專利名稱：紅椿菌AUH-Julong21及其在甘草素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種菌株及其應(yīng)用，尤其是一種紅椿菌AUH-JUlong21及其在甘草素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
甘草(Licorice roots)是一味古老的中藥材，在我國(guó)古代醫(yī)藥典籍中多有記載， 迄今已有幾千年的使用史。甘草具有保肝、祛痰止咳、清熱解毒、補(bǔ)脾益氣、抗菌消炎、抗癌、 降糖、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)保護(hù)等多種功效，臨床上主要用于治療呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)等疾病。由于甘草對(duì)多種疾病均具良好的預(yù)防和治療作用，尤其是甘草毒副作用低，對(duì)甘草中藥理活性物質(zhì)的研究和挖掘已成為國(guó)內(nèi)外研究熱點(diǎn)。甘草中的黃酮和酚類是甘草中的標(biāo)志性化合物，目前從甘草中已分離得到300多種三萜皂苷和甘草黃酮類化合物。甘草苷(Liquiritin，簡(jiǎn)稱LQ)是甘草中含量較高的黃酮成分之一，有研究表明，LQ在酸性條件下或在人腸道微生物菌群產(chǎn)生的葡萄糖苷酶作用下，可被水解為甘草素(Liquiritigenin，簡(jiǎn)稱LG)。已有研究表明，LG是Akt蛋白激酶抑制劑，也是有較高選擇性的雌激素受體激動(dòng)劑，對(duì)肝細(xì)胞等具有保護(hù)作用。甘草不管是做成中成藥還是作為湯藥熬服，最終都要經(jīng)口服進(jìn)入體內(nèi)，甘草中的眾多藥理活性成分具有被寄居在胃腸道的微生物菌群降解為不同代謝產(chǎn)物的可能性。1998年，Li等(Miological and Pharmaceutical Bulletin, 1998，12:1251-1257)在人尿液檢測(cè)到了甘草代謝產(chǎn)物達(dá)維莢蓮苷元(Davidigenin，簡(jiǎn)稱DG)，而DG在天然甘草提取物物中未能檢測(cè)到，故推測(cè)人體腸道微生物菌群可將LG轉(zhuǎn)化為DG。此后，Zuo等的研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)LG可被人腸道微生物菌群代謝為 DG {Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2002, 25:558-563)，然而，迄今國(guó)內(nèi)外尚未見任何利用單一微生物菌株將LG轉(zhuǎn)化為DG的報(bào)道。目前雖在某些植物中，如Vibui^um davidii Franch，Caprifoliaceae等，有分離得到天然DG的報(bào)道，但天然DG在植物細(xì)胞中的含量極低，試圖從天然植物中去規(guī)?；崛G幾乎是不可能的。有關(guān)DG的化學(xué)合成方法已有報(bào)道，但大多是通過在無氧條件下提供昂貴的化學(xué)催化劑鈀經(jīng)化學(xué)加氫來完成(歷aro aio^r，1997，11 125-231 )，所需成本高，且易造成環(huán)境污染。由于DG資源匱乏，有關(guān)其生理活性方面研究報(bào)道較少，但從目前已有研究結(jié)果看，DG除具有與LG相似的生理功能，如止咳、降糖等外，還表現(xiàn)出不同于LG的一些生理功能，如抑制人肺細(xì)胞纖維化，抗過敏和抗痙攣等。隨著DG生理功能研究的不斷深入，這意味著DG今后極有可能開發(fā)為不同于目前甘草藥效的其他新藥。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決了 DG資源缺乏的問題，提供一種紅椿菌AUH-Jul0ng21及紅椿菌 AUH-Julong21將甘草素高效轉(zhuǎn)化為DG的方法。本發(fā)明采取的技術(shù)方案為
一種紅椿菌(Cbrio如cieri腫 sp. ) AUH-Julong21，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5306。
W^M Coriobacterium sp. AUH_Julong21 (EU919864)是從人糞便中分離得到的一株革蘭氏陽性嚴(yán)格厭氧細(xì)菌菌株，該菌株在厭氧工作站內(nèi)能將中藥甘草提取物的水解物粗品(即甘草素粗品)高效轉(zhuǎn)化為DG。由于甘草素與甘草素異構(gòu)體在適宜酸堿條件下可能會(huì)相互轉(zhuǎn)化，經(jīng)推測(cè)是甘草素粗品在菌株Goridmcteriim sp. AUH-Julong21 (為方便書寫， 在這里將菌株Coriobacterium sp. AUH-Julong21簡(jiǎn)稱Julong21，以下均使用該轉(zhuǎn)化菌株的簡(jiǎn)稱形式，菌株Julong21與H Coriobacterium sp. AUH-Julong21為同一菌株)的培養(yǎng)物中首先自發(fā)轉(zhuǎn)變?yōu)楫惛什菟?，異甘草素再在菌株Julong21分泌的還原酶作用下被加氫還原成DG，有關(guān)DG微生物生物合成途徑推測(cè)如下所示。
權(quán)利要求
1.一種紅椿菌(Cbrio如Cieri腫 sp. ) AUH-Julong21，保藏號(hào)為 CGMCC No. 5306。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的紅椿菌AUH-JUlong21在甘草素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，其特征在于包括下述步驟(1)菌株Julong21的培養(yǎng)將低溫冷凍保存的紅椿菌Julong21融化并按15-20%接種量接種到盛有新鮮BHI液體培養(yǎng)基的試管中，在厭氧工作站內(nèi)37°C下培養(yǎng)M小時(shí)；再以10%接種量將試管中的菌株 Julong21重新轉(zhuǎn)接到盛有新鮮BHI液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)18- 小時(shí)作為種子液；(2)底物甘草素粗品與菌株JUlong21共培養(yǎng)與代謝產(chǎn)物的分離純化①底物甘草素粗品與菌株Julong21共培養(yǎng)將菌株JUlong21的種子液按10-15%接種量轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，根據(jù)甘草素粗品母液中底物甘草素濃度40-60毫摩爾/升及三角瓶中培養(yǎng)基體積，確定母液加入量，使得甘草素在培養(yǎng)基中的濃度為0. 2-0. 8毫摩爾/升，在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)2-3天，即可將底物甘草素粗品高效轉(zhuǎn)化為達(dá)維莢蓮苷元；②代謝產(chǎn)物的分離純化用等體積的乙酸乙酯將三角瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)物萃取2次，萃取液過濾后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制備柱在HPLC上進(jìn)行分離制備代謝產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紅椿菌AUH-Julong21及其在甘草素轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用，紅椿菌(Coriobacteriumsp.)AUH-Julong21，保藏號(hào)為CGMCCNo.5306。將菌株Julong21的種子液按10-15%接種量轉(zhuǎn)接到液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，加入甘草素粗品，在厭氧工作站內(nèi)培養(yǎng)2-3天；用乙酸乙酯將培養(yǎng)物萃取2次，萃取液過濾后蒸干，加入100%甲醇溶液，用制備柱在HPLC上對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分離制備。本發(fā)明的菌株能將甘草素粗品高效轉(zhuǎn)化為達(dá)維莢蒾苷元，當(dāng)濃度為0.4-1.6毫摩爾/升時(shí)，產(chǎn)物達(dá)維莢蒾苷元對(duì)二苯代苦味酰基自由基(DPPH)的體外清除率極顯著高于底物甘草素(p<0.01)。
文檔編號(hào)C12R1/01GK102367424SQ20111029679
公開日2012年3月7日 申請(qǐng)日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者張紅蕾, 王秀伶, 王銘 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)