專利名稱：一對鵝源性成分pcr檢測用引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及動物物種和動物源性成分鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測鵝源性成分的檢測方法，尤其涉及一對用于檢測鵝細(xì)胞線粒體核苷酸序列的引物。
背景技術(shù)：
鑒別檢測畜、禽源性成分技術(shù)是肉食品和飼料出入境海關(guān)、貿(mào)易、檢驗檢疫中關(guān)鍵定性技術(shù)，涉及到肉食品加工業(yè)、畜牧養(yǎng)殖業(yè)、飼料業(yè)、檢驗檢疫部門及其相關(guān)管理部門等領(lǐng)域。但是對于鵝的品種鑒定，以及產(chǎn)品中是否含有鵝源性成分還無快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測方法。利用本發(fā)明引物進(jìn)行的PCR擴(kuò)增目的片段是線粒體DNA序列。線粒體DNA是高等動物唯一的核外遺傳物質(zhì)，是一個比較理想的用于物種鑒別檢測的靶基因序列，其主要原因是(1)在所有組織細(xì)胞中均含有大量的線粒體，可以獲得大量的mtDNA，mtDNA在不同的物種間具有高度的變異性；每個動物細(xì)胞中存在許多拷貝的線粒體基因組，在采取相同體積的DNA樣品進(jìn)行PCR檢測時，線粒體基因組的模板數(shù)大大高于細(xì)胞核基因組的模板數(shù)，這就大大提高了 PCR檢測的靈敏度。0)mtDNA主要以編碼序列構(gòu)成，種內(nèi)的異質(zhì)基因很少。不同種類的動物線粒體基因組序列雖然高度同源，存在高度保守區(qū)域，但也存在一定的變異區(qū)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一對檢測鵝源性成分的引物。以解決準(zhǔn)確、快速、可靠的用 PCR技術(shù)鑒定鵝源性成分。本發(fā)明的目的可以通過采用以下技術(shù)方案來實現(xiàn)1.設(shè)計引物用于檢測鵝源性成分的引物是根據(jù)線粒體DNA中高度保守的D-Loop 區(qū)序列進(jìn)行設(shè)計，具體引物序列如下上游引物F 5，-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，；下游引物R 5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。2.提取樣品DNA 采用氯仿抽提法或商業(yè)DNA提取試劑盒提取樣品DNA。3.采用步驟1設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為25yL，包括2. 5μ L 10 X PCRBuffer (含 Mg2+20mmol/L)，3 μ L dNTPs (2. 5mmol/L)，1 μ LTaq 酶 QU/ μ L)，上下游引物F/R各3 μ L (終濃度為1. 2 μ Μ)，DNA模板2 μ L，超純水補(bǔ)至25 μ L?？刹捎蒙虡I(yè)化的 PCR 反應(yīng)母液。PCR 反應(yīng)程序為預(yù)變性 94°C 5min ；然后 94°C 50sec, 65°C 40sec, 72°C 40sec 循環(huán)35次；72°C :3min。反應(yīng)完成后在4°C下保存。4.電泳檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。若動物產(chǎn)品和飼料中含有鵝源性成分，則在電泳圖304bp位置處出現(xiàn)擴(kuò)增目的條帶。本發(fā)明的有益效果是，對活動物、食用性動物產(chǎn)品、非食用性動物產(chǎn)品、動物源性飼料及飼料添加劑等進(jìn)行品種鑒定。利用本發(fā)明的引物采用PCR方法可以有效檢出動物產(chǎn)品和飼料中的鵝源性成分，并進(jìn)行鑒別檢測，其擴(kuò)增目的條帶長度為304bp，檢測最低限為 0. 01%。


圖1鵝引物特異性PCR檢測電泳中M.Marker 2000 ； 1.鵝、2.火雞、3.鴨、4.鵪鶉、5.鴿、6.鴕鳥、7.雞、8.馬、 9.牛、10.羊、11.豬、12.狗、13.驢、14.貓、15.魚；16.空白對照圖2鵝引物靈敏度PCR檢測電泳中 M :marker DL2000 ;1 :100% (鵝 DNA) ;2 :50% ;3 ；4 5% ；5 1% ；6 0. 1% ；7 0. 01% ；8 空白
具體實施例方式以下?lián)咀罴褜嵤├龑Ρ景l(fā)明作進(jìn)一步詳述。應(yīng)理解，實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。1.引物的設(shè)計根據(jù)NCBI中已經(jīng)發(fā)表的鵝線粒體基因組序列(登錄號為 EU571957)在D-Loop區(qū)設(shè)計一對引物，序列如下上游引物F 5，-GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，；
下游引物 R 5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。2.樣品總DNA的提取采用氯仿抽提法或商業(yè)DNA提取試劑盒，提取鵝、火雞、鴨、鵪鶉、鴕鳥、鴿、雞、馬、 牛、羊、豬、驢、狗、貓、魚的基因組DNA，提取的基因組DNA均經(jīng)紫外分光光度計測定其純度和濃度。測定OD26tZOD28tl值均為1. 8左右，說明DNA純度較高符合PCR擴(kuò)增要求。3.鵝源性成分PCR擴(kuò)增利用步驟1設(shè)計的特異性引物，以鵝DNA等為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3. IPCR 反應(yīng)體系為 25 μ L,包括 2. 5 μ L IOXPCR Buffer (含 Mg2+20mmol/L)，3 μ L dNTPs (2. 5mmol/L)，1 μ LTaq 酶(2U/ μ L)，上下游引物 F/R 各 3 μ L (終濃度為 1. 2 μ Μ), DNA 模板2 μ L，超純水補(bǔ)至25 μ L?？刹捎蒙虡I(yè)化的PCR反應(yīng)母液。3. 2PCR 反應(yīng)程序為預(yù)變性 94°C 5min ；然后 94°C 50sec，65°C 40sec，72°C 40sec 循環(huán)35次；72°C :3min。反應(yīng)完成后在4°C下保存。4.電泳檢測PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。5.引物的特異性驗證利用所設(shè)計鑒別檢測鵝源性成分的特異性引物，分別以鵝、火雞、鴨、鵪鶉、鴕鳥、 鴿、雞、馬、牛、羊、豬、驢、狗、貓、魚的總DNA為模板，按上述3進(jìn)行PCR反應(yīng)，驗證引物的特異性。經(jīng)電泳檢測，結(jié)果如圖1所示，1號樣品在304bp位置處出現(xiàn)目的擴(kuò)增條帶，其它樣品沒有鵝源性成分DNA，則無目的擴(kuò)增條帶，顯示上述引物有良好的特異性。6. PCR的靈敏度驗證將研磨成粉末的鵝肉骨粉樣品用魚肉粉末稀釋(100g/100g)，至鵝成分樣品含量分別為 100. 00,50. 00、10. 00、1. 00,0. 10,0. 01g/100g，提取 DNA，按上述 3 進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，經(jīng)電泳檢測結(jié)果如圖2?？芍錂z測低限至少可達(dá)0.01%純鵝肉樣DNA濃度，該引物的靈敏度可達(dá)0.01%純鵝肉樣品。
權(quán)利要求
1. 一對用于檢測鵝源性成分的引物，其特征在于所述的引物序列包括 上游引物 F :5’ -GTGGCTATTCCCAGTGAT-3，； 下游引物 R :5，-TATTTGGAAGTGGTGGGT-3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及動物物種和動物源性成分鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測鵝源性成分的檢測方法，尤其涉及一對用于檢測鵝細(xì)胞線粒體核苷酸序列的引物。本發(fā)明旨在鑒定飼料、食品等產(chǎn)品中是否含有鵝源性成分。通過設(shè)計特異性擴(kuò)增引物，利用PCR技術(shù)檢測遺傳上相對獨立，沒有重復(fù)序列，生物個體內(nèi)無組織特異性的線粒體DNA，建立了鵝源性成分PCR檢測方法，以達(dá)到快速準(zhǔn)確檢測鑒定鵝源性成分的目的。
文檔編號C12Q1/68GK102337337SQ201110290480
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者劉建利, 盧體康, 呂建強(qiáng), 宗卉, 曹琛福, 汪燕玲, 秦智鋒, 花群義, 陶虹 申請人:深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術(shù)中心