及配合其他的酶(木聚糖酶，蛋白酶)進(jìn)一步提高家畜的生產(chǎn)性能， 是一種很有開發(fā)前景的新型飼料添加劑。本發(fā)明構(gòu)建了一株甘露聚糖酶基因工程菌 ΒΡΜ1003，酶活力達(dá)到897.;3u/ml，是原始菌株的11. 7倍，實現(xiàn)了 β -甘露聚糖酶高效表達(dá)； 利用親和層析法對表達(dá)的β -甘露聚糖酶通過M-NTA柱一步純化，經(jīng)測定純化后的酶活力為3768.7u/ml，SDS-PAGE蛋白電泳分析顯示成功得到了純的β -甘露聚糖酶，并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，以便為酶的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。


圖1 β -甘露聚糖酶manA的基因克隆驗證。1 :DL 2000degest marker ；2 β -甘露聚糖酶基因PCR產(chǎn)物。圖 2 重組質(zhì)粒 pMA5-manA 酶切驗證。Ml y -Hind III degest marker ；M2 :DL 2000degestmarkero圖3親和層析Ni-NTA柱純化得到純酶SDS-PAGE電泳圖。1 :Bacillus subtilis 168 ；2 :BPM1003 ；3 β -甘露聚糖酶；4 =Protein Marker。
具體實施例方式實施例1 β -甘露聚糖酶基因的克隆[1]根據(jù)NCBI公布的基因序列，利用DNAMAN軟件設(shè)計引物P1和Ρ2。P1 :5，-ATCGGATCCATGTTTAAGAAACATACGAT-3，P2 :5， -GGCACGCGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAACGATTGGCGTTA-3，Bacillus subtilis JNA(保藏號 CTCC M 2009200)染色體 DNA 的提取，提取方法用接種環(huán)從新鮮的Bacillus subtilis JNA平板上挑取單菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜，次日取400 μ 1菌液，8000r/min離心3min，棄上清，用0. 5ml TE洗滌一次細(xì)胞，離心棄上清，再用0.5ml TE充分懸浮細(xì)胞，加入50 μ 1 10mg/ml的溶菌酶液，混勻， 37°C 水浴 2-3h，加入 100μ 110% SDS，混勻，37°C 保溫 30min，加入 50 μ 110mg/ml 的蛋白酶 K，65°C反應(yīng)3h，期間每隔半小時混勻一次，加入等體積飽和酚，混勻，8000r/min離心5min， 上清移入另一個離心管中，往上清液中加入等體積的飽和酚再次抽提，轉(zhuǎn)移上清到另一離心管中，加入等體積氯仿抽提兩次，8000r/min離心5min，將上清移入另一管中，加入2倍體積的無水乙醇和1/10體積的醋酸鈉，室溫放置5min，8000r/min離心2min，棄上清，用70% 乙醇懸浮細(xì)胞，離心，倒掉液體，倒置于吸水紙上，室溫晾干，用50 μ 1 TE溶解，-20°C保藏備用。
[2]以Bacillus subtilis JNA基因組DNA為模板，利用實施例1提供的引物做 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°〇，51^11，1個循環(huán)；941，508，561，11^11 30s，72°C，Imin 30s, 35 個循環(huán)；72°C，10min，l個循環(huán)；15°C，lOmin，1個循環(huán)。擴(kuò)增體系:ddH20 17μ 1，模板2μ 1 引物 P1O. 5 μ 1,引物 P2O. 5 μ 1，dNTP Mix 2 μ 1，extaq-buffer 2· 5μ 1，ex—Taq 酶 O. 5 μ 1。 利用瓊脂糖凝膠回收盒對目的基因進(jìn)行回收，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗證(如圖1)。實施例2 重組質(zhì)粒pMA5-manA2a的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化Bacillus subtilis 168構(gòu)建重組載體pMA5-manA2a，將實施例1 [2]中得到的β -甘露聚糖酶基因PCR產(chǎn)物與質(zhì)粒ΡΜΑ5同時用BamH I和Mlu I雙酶切，利用凝膠回收盒回收后進(jìn)行連接，連接體系目的基因酶切產(chǎn)物7. 5 μ 1，ρΜΑ5酶切產(chǎn)物0. 5 μ 1，T4DNA連接酶buffer 1 μ 1，T4DNA 連接酶1μ 1，16°C過夜連接。將連接好的重組質(zhì)粒pMA5-manA^i轉(zhuǎn)化到感受態(tài)Bacillus subtilisl68，轉(zhuǎn)化方法挑取Bacillus subtilis 168接種于5ml LB培養(yǎng)，37°C搖床培養(yǎng)過夜；取IOOul過夜培養(yǎng)的菌液，接種于用50ml離心管配好的5ml SPI培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)，當(dāng)菌株生長到對數(shù)末期時，快速取200 μ 1接種到aiil SPII培養(yǎng)基中，37°C 100r/min 搖床培養(yǎng)1. 5h加20ull00x EGTA溶液，于37°C 100r/min搖床培養(yǎng)lOmin，用1. 5ml離心管分裝成500ul每管，分別向管中加入質(zhì)粒，輕輕搖勻于37°C 100r/min搖床培養(yǎng)30min，將離心管轉(zhuǎn)移到250r/min搖床培養(yǎng)1. 5h，以4000r/min離心收集菌體，棄部分上清，留IOOul重懸菌體，涂布于相應(yīng)的抗性平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取陽性菌落。37°C搖床過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，酶切驗證(如圖2、獲得因工程菌株BPM1003。實施例3 產(chǎn)β -甘露聚糖酶重組菌株ΒΡΜ1003的表達(dá)檢測及純化將得到的產(chǎn)β -甘露聚糖酶重組菌株ΒΡΜ1003按2%的接種量接到新的50ml LB 液體培養(yǎng)基中，取發(fā)酵液，4°C 8000r/min離心5min后棄上沉淀，將上清通過Ni-NTA柱得到純酶液，取得到的純酶液IOul加相應(yīng)的上樣Marker作為樣品進(jìn)行SDS-PAGE檢測，其中 SDS-PAGE使用5%的分離膠和15%的濃縮膠，采用不連續(xù)垂直電泳，用考馬斯亮藍(lán)R250染色，以含有空載質(zhì)粒PMA5的Bacillus subtilis 168做空白對照(如圖3)。經(jīng)測定純化后的酶活力為3768. 7u/ml，是粗酶液酶活力的4. 2倍，比酶活達(dá)到4579. 2u/mg。
權(quán)利要求
1.一種高效表達(dá)且易于純化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是根據(jù)已知基因序列設(shè)計引物，并在引物下游添加組氨酸標(biāo)簽序列，從本實驗室篩選菌株枯草芽孢桿菌JNA(保藏號CTCC M 2009200)染色體中克隆得到的含信號肽同時含有組氨酸標(biāo)簽的β -甘露聚糖酶基因manA2a，獲得重組質(zhì)粒pMA5-manA2a，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168菌株中，獲得一株高效表達(dá)且易于純化β -甘露聚糖酶的基因工程菌株；
2.如權(quán)利要求1所述，其特征是根據(jù)NCBI公布的基因序列設(shè)計引物，并在下游引物上添加了組氨酸序列，用該引物在特定條件下擴(kuò)增β -甘露聚糖酶基因得到1099bp的特異性條帶，將其克隆到表達(dá)載體PMA5上，以枯草芽孢桿菌168為表達(dá)宿主，實現(xiàn)β -甘露聚糖酶基因的高效表達(dá)且易于純化；(1)β -甘露聚糖酶基因基因的克隆其特征是根據(jù)NCBI公布的全基因組核酸序列中β-甘露聚糖酶基因序列，設(shè)計引物Pl 和Ρ2Pl 5' -ATGTTTAAGAAACATACGAT-3‘ Bam H IΡ2 :5’ -TTAACGCCAATCGTTGAGGTGGTGGTGGTGGTGGTG-3， Mlu I以枯草芽孢桿菌6-7總DNA為模板，利用上面提供的引物做PCR擴(kuò)增。(2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-manAh將質(zhì)粒pMD18-manAh和質(zhì)粒pMA5分別用相應(yīng)酶切位點酶切，連接。(3)重組質(zhì)粒pMA5_manA2a 轉(zhuǎn)化 Bacillus subtilis 168重組質(zhì)粒？嫩5-11^1^加轉(zhuǎn)化83(^11118 subtilis 168，其特征是根據(jù)權(quán)利要求1中所述方法得到的重組質(zhì)粒pMA5-manA^i轉(zhuǎn)化感受態(tài)Bacillus subtilis 168菌株，利用卡那霉素抗性平板挑取陽性菌落，轉(zhuǎn)接到LB培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵培養(yǎng)12h，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，酶切驗證,獲得重組菌株命名為Bacillus subtilis BPM1003。
3.甘露聚糖酶的表達(dá)及檢測，其特征在于將權(quán)利要求1中獲得的重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵液離心后，取上清測定甘露聚糖酶酶活力，與原始菌株進(jìn)行比較，其特征是重組菌高效表達(dá)了 β -甘露聚糖酶，經(jīng)檢測其粗酶液的酶活可達(dá)到897. :3u/ml，是原始菌株酶活力的11. 7倍。
4.β -甘露聚糖酶的純化，其特征在于將權(quán)利要求2中的發(fā)酵液離心后上清直接通過M-NTA—步柱純化，成功的得到了純的β-甘露聚糖酶，實現(xiàn)了 β-甘露聚糖酶易于純化的目的，經(jīng)測定純化后的酶活力為3768. 7u/ml，是粗酶液酶活力的4. 2倍，比酶活達(dá)到 4579. 2u/mg。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高效表達(dá)且易于純化β-甘露聚糖酶的基因工程菌株的構(gòu)建方法，其特征是根據(jù)NCBI公布的基因序列設(shè)計引物，在下游引物上添加了組氨酸序列，以Bacillus subtilis JNA染色體為模板克隆得到的β-甘露聚糖酶基因，用BamH I和Mlu I對PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pMA5雙酶切，利用T4DNA連接酶于16℃過夜連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)Bacillus subtilis 168菌株，獲得重組菌株BPM1003，將離心后的發(fā)酵液通過Ni-NTA柱一步純化，得到了純的β-甘露聚糖酶，其酶活力達(dá)到3768.7u/ml，比酶活達(dá)到4579.2u/mg。
文檔編號C12R1/125GK102367448SQ201110289820
公開日2012年3月7日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者劉項羽, 張顯, 徐美娟, 楊套偉, 饒志明 申請人:江南大學(xué)