專利名稱：：刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：自轉(zhuǎn)基因技術(shù)誕生以來，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中人們最擔(dān)心的是安全性問題，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中帶有的一些選擇標(biāo)記基因可能會(huì)對(duì)人類健康、自然界的物種和環(huán)境存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，轉(zhuǎn)基因植物的安全性問題日益受到重視，并已成為影響轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸(參考文獻(xiàn):HarePD,ChuaNH.Excisionofselectablemarkergenesfromtransgenicplants.NatureBiotechnology,2002,20:575_580·)。胃胃中;g中素抗性基因問題。轉(zhuǎn)基因食品中的抗生素抗性基因可能會(huì)通過轉(zhuǎn)染腸道細(xì)菌，而使人類對(duì)這些抗生素產(chǎn)生抗性，也就是耐藥性。聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織在2003年聯(lián)合頒布的轉(zhuǎn)基因植物食品風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估準(zhǔn)則明確指出“對(duì)在臨床上應(yīng)用的抗生素具有抗性的耐抗生素基因不應(yīng)在食品中出現(xiàn)”。卡那霉素抗性基因?qū)敲顾鼐哂锌剐?，被世界衛(wèi)生組織列為第二級(jí)別，為重要類抗生素，意味著該抗生素抗性基因不應(yīng)在食品中出現(xiàn)。因此抗生素抗性基因的刪除具有重要意義。Cre/loxP重組系統(tǒng)由于特異、高效、作用專一性強(qiáng)，因而不影響基因的正常表達(dá)與調(diào)控，在轉(zhuǎn)基因研究中得到了廣泛的應(yīng)用(參考文獻(xiàn)BallesterA，CerveraM，PenaL.Efficientproductionoftransgeniccitrusplantsusingisopentenyltransferasepositiveselectionandremovalofthemarkergenebysite-specificrecombination.PlantCellReports,2006,26:39-45.禾口CaoMX，HuangJQ,YaoQH,LiuSJ,WangCL,WeiZM.Site-specificDNAexcisionintransgenicricewithacell-permeableCrerecombinase.MolecularBiotechnology,2006,32:55-63.禾口ChakrabortiD,SarkarA,MondalHA,SchuermannD,HohnB,SarmahBK,DasS(2008)Cre/loxsystemtodevelopselectablemarkerfreetransgenictobaccoplantsconferringresistanceagainstsapsuckinghomopteraninsect.PlantCellRep27:1623-1633.禾口CuellarW,GaudinA,SolorzanoD,CasasA,NopoL,ChudalayandiP,MedranoG,KreuzeJ,GhislainM.Self-excisionoftheantibioticresistancegenenptllusingaheatinducibleCre-IoxPsystemfromtransgenicpotato.PlantMolecularBiology，2006，62:71-82.)。Cre(causesrecombination)重組酶是由來源于Pl噬菌體的ere基因所編碼的一類酶，屬于Int家族，識(shí)別特異靶位點(diǎn)(IoxP位點(diǎn))并催化在該位點(diǎn)斷裂和重組(參考文獻(xiàn)Stembergn,SauerB,HoessR,etal.BacteriophagePIcregeneanditsregulatoryregionevidenceformultiplepromotersandforregulationbyDNAmethylation[J].JournalofMolecularBiology,1986,187197-121.)。IoxP位點(diǎn)是一段長(zhǎng)度為34bp的DNA序列，是Cre重組酶的特異性識(shí)別位點(diǎn)，具有典型的回文結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列和中間8bp的不對(duì)稱間隔區(qū)組成，8bp的間隔區(qū)負(fù)責(zé)位點(diǎn)的定向(參考文獻(xiàn)RonaldHH，MarciaΖ,NatS.Plsite2specificrecombinationnucleotidesequenceofrecombiningsites[J].ProcNatlAcadSci,USA,1982，79:3398-3402.)。當(dāng)同一條DNA分子上有2個(gè)同向的IoxP位點(diǎn)時(shí)，Cre重組酶催化兩個(gè)IoxP位點(diǎn)間基因的剔除，只留下1個(gè)IoxP位點(diǎn)，重組發(fā)生在8bp的分隔區(qū)內(nèi)(參考文獻(xiàn):HoessRH,AbremskiK.InteractionofthebacteriophagePlrecombinaseCrewiththerecombiningsiteIoxP.ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1984,81:1(^6-1029.)。Cre重組酶介導(dǎo)的DNA重組不受切除片段長(zhǎng)度和位置的限制，只要靶基因被2個(gè)識(shí)別位點(diǎn)標(biāo)記就可以準(zhǔn)確地進(jìn)行DNA重組。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)，由用于插入外源目的DNA表達(dá)盒的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和用于刪除所述抗生素標(biāo)記基因的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體組成。所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，含有兩個(gè)同向IoxP位點(diǎn)，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，及插入外源目的DNA的多克隆位點(diǎn)；所述兩個(gè)同向的IoxP位點(diǎn)將所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素標(biāo)記基因及所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和所述插入外源目的DNA的多克隆位點(diǎn)。所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，該環(huán)狀載體含有兩個(gè)同向的IoxP位點(diǎn)，可控啟動(dòng)子，被所述可控啟動(dòng)子啟動(dòng)的Cre酶基因，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒；所述兩個(gè)同向的IoxP位點(diǎn)將所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素的基因，可控啟動(dòng)子及被所述可控啟動(dòng)子啟動(dòng)的Cre酶基因，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，以及所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒。所述表達(dá)盒均指含有目的基因及表達(dá)該目的基因所需元件的DNA分子。所述抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒是一個(gè)含有抗生素標(biāo)記基因及該抗生素標(biāo)記基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動(dòng)子、SD序列、由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的所述抗生素標(biāo)記基因的編碼序列和終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述抗生素基因表達(dá)盒具體為卡那霉素(Kan)基因表達(dá)盒；所述Kan基因表達(dá)盒是一個(gè)含有Kan基因及Kan基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段含有啟動(dòng)Kan基因的原核啟動(dòng)子(序列7的第沈30位到第M92位)、SD序列、被該啟動(dòng)子啟動(dòng)的Kan基因和終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒是一個(gè)含有可視化標(biāo)記基因及可視化標(biāo)記基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動(dòng)子、由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的所述可視化標(biāo)記基因的編碼序列以及終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述可視化標(biāo)記基因表達(dá)盒具體由花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因表達(dá)盒和花青素基因合成途徑中cl基因表達(dá)盒組成。其中，bi基因的表達(dá)盒是一個(gè)含有bi基因及bi基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動(dòng)子、被該啟動(dòng)子啟動(dòng)的bi基因和nos終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)；cl基因的表達(dá)盒是一個(gè)含有cl基因及cl基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動(dòng)子、被該啟動(dòng)子啟動(dòng)的cl基因和nos終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。其表達(dá)產(chǎn)物花青素可作為植物轉(zhuǎn)基因成功與否及鑒定轉(zhuǎn)基因植物是否成功刪除抗生素標(biāo)記基因的可視化標(biāo)記。cl基因的表達(dá)盒和bi基因表達(dá)盒的啟動(dòng)子均可為任何可以啟動(dòng)基因在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，如常用的3啟動(dòng)子。所述bi基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述Cl基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。所述bi基因的編碼序列如序列表中序列10的第3137位到第4796位所示；所述cl基因的編碼序列如序列表中序列10的第1013位到第1834位所示。所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒是一個(gè)含有篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因及其表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動(dòng)子、由所述啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需的標(biāo)記基因的編碼序列以及終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒具體為EPSP基因表達(dá)盒；所述EPSP基因表達(dá)盒是一個(gè)含有EPSP基因及EPSP基因表達(dá)所需元件的DNA分子，從上游至下游依次含有如下片段啟動(dòng)子、由該啟動(dòng)子啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的所述EPSP基因的編碼序列以及終止子(轉(zhuǎn)錄終止序列)；所述EPSP基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列3所示；所述EPSP基因的編碼序列如序列表中序列8的第10位到第2549位所示。所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒中的啟動(dòng)子可為任何可以啟動(dòng)基因在植物中轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，如常用的3啟動(dòng)子。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述插入外源目的DNA的多克隆位點(diǎn)從上游到下游具體依次為KpnI，HindIII，EcoRI，SmaI,XbaI,NotI。所述的可控啟動(dòng)子具體為水稻熱激蛋白hsp70基因啟動(dòng)子hsp70；所述的水稻熱激蛋白hsp70基因啟動(dòng)子hsp70的核苷酸序列如序列表中序列9的第1位到第687位所示。所述的Cre酶基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列4所示；所述的Cre酶基因的編碼序列如序列表中序列9的第694位到第17位所示。所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別單獨(dú)包裝。所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為pBAC9008，pBAC9008按照如下方法構(gòu)建1)在PGreen載體的第1648位和第沈35位處分別插入如序列表中序列5所示的IoxP位點(diǎn)得到重組載體pBAC814，pBAC814中的兩個(gè)IoxP位點(diǎn)方向相同；2)在pBAC814的多克隆位點(diǎn)前的NdeI酶切位點(diǎn)處插入所述EPSP基因的表達(dá)盒得到重組載體PBAC823；3)將上述PBAC823載體的用DraIII酶切，加入Agel/PacIlinker，之后將所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)框插入AgeI和I^cI位點(diǎn)之間，得到的載體命名為pBAC9008。所述pGreen載體的序列如序列表中序列7所示；所述EPSP基因的表達(dá)盒的序列如序列表中序列8所示，其中第1位到第434位為所述35S啟動(dòng)子的核苷酸序列，第461位到第994位為所述玉米Adhl基因的Intronl的核苷酸序列，第10位到第2549位為所述EPSP基因的編碼序列；所述Agel/PacIlinker的核苷酸序列如序列表中序列6所示。所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為pBAC9009，pBAC9009按照如下方法構(gòu)建a)構(gòu)建被所述熱激活蛋白基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的所述Cre酶基因的表達(dá)盒，將該表達(dá)盒插入所述PBAC823載體的DraIII酶切位點(diǎn)處，得到重組載體pBAC830；b)將所述花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒插入pBAC830載體的EcoRI酶切位點(diǎn)，得到PBAC9009載體。被所述熱激活蛋白基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的所述Cre酶基因的表達(dá)盒的核苷酸序列如序列表中序列9所示，其中，第1位到第687位為所述hsp70啟動(dòng)子的核苷酸序列，第694位到第1725位為所述Cre酶基因的編碼序列；所述花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達(dá)盒和所述花青素基因合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒的序列如序列表中序列10所示，其中，第1位到第2112位為所述cl表達(dá)框的基因序列，第2125位到第5074位為所述bi表達(dá)框的序列，第1013位到第1834位為cl基因的編碼序列，第3137位到第4796位為bi的編碼序列。所述刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)在刪除轉(zhuǎn)基因植物抗生素基因中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供利用上述刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。該方法包括如下步驟a、將目的基因插入所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體中的所述多克隆位點(diǎn)，得到重組目的基因表達(dá)載體。b、用所述重組目的基因表達(dá)載體和含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別通過DNA直接轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，獲得所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株和所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株。所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述目的基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個(gè)基因均表達(dá)，將所述三個(gè)基因記作含有目的基因的三基因；所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述Cre酶基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個(gè)基因均表達(dá)，將所述三個(gè)基因記作含Cre酶基因的三基因。C、從所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含有目的基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為父本，從所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含Cre酶基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為母本，將所述母本和所述父本進(jìn)行雜交，對(duì)得到的雜交種子進(jìn)行處理，使所述可控啟動(dòng)子被激活，再將該種子進(jìn)行種植，得到的不含所述可視化標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的植株即為抗生素標(biāo)記基因被刪除的轉(zhuǎn)基因植株。所述DNA的直接轉(zhuǎn)移法包括電擊法(電穿孔法)、基因槍法(微彈轟擊法)、激光微束穿孔法、顯微注射法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、多聚物介導(dǎo)法，花粉管通導(dǎo)法等。在本發(fā)明的實(shí)施例中采用的具體方法為基因槍法。在本發(fā)明的實(shí)施例中，所述轉(zhuǎn)基因植物具體可為單子葉植物，如玉米；所述對(duì)得到的雜交種子進(jìn)行處理使所述可控啟動(dòng)子被激活的方法具體為40°C熱誘導(dǎo)處理。本發(fā)明通過Cre-IoxP系統(tǒng)構(gòu)建了抗生素標(biāo)記基因的刪除系統(tǒng)。含有IoxP位點(diǎn)的表達(dá)目的基因的轉(zhuǎn)基因植株通過與表達(dá)Cre酶基因的轉(zhuǎn)基因植株雜交，就可以從轉(zhuǎn)基因植株的后代中刪除抗生素標(biāo)記基因，為食品安全提供保證，在轉(zhuǎn)基因研究中具有重要的意義。另外，本發(fā)明的發(fā)明人在刪除系統(tǒng)中又同時(shí)引進(jìn)了可視化標(biāo)記基因花青素合成途徑的兩個(gè)7轉(zhuǎn)錄因子，使得本發(fā)明僅僅從玉米種皮的顏色上就可以判斷出轉(zhuǎn)基因的效果與刪除效果，因此該刪除體系在轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域是一個(gè)突破，大大節(jié)省了分子檢測(cè)的成本，對(duì)于后續(xù)的育種也有著重要的意義。圖1為pBAC823質(zhì)粒圖譜。圖2為pBAC9008質(zhì)粒圖譜。圖3為pBAC830質(zhì)粒圖譜。圖4為pBAC9009質(zhì)粒圖譜。圖5為轉(zhuǎn)基因玉米植株的分化及田間移栽。A誘導(dǎo)愈傷組織；B轉(zhuǎn)化再生植株；C田間移栽；D轉(zhuǎn)化植株結(jié)實(shí)種子。圖6為pBAC9008轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)。1:2Kplusmarker；2陰性對(duì)照(水)；3非轉(zhuǎn)基因植株；5質(zhì)粒pBAC9008；618轉(zhuǎn)化植株。圖7為pBAC9009轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)。1:2Kplusmarker；217轉(zhuǎn)化植株；18陰性對(duì)照(水)；19非轉(zhuǎn)基因植株；20質(zhì)粒pBAC9009。圖8為轉(zhuǎn)基因玉米中Kan基因刪除示意圖。其中，A代表轉(zhuǎn)目的基因玉米(父本)；B代表轉(zhuǎn)重組酶基因玉米(母本)；C代表轉(zhuǎn)目的基因玉米(刪除抗生素基因)；D代表轉(zhuǎn)重組酶基因玉米；E和F均代表轉(zhuǎn)目的基因玉米/轉(zhuǎn)重組酶基因玉米的雜合體。具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。玉米優(yōu)良自交系501(楊東歌，楊鳳萍，陳緒清，張立全，張曉東.外源脫水應(yīng)答轉(zhuǎn)錄因子CBF4基因轉(zhuǎn)化玉米的獲得.作物學(xué)報(bào)，2009，35(10):1759-1763)T4DNA連接酶、Taq酶、卡納霉素、IPTG、X-gal等試劑均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自！Iomega、NewEnglandBiolabs；普通生化試劑購(gòu)自Sigma公司、Promega公司或國(guó)產(chǎn)?；驑屝吞?hào)PDS_1000/He(BioRad)?；A(chǔ)載體pGreen，購(gòu)自英國(guó)JohnInnesCentre[聯(lián)系人MarkSmedley，JohnInnesCentre,NorwichResearchPark,Colney,Norwich,NR47UH,UK.e-mail:mark.smedleyibbsrc.ac.uk,Fax(+44)1603450045]。下面結(jié)合具體實(shí)施例，詳細(xì)闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1、含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體的構(gòu)建一、pGreen載體的改造根據(jù)pGreen中Kan基因的兩側(cè)序列分別合成擴(kuò)增IoxP位點(diǎn)的正向、反向共四條引物(見表1)，其中兩個(gè)正向引物PF1648(序列如序列表中序列11所示)和ΡΜ635(序列如序列表中序列12所示)的前4個(gè)核苷酸殘基均為IoxP序列的8bp間隔區(qū)的后4位，第5-17位核苷酸殘基均為IoxP序列的13bp的反向重復(fù)序列；兩個(gè)反向引物PR1648(序列如序列表中序列13所示)和(序列如序列表中序列14所示)的前4個(gè)核苷酸殘基均為IoxP序列的8bp間隔區(qū)的前4位，第5-17位核苷酸殘基均為IoxP序列的13bp的反向重復(fù)序列。利用兩次PCR的方法，將IoxP位點(diǎn)加入pGreen中Kan基因表達(dá)框的兩側(cè)。具體操作方法如下所述首先以pGreen基礎(chǔ)框架載體為模板，利用PF1648/冊(cè)1648引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物自連，轉(zhuǎn)化E.coliJM110。通過序列測(cè)定確定IoxP位點(diǎn)是否正確插入PGreen載體中。將鑒定正確的載體命名為pGreen-loxp(在pGreen的1648位點(diǎn)處插入如序列表中序列5所示的IoxP位點(diǎn)得到的重組載體)，以pGreen-loxp載體為模板，以PM635/PR2635引物對(duì)進(jìn)行第二次PCR，步驟同上。測(cè)序正確的載體命名為pBAC814(在pGreen-loxp中對(duì)應(yīng)pGreen的沈35位點(diǎn)處插入如序列表中序列5所示的IoxP位點(diǎn)得到的重組載體，PBAC814中的兩個(gè)IoxP位點(diǎn)方向相同)。在pBAC814多克隆位點(diǎn)前的NdeI酶切位點(diǎn)處插入CaMV35S啟動(dòng)子和玉米Adhl基因的Intronl驅(qū)動(dòng)的EPSP基因(EPSP基因表達(dá)盒)，所述EPSP基因作為篩選轉(zhuǎn)基因植物的選擇標(biāo)記基因。經(jīng)測(cè)序鑒定正確的載體命名為pBAC823(pBAC823的質(zhì)粒圖譜如圖1所示)。pBAC823中CaMV35S啟動(dòng)子和玉米Adhl基因的htronl驅(qū)動(dòng)的EPSP基因(EPSP基因表達(dá)盒)的序列如序列表中序列8所示，其中第1位到第434位為所述35S啟動(dòng)子的核苷酸序列，第461位到第994位為所述玉米Adhl基因的htronl的核苷酸序列，第10位到第2549位為所述EPSP基因的編碼序列表1擴(kuò)增IoxP位點(diǎn)的四條引物序列權(quán)利要求1.刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)，由用于插入外源目的DNA的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和用于刪除所述抗生素標(biāo)記基因的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體組成；所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，含有兩個(gè)同向IoxP位點(diǎn)，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，插入外源目的DNA的多克隆位點(diǎn)；所述兩個(gè)同向的IoxP位點(diǎn)將所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素標(biāo)記基因及所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和所述插入外源目的DNA的多克隆位點(diǎn)；所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為環(huán)狀載體，該環(huán)狀載體含有兩個(gè)同向的IoxP位點(diǎn)，可控啟動(dòng)子，被所述可控啟動(dòng)子啟動(dòng)的Cre酶基因，抗生素標(biāo)記基因的表達(dá)盒，可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒，和篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒；所述兩個(gè)同向的IoxP位點(diǎn)將所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體劃分為兩段，其中一段含有編碼所述抗生素標(biāo)記基因，可控啟動(dòng)子及被所述可控啟動(dòng)子啟動(dòng)的Cre酶基因，另一段含有所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因的表達(dá)盒和所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒；所述表達(dá)盒均指含有目的基因及該目的基因表達(dá)所需元件的DNA分子。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的系統(tǒng)，其特征在于所述可視化標(biāo)記基因由花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因和花青素基因合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子cl基因組成；所述可視化標(biāo)記基因的表達(dá)盒為由所述轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達(dá)盒和所述轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒組成；所述bi基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列1所示，所述cl基因編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如序列表中序列2所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的系統(tǒng)，其特征在于所述bi基因的編碼序列如序列表中序列10的第3137位到第4796位所示；所述cl基因的編碼序列如序列表中序列10的第1013位到第1834位所示。4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的可控啟動(dòng)子為熱激活蛋白基因啟動(dòng)子；所述的Cre酶基因編碼的蛋白質(zhì)的序列如序列表中序列9所示。5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的熱激活蛋白基因啟動(dòng)子的核苷酸序列如序列表中序列9的第1位到第687位所示；所述的Cre酶基因的編碼序列如序列表中序列9的第694位到第1725位所示。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體和所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別單獨(dú)包裝。7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的系統(tǒng)，其特征在于所述的含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體為pBAC9008，pBAC9008按照如下方法構(gòu)建1)在如序列表中序列7所示的PGreen載體的第1649位和第沈35位分別插入如序列表中序列5所示的IoxP位點(diǎn)得到重組載體pBAC814，pBAC814中的兩個(gè)IoxP位點(diǎn)方向相同；2)在pBAC814的NdeI酶切位點(diǎn)處插入如序列表中序列8所示的EPSP基因表達(dá)盒得到重組載體pBAC823；3)將上述pBAC823載體的用DraIII酶切，加入如序列表中序列6所示的Agel/PacIlinker，之后將如序列表中序列10所示的所述花青素合成途徑中轉(zhuǎn)錄因子cl基因和轉(zhuǎn)錄因子bi基因的表達(dá)盒插入AgeI和I^cI位點(diǎn)之間，得到的載體命名為PBAC9008；所述的含Cre酶基因的植物表達(dá)載體為pBAC9009，pBAC9009按照如下方法構(gòu)建a)構(gòu)建被所述熱激活蛋白基因啟動(dòng)子啟動(dòng)的如序列表中序列9所示的所述Cre酶基因的表達(dá)盒，將該表達(dá)盒插入所述PBAC823載體的DraIII酶切位點(diǎn)處，得到重組載體pBAC830；b)將如序列表中序列10所示的所述花青素基因合成途徑中的轉(zhuǎn)錄因子bi基因和轉(zhuǎn)錄因子cl基因的表達(dá)盒插入PBAC830載體的EcoRI酶切位點(diǎn)，得到pBAC9009載體。8.權(quán)利要求1-6中任一所述的刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因系統(tǒng)在刪除轉(zhuǎn)基因植物抗生素標(biāo)記基因中的應(yīng)用。9.利用權(quán)利要求1-6中任一所述系統(tǒng)培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟a、將目的基因插入所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體中的所述多克隆位點(diǎn)，得到重組目的基因表達(dá)載體；b、用所述重組目的基因表達(dá)載體和含Cre酶基因的植物表達(dá)載體分別通過DNA的直接轉(zhuǎn)移法轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞，獲得所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株和所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株；所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述目的基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個(gè)基因均表達(dá)，所述三個(gè)基因記作含有目的基因的三基因；所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株中，所述Cre酶基因、所述篩選轉(zhuǎn)基因植物所需標(biāo)記基因和所述可視化標(biāo)記基因這三個(gè)基因均表達(dá)，所述三個(gè)基因記作含Cre酶基因的三基因；C、從所述重組目的基因表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含有目的基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為父本，從所述含Cre酶基因的植物表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因植株自交后代中選擇所述含Cre酶基因的三基因均穩(wěn)定表達(dá)和純合的植株作為母本，將所述母本和所述父本進(jìn)行雜交，對(duì)得到的雜交種子進(jìn)行處理使所述可控啟動(dòng)子被激活，再將該種子進(jìn)行種植，得到表達(dá)所述目的基因并且不含所述可視化標(biāo)記基因表達(dá)產(chǎn)物的植株即為抗生素標(biāo)記基因被刪除的轉(zhuǎn)基因植株。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述方法，其特征在于所述植物為單子葉植物，如玉米；所述對(duì)得到的雜交種子進(jìn)行處理使所述可控啟動(dòng)子被激活的方法為40°C熱誘導(dǎo)處理。全文摘要本發(fā)明公開了刪除轉(zhuǎn)基因植物中抗生素標(biāo)記基因的系統(tǒng)及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的刪除系統(tǒng)由分別含有抗生素標(biāo)記基因和含Cre酶基因的兩個(gè)植物表達(dá)載體各自單獨(dú)包裝組成。所述含有抗生素標(biāo)記基因的植物表達(dá)載體含有兩個(gè)同向的loxP位點(diǎn)，且兩loxP位點(diǎn)之間含有抗生素標(biāo)記基因及可視化標(biāo)記基因表達(dá)盒。將所述兩載體的轉(zhuǎn)基因植株后代雜交，便可從雜交后代中刪除抗生素標(biāo)記基因，這為食品安全提供了保證，在轉(zhuǎn)基因研究中具有重要的意義。另外，可視化標(biāo)記基因使得僅僅從轉(zhuǎn)基因植株及種皮果皮的顏色上就可以判斷出轉(zhuǎn)基因的效果與刪除效果，因此該刪除體系在轉(zhuǎn)基因研究領(lǐng)域是一個(gè)突破，大大節(jié)省了分子檢測(cè)的成本，對(duì)于后續(xù)的育種也有著重要的意義。文檔編號(hào)C12N15/82GK102337292SQ20111029558公開日2012年2月1日申請(qǐng)日期2011年9月27日優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日發(fā)明者張曉東,張立全,李向龍,楊鳳萍,薛靜,陳緒清申請(qǐng)人:北京市農(nóng)林科學(xué)院