專利名稱：分離純化胚胎腦神經(jīng)干細胞的快捷方法
分離純化胚胎腦神經(jīng)干細胞的快捷方法技術領域
本發(fā)明所涉及的是一種生物材料的提純方法，具體說是一種胚胎腦神經(jīng)干細胞的快速純化方法。
背景技術：
胚胎腦神經(jīng)干細胞的研究首先需要進行腦神經(jīng)干細胞的分離，目前有兩種分離胚胎腦神經(jīng)干細胞的方法(I)懸浮培養(yǎng)法將分散后的腦神經(jīng)細胞在培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)，形成神經(jīng)球后傳代培養(yǎng)若干次分離得到腦神經(jīng)干細胞。這種方法得到的腦神經(jīng)干細胞純度不高，并且周期較長(參考文獻Piper, D. R. et al. !Experimental Neurology 156,71-83,1999)。(2)FACS法先對神經(jīng)干細胞的特異性抗原進行熒光標記，用精密儀器來篩選干細胞。這種方法雖然可以得到較高純度的干細胞，但對干細胞有一定損傷，并且需要價格昂貴的精密儀器(參考文獻Muotri，R. A. et al Proc Natl Acad Sci USA 97,14720-14725,2000)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種不需要昂貴的精密儀器設備，但可保證純化后的胚胎腦神經(jīng)干細胞產(chǎn)品具有高純度的快捷方法。此方法是利用熱轉(zhuǎn)換聚合物對混合細胞進行培養(yǎng)，從而達到分離純化神經(jīng)干細胞的目的。用熱轉(zhuǎn)換聚合物對混合細胞進行三維立體培養(yǎng)也普遍適用于分離純化其他種類干細胞，如肺干細胞、上皮干細胞等。
本發(fā)明的目的通過以下步驟得以實現(xiàn)
I)將熱轉(zhuǎn)換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇用培養(yǎng)基溶解，之后置于0°C， 使之呈液態(tài)。
2)在PBS緩沖液(4°C )中反復吹打腦組織，令分散后的細胞通過尼龍篩，單細胞懸浮液離心，棄除上清，用培養(yǎng)基(4°C )使細胞重新懸浮。
3)取O. 7ml熱轉(zhuǎn)換聚合物與O. 3ml細胞懸浮液混勻。
4)將上述混合物滴入孔狀培養(yǎng)皿中，每孔O. 3ml，置37 °C培養(yǎng)箱中孵育5分鐘。
5)在培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)基，使熱轉(zhuǎn)換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇完全沒入培養(yǎng)基中。
6)將細胞放入37°C二氧化碳(5% )培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天更新培養(yǎng)基一次，培養(yǎng)時間為8到14天。
7)使熱轉(zhuǎn)換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇在低溫溶解，用4°C培養(yǎng)基離心洗滌回收形成的神經(jīng)球。
本發(fā)明使用的培養(yǎng)基為含15ng/ml bFGF (堿性成纖維生長因子)，30ng/ml EGF(上皮生長因子)，補充4% B27的DMEM/F12培養(yǎng)基。
采用本發(fā)明的方法提取的神經(jīng)球經(jīng)檢測為Nestin陽性，可懸浮傳代培養(yǎng)，也可在熱轉(zhuǎn)換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇中繼續(xù)傳代培養(yǎng) 。經(jīng)此法分離提純的胚胎神經(jīng)干細胞可以在體外分化成神經(jīng)元(Neuron)，神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Glia)和少突膠質(zhì)細胞 (Oligodendrocyte)。
本發(fā)明是利用熱轉(zhuǎn)換聚合物(N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇)對胚胎腦神經(jīng)細胞進行三維立體培養(yǎng)，利用神經(jīng)干細胞可在無接點環(huán)境中增殖并形成神經(jīng)球的特征從而達到對神經(jīng)干細胞分離、擴增和純化的目的。形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光標記，93%的細胞為Nestin陽性，說明此方法分離、富集、純化神經(jīng)干細胞快速有效。經(jīng)此法分離提純的神經(jīng)干細胞可以在體外分化成神經(jīng)元(Neuron)，神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Glia)和少突膠質(zhì)細胞 (Oligodendrocyte)。


圖1為神經(jīng)球免疫突光標記(Nestin標記)具體實施方式
下面舉例對本發(fā)明做更詳細的描述
1.熱轉(zhuǎn)換聚合物(N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇)的準備這種聚合物是一種高溫呈凝膠狀態(tài)而低溫呈液態(tài)狀態(tài)的人工膠，它從液態(tài)到膠狀的轉(zhuǎn)換溫度是25°C，可用培養(yǎng)基溶解，冰浴使之呈液狀。
2.胚胎腦組織在低溫PBS緩沖液中反復吹打，使細胞分散后通過尼龍篩，使其成單細胞懸浮液。單細胞懸浮液離心除去上清液，細胞用低溫液體培養(yǎng)基再懸浮。
3.取0. 7ml熱轉(zhuǎn)換聚合物與0. 3ml細胞懸浮液混勻，細胞密度可根據(jù)腦組織的來源進行調(diào)節(jié)。
4.取細胞混合物一熱轉(zhuǎn)換聚合物混合物滴入孔狀培養(yǎng)皿中，每孔0. 3ml，置37°C 培養(yǎng)箱中孵育5分鐘，使混合物凝固。
5.在培養(yǎng)皿中加入預熱的培養(yǎng)液，使混合物完全沒入培養(yǎng)基中。
6.細胞放入37°C 5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天交換一次新培養(yǎng)液。培養(yǎng)一周后，可以在熱轉(zhuǎn)換聚合物中看到形成的神經(jīng)球。
7.低溫使熱轉(zhuǎn)換聚合物溶解，通過低溫培養(yǎng)液離心清洗回收神經(jīng)球。
8.回收的神經(jīng)球經(jīng)檢測為Nestin陽性(圖1)，可懸浮傳代培養(yǎng)，也可在熱轉(zhuǎn)換聚合物中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。經(jīng)此法分離提純的神 經(jīng)干細胞可以在體外分化成神經(jīng)元(Neuixm)， 神經(jīng)膠質(zhì)細胞(Glia)和少突膠質(zhì)細胞(Oligodendrocyte)。
本研究使用的培養(yǎng)基為含15ng/ml bFGF (堿性成纖維生長因子)，30ng/ml EGF(上皮生長因子)，補充4% B27的DMEM/F12。
權利要求
1.一種簡單分離純化胚胎腦神經(jīng)干細胞的獨特方法，使用熱轉(zhuǎn)換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇對混合細胞進行三維立體培養(yǎng)，形成神經(jīng)球，從而達到干細胞的分離純化。
2.根據(jù)權利要求1所描述的分離純化胚胎腦神經(jīng)干細胞的快捷方法，其特征是利用熱轉(zhuǎn)換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇對混合細胞進行三維立體培養(yǎng)的方法還普遍適用于分離純化其他種類的干細胞(如肺干細胞、上皮干細胞等)。
3.這種純化方法使用的培養(yǎng)基特征是含15ng/mlbFGF(堿性成纖維生長因子)， 30ng/ml EGF(上皮生長因子)，補充4% B27的DMEM/F12培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供的方法可快速簡捷分離、擴增和提純胚胎腦神經(jīng)干細胞。本發(fā)明使用熱轉(zhuǎn)換聚合物N-異丙基丙烯酰胺和聚乙二醇對神經(jīng)細胞進行三維立體培養(yǎng)，利用神經(jīng)干細胞可在凝膠環(huán)境中增殖并形成神經(jīng)球的特性達到對神經(jīng)干細胞的分離純化之目的。形成的神經(jīng)球經(jīng)免疫熒光標記測定，表明約93％的細胞為Nestin陽性，說明此方法分離純化神經(jīng)干細胞簡單有效。經(jīng)此方法分離純化的胚胎神經(jīng)干細胞可以在體外分化形成神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。
文檔編號C12N5/0735GK103031271SQ201110291150
公開日2013年4月10日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者田杰 申請人:北京清美聯(lián)創(chuàng)干細胞科技有限公司