專利名稱：一種檢測(cè)心室肌致密化不全相關(guān)基因突變的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)診斷和生物技術(shù)，涉及一種檢測(cè)心室肌致密化不全(NVM)相關(guān)基因突變的體外診斷試劑盒，具體的是一種采用大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)技術(shù)檢測(cè)心肌致密化不全相關(guān)基因突變的方法和體外診斷試劑盒。
背景技術(shù)：
心室肌致密化不全(NVM)是一種原發(fā)性的心肌疾病，是由于胚胎初期心內(nèi)膜心肌的形態(tài)學(xué)發(fā)生受到限制，使發(fā)育中的肌小梁不能致密化，導(dǎo)致心室發(fā)育不全，病變均累及左心室，亦可同時(shí)累及右心室，導(dǎo)致心室收縮和舒張功能不全，出現(xiàn)進(jìn)行性加重的心力衰竭。 直至1990年才首次由Chin等對(duì)這個(gè)疾病做了系統(tǒng)的描述，之后對(duì)其重視度不斷提高，隨著超聲和核磁技術(shù)的發(fā)展，在臨床工作中發(fā)現(xiàn)的這類疾病患病人數(shù)不斷增加，2006年美國(guó)心臟病協(xié)會(huì)(AHA)將其單獨(dú)列為一類心肌疾病。世界范圍內(nèi)對(duì)NVM分子遺傳學(xué)的研究尚屬起步階段，較早開(kāi)始研究的西方國(guó)家正逐步從分子遺傳學(xué)角度揭示了 NVM的致病原因，這不僅有助于NVM發(fā)病機(jī)制的研究，而且為探索新的基因治療方法提供了依據(jù)，也為根治這種惡性疾病帶來(lái)了希望。已有研究證明NVM以常染色體顯性遺傳為主，也有X連鎖遺傳和線粒體遺傳的遺傳方式，超過(guò)44%病例是家族遺傳性的。NVM具有復(fù)雜的遺傳異質(zhì)性，自1997年克隆第一個(gè)致病基因至今，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)至少9個(gè)基因突變，分別是TAZ/G4. 5，DTNA, LIM域結(jié)合蛋白 3 (LDB3/Cypher/ZASP)，MYBPC3, α-Tropomyosin (TPM 1)，LMNA, β 肌球蛋白重鏈 (MYH7)，a肌動(dòng)蛋白(ACTC)和肌鈣蛋白T (TNNT2)基因。NVM的發(fā)病率在成人約為0. 05% 0.對(duì)％，隨著檢測(cè)技術(shù)的提高有增高的趨勢(shì)。NVM曾有多種名稱，其中“心室肌致密化不全”可表達(dá)出該病的發(fā)生機(jī)制及大體形態(tài)的雙重含義，是目前較規(guī)范的描述詞語(yǔ)；而“孤立性心室肌致密化不全”(isolated non-compaction of ventricularmyocardium, INVM)是指不合并其他心臟畸形的 NVM，根據(jù)病變部位可分為左室型、右室型及雙室型，病變均累及左心室，亦可同時(shí)累及右心室，導(dǎo)致心室收縮和舒張功能不全，出現(xiàn)進(jìn)行性加重的心力衰竭。臨床主要表現(xiàn)是心力衰竭、心律失常及心內(nèi)膜血栓伴栓塞。無(wú)特殊治療。癥狀出現(xiàn)早晚不一、輕重不同，其表現(xiàn)可從無(wú)癥狀到重度心功能不全，甚至需進(jìn)行心臟移植，或發(fā)生猝死；但亦有60歲以上發(fā)病的報(bào)道。其差別可能與NVM的程度及其病變的范圍有關(guān)。主要臨床表現(xiàn)為1.心力衰竭主要為左心衰竭，亦可合并右心衰竭，其機(jī)制為①小梁化心肌及肌小梁間的間隙影響心肌的供血，尤其是心內(nèi)膜下心肌，引起內(nèi)膜下心肌纖維化及左室收縮功能明顯下降，出現(xiàn)類似擴(kuò)張型心肌病的表現(xiàn)；②小梁化心肌可限制心室舒張，產(chǎn)生類似限制型心肌病的癥狀和體征。2.心律失?？焖傩褪倚孕穆墒С６嘁?jiàn)，包括易導(dǎo)致心臟性猝死的室性心動(dòng)過(guò)速； 左束支傳導(dǎo)阻滯亦較常見(jiàn)；也有報(bào)道發(fā)生預(yù)激綜合征的患兒。室性心律失常產(chǎn)生的原因尚不清楚，推測(cè)在致密化不全的心肌段，肌小梁呈不規(guī)則分支狀連接，等容收縮期室壁的壓力增加，使局部冠狀動(dòng)脈血供受損，從而引起心臟電傳導(dǎo)延遲，誘發(fā)心律失常。3.心內(nèi)膜血栓伴體循環(huán)栓塞主要為體循環(huán)栓塞，與房性心律失?；虿∽冃那粌?nèi)血栓形成并脫落有關(guān)。4.其他某些患兒可出現(xiàn)特異性面容，如前額突出、斜視、眼球震顫、低耳垂、小臉面、腭裂、上腭弓高、生殖器小等。NVM在遺傳學(xué)方面具有多態(tài)性，新近的研究提示其與肌小節(jié)的基因突變有關(guān)。通過(guò)對(duì)獨(dú)立的50例先證者及其194例親屬進(jìn)行了檢查和家族篩選，包括采用基因檢測(cè)、DNA診斷以及心電圖、超聲心動(dòng)圖。結(jié)果證實(shí)67%的LVNC是遺傳的。且其表現(xiàn)多樣，可以從無(wú)癥狀到癥狀嚴(yán)重。在家族性LVNC中有基因缺陷者占50%。基因檢測(cè)、DNA診斷及家族篩選對(duì)于LVNC顯得尤為重要。本發(fā)明可以同時(shí)把多個(gè)甚至幾十病人的心室肌致密化不全(NVM)相關(guān)基因精確的選擇性捕獲，然后用于大規(guī)模測(cè)序平臺(tái)，可以進(jìn)一步極大地降低基因診斷的成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種檢測(cè)心室肌致密化不全(NVM)相關(guān)基因突變的多重目標(biāo)捕獲再測(cè)序的試劑盒。該試劑盒提高了基因捕獲的通量和基因平行測(cè)序的通量，操作簡(jiǎn)便、成本低。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種新的多重目標(biāo)捕獲再測(cè)序方法， 包括以下步驟a.設(shè)計(jì)并制備用于捕獲心室肌致密化不全相關(guān)基因的突變捕獲探針。并將這些探針結(jié)合在磁珠、薄膜或者玻片上。b.將待測(cè)基因組DNA樣品分別片段化至100_400bp，然后將末端補(bǔ)平，加入的ATP 使片段兩端引入粘性末端。c.分別加入設(shè)計(jì)好的一端帶有標(biāo)簽序列的接頭序列片段，加入連接酶，使每個(gè)片段都與一對(duì)接頭連接，形成新的片段。標(biāo)簽序列的段定位置在接頭的粘性末端。標(biāo)簽序列的設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。d.調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度激活DNA聚合酶，用一對(duì)標(biāo)準(zhǔn)引物，對(duì)步驟c所得不同基因組完成連接的片段序列混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；標(biāo)準(zhǔn)引物見(jiàn)表2。e.將步驟d所得PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物與步驟a所設(shè)計(jì)的捕獲探針雜交，雜交反應(yīng)后通過(guò)多次洗脫純化反應(yīng)，得到待測(cè)片段。f.將待測(cè)片段通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行大規(guī)模平行測(cè)序。g.將得到的測(cè)序結(jié)果同標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，得到診斷結(jié)果。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案，步驟a所述的捕獲探針可以是脫氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)組成，但不僅限于DNA和RNA。探針的長(zhǎng)度從20bp至IOObp不等的與目標(biāo)互補(bǔ)的片段組成。探針以疊瓦式設(shè)計(jì)，完整覆蓋全部待測(cè)基因的外顯子片段和兩端50bp 范圍的序列。附圖
是探針示意圖。其中，步驟a所述的捕獲探針，包括覆蓋以下基因MYH7、ACTCU DTNA, TAZ、LDB3、 TNNT2、LMNA全部外顯子片段。
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其中，步驟c所述的接頭在引物結(jié)合區(qū)的下游設(shè)計(jì)標(biāo)簽，標(biāo)簽?zāi)┒藶檎承阅┒丝梢院突蚪M片段結(jié)合。接頭序列特征如表1所示。其中，步驟d的引物能夠在同樣條件下效率均一地?cái)U(kuò)增含有不同標(biāo)簽接頭的片段，擴(kuò)增出的片段包含作為標(biāo)簽的堿基序列。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1)本發(fā)明可以在一次測(cè)序反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)不同來(lái)源樣本全部心室肌致密化不全(NVM)相關(guān)基因的檢測(cè)；全部序列直接測(cè)出，準(zhǔn)確率可以達(dá)到99. 99%。2)本發(fā)明的試劑盒可以一次完成4-12個(gè)樣品的平行捕獲，極大地降低了樣品準(zhǔn)備的成本。3)本發(fā)明的試劑盒可以一次完成8-96個(gè)樣品的心室肌致密化不全(NVM)的基因檢測(cè)。4)本發(fā)明的檢測(cè)方法步驟簡(jiǎn)單，因而避免了復(fù)雜操作過(guò)程中存在的諸多不確定引物，提高了檢測(cè)準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性。5)本發(fā)明所提供的檢測(cè)方法所需時(shí)間大大少于sager法的測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)的準(zhǔn)確度大大優(yōu)于基因芯片技術(shù)，更符合臨床檢測(cè)要求。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用的舉例描述，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用不僅限于以下實(shí)施例實(shí)施例一、左室致密化不全103 例檢測(cè) MYH7、ACTC1、DTNA、TAZ、LDB3、TNNT2、LMNA 基因外顯子，尋找新的突變位點(diǎn)。一、探針設(shè)計(jì)根據(jù)人類基因組數(shù)據(jù)庫(kù)公布的基因MYH7、ACTCl、DTNA, TAZ、LDB3、 TNNT2、LMNA的外顯子序列設(shè)計(jì)合成探針，探針為RNA，在目標(biāo)區(qū)段疊瓦式設(shè)計(jì)，探針長(zhǎng)度 20bp，重疊區(qū)域5bp，覆蓋范圍達(dá)到目標(biāo)區(qū)段兩端50bp。采用agilent公司的Sur必elect 緩沖系統(tǒng)體系。二、基因組提取采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit (Code No :51204)進(jìn)行提取待測(cè) 96份樣本的基因組，OD值達(dá)到1. 8-2. 0，各取5ug做為起始模板。三、測(cè)序前樣品制備1)目的基因片段化取定量過(guò)的96份基因組DNA，稀釋至每100 μ L中含有5 μ g 基因組DNAJP 50ng/yL。取110 μ L，用超聲破碎儀分別進(jìn)行片段化。2)末端補(bǔ)平取1. 5mL EP管，96份基因組樣品分別按下表所示，在冰盒上加入各種試劑，保持冰浴狀態(tài)
權(quán)利要求
1.一種基因檢測(cè)心室肌致密化不全(NVM)的試劑盒，其特征在于捕獲目的基因探針； 一對(duì)用于擴(kuò)增待測(cè)片段的通用引物；12對(duì)加入不同標(biāo)簽的測(cè)序接頭序列；緩沖液；dNTP ；高保真聚合酶；Dynabeads M180 Str印tavidin (invitrogen 公司，112-06D)磁珠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的心室肌致密化不全(NVM)基因檢測(cè)試劑盒其特征在于；覆蓋 MYH7、ACTCl、DTNA、TAZ、LDB3,TNNT2,LMNA全部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區(qū)的探針。
3.權(quán)利要求2所述的探針可以是寡聚核糖核酸(RNA)，也可以是寡聚脫氧核糖核酸 (DNA)，但是不僅限于RNA和DNA，可以包括修飾后的DNA或者RNA等。
4.權(quán)利要求2所述的探針針對(duì)目標(biāo)區(qū)域以疊瓦式設(shè)計(jì)，探針序列與目標(biāo)區(qū)域?yàn)榛パa(bǔ)序列。
5.權(quán)利要求2所述的探針長(zhǎng)度在15-100bp，最優(yōu)為22bp；探針之間重疊區(qū)域?yàn)?2-10bp，最優(yōu)為 ^3ρ。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針可以是結(jié)合在磁珠上的，也可以結(jié)合在載玻片上，但不僅限于這些介質(zhì)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢驗(yàn)心室肌致密化不全(NVM)的試劑盒其特征在于；12 對(duì)加入不同標(biāo)簽的接頭序列；
8.權(quán)利要求5種所述的標(biāo)簽特征是標(biāo)簽序列的位置接頭的最內(nèi)側(cè)，通過(guò)粘性末端與待測(cè)片段結(jié)合；接頭5’和3’端分別進(jìn)行磷酸化和硫化修飾。
9.一種基因檢測(cè)心室肌致密化不全(NVM)的方法，其特征在于，所述方法包括以下內(nèi)容a.設(shè)計(jì)并制備覆蓋MYH7、ACTCl、DTNA、TAZ、LDB3,TNNT2,LMNA全部外顯子片段以及鄰近50bp的非編碼區(qū)的探針；b.將多個(gè)待測(cè)DNA樣品分別連接到設(shè)計(jì)好的加了特異性標(biāo)簽的接頭；c.將經(jīng)過(guò)步驟b所得的不同樣品的DNA片段混合然后使用設(shè)計(jì)好的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增；d.將處理好的待測(cè)DNA片段混合物和步驟a所得探針加入反應(yīng)管中，DNA樣本與探針雜交，通過(guò)洗脫得到待測(cè)的目標(biāo)片段；；e.調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度激活DNA聚合酶，用一對(duì)通用引物對(duì)步驟d所得序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；f.將步驟e所得PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物通過(guò)大規(guī)?；蚱叫蟹治銎脚_(tái)進(jìn)行測(cè)序。g.根據(jù)標(biāo)簽特征分別對(duì)不同來(lái)源的基因樣本比對(duì)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)心室肌致密化不全(NVM)相關(guān)基因突變樣品制備試劑盒。具體的涉及一種應(yīng)用大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)心室肌致密化不全(NVM)相關(guān)基因的產(chǎn)品，該試劑盒包括 a)設(shè)計(jì)并制備捕獲探針，針對(duì)基因MYH7、ACTC1、DTNA、TAZ、LDB3、TNNT2、LMNA全部外顯子片段；b)設(shè)計(jì)獨(dú)特帶有標(biāo)簽序列的接頭；c)設(shè)計(jì)獨(dú)特通用引物對(duì)探針序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增；d)設(shè)計(jì)獨(dú)特的混合后目的片段的捕獲操作。這個(gè)方法和試劑盒制備的大規(guī)模平行測(cè)序平臺(tái)樣品通量大、效率高、操作簡(jiǎn)便，極大地降低了測(cè)序檢驗(yàn)成本。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102417927SQ201110293768
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者侯青 申請(qǐng)人:康旭基因技術(shù)(北京)有限公司