專利名稱：一種微生物菌粉的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種微生物培養(yǎng)方法，尤其是一種適用于芽孢桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)和菌泥干燥的處理方法。
背景技術(shù)：
在微生物領(lǐng)域，常常涉及到菌種的培養(yǎng)、增殖，使菌株在一定的溫度條件下、在適宜的培養(yǎng)基中增殖以擴(kuò)大數(shù)量，滿足該菌種在人用藥、獸用藥、飼料、養(yǎng)殖等領(lǐng)域的使用需要。尤其是對(duì)于芽孢桿菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、酪酸梭菌等，都需要在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵、增殖，使活菌數(shù)量顯著增加。根據(jù)微生物生命周期理論，微生物生長過程可分為適應(yīng)期、對(duì)數(shù)生長期、平衡期、 死亡期。平衡期后的微生物因生長過程中底物濃度的降低、代謝產(chǎn)物的抑制、PH值的變化等生長環(huán)境的惡化及自身遺傳特性的影響導(dǎo)致微生物生長繁殖受到抑制，活菌數(shù)量開始減少，最終大量死亡。目前，國內(nèi)芽孢桿菌(如，酪酸梭菌)發(fā)酵主要采用傳統(tǒng)的分批低密度法發(fā)酵，該方法具有發(fā)酵液菌濃度低、菌粉活菌數(shù)不高，發(fā)酵系數(shù)低，產(chǎn)量低，能耗高，成本高等缺點(diǎn)。在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵后，一般都需要對(duì)發(fā)酵液采用離心分離或其他方式分離，獲得含菌量高的濕菌泥。由于活菌體在進(jìn)一步的加工及包裝、運(yùn)輸、存儲(chǔ)等過程中，其水分含量須滿足加工工藝及使用要求，故需要對(duì)含水量高的濕菌泥進(jìn)行干燥，除去其中多余的水分?，F(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)菌泥通常采用冷凍干燥法進(jìn)行干燥，該法工藝為凍結(jié)一升華干燥一解析干燥等過程，該法中對(duì)活菌凍干過程控制及凍干工藝的設(shè)計(jì)十分考究，嚴(yán)重影響活菌的數(shù)量，對(duì)其損傷較大；而且，冷凍干燥機(jī)采用的制冷劑主要是氟里昂，凍干機(jī)使用過程中必需損耗部分氟里昂，長期使用會(huì)使大氣中產(chǎn)生溫室效應(yīng)，對(duì)環(huán)境有一定的破壞作用；另外， 由于冷凍干燥過程時(shí)間長，耗電、耗油較高，能源消耗較大，相應(yīng)增大了生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中微生物發(fā)酵主要采用傳統(tǒng)的分批低密度法發(fā)酵方法、對(duì)發(fā)酵液離心分離得到的菌泥采用冷凍干燥，存在的發(fā)酵液菌濃度低、菌粉活菌數(shù)不高，發(fā)酵系數(shù)低，產(chǎn)量低，能耗高，成本高等不足，提供一種微生物菌粉的生產(chǎn)方法；該方法能大幅度提高芽孢桿菌(如酪酸梭菌)發(fā)酵液活菌數(shù)、大幅度提高發(fā)酵系數(shù)和產(chǎn)品質(zhì)量，大幅縮短生產(chǎn)周期，大大降低能耗和生產(chǎn)成本，而且能降低對(duì)環(huán)境的破壞。本發(fā)明的技術(shù)方案一種微生物菌粉的生產(chǎn)方法，其特征在于包含如下工藝步驟
(1)選擇合適的芽孢桿菌生產(chǎn)種子，采用常規(guī)的分離純化處理，使菌種活化；
(2)一級(jí)種子培養(yǎng)將活化后的芽孢桿菌菌種接種至一級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng)6-M小時(shí)；
(3)一級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟(2)所得的一級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60— 90°C，時(shí)間5—60分鐘；
(4)二級(jí)種子培養(yǎng)將熱處理后的一級(jí)種子接入二級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng) 6-24小時(shí)；
(5)二級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟(4)所得的二級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60— 90°C，時(shí)間5—60分鐘；
(6)三級(jí)種子培養(yǎng)將熱處理后的二級(jí)種子接入三級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng) 6-24小時(shí)；
(7)三級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟(6)所得的三級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60— 90°C，時(shí)間5—60分鐘；
(8)三級(jí)種子液冷處理對(duì)步驟(7)中熱處理后的三級(jí)種子進(jìn)行冷處理處理溫度2— 25°C，時(shí)間6—48小時(shí)；
(9)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(8)中進(jìn)行了冷處理的三級(jí)種子接入液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)16-36小時(shí)，使其活菌數(shù)及芽孢數(shù)量倍增；并根據(jù)動(dòng)態(tài)檢測發(fā)酵培養(yǎng)過程中的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充液體培養(yǎng)基和/或堿，發(fā)酵培養(yǎng)過程中的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)主要包括溫度、 C02濃度、pH值、殘?zhí)?、菌濃度、溶氧等；加入的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水中的一種，或兩種以上的混合物。(10)對(duì)步驟(9)中發(fā)酵液進(jìn)行分離后得到的菌泥內(nèi)，加入吸附劑，混合均勻；
所述的吸附劑，為淀粉、預(yù)膠化淀粉、面粉、玉米粉、脫脂奶粉、沸石粉、糖粉、乳糖中的一種，或其中兩種或兩種以上，以各自重量百分比大于0%的比例混合， 菌泥與吸附劑的重量比例，菌泥吸附劑為1 :(^100)； (11)將加入了吸附劑的菌泥邊粉碎、邊過篩，將菌體與吸附劑分離。以上所述的液體培養(yǎng)基，指一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子液體培養(yǎng)基，其包括如下重量百分比的組分蛋白胨0. 2%—3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀 0. 01%—0. 5%，硫酸鎂 0. 01%—0. 5%，其余為水。液體培養(yǎng)基的另外一種配方，其包括如下重量百分比的組分蛋白胨0.2%— 3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀0. 01%— 0. 5%，磷酸氫二鉀0. 01-0. 05%，硫酸鎂0. 01%—0. 5%，碳酸鈣0. 01-2. 0 %，其余為水。本發(fā)明根據(jù)微生物的生長規(guī)律，通過選育優(yōu)良種子、改善生長環(huán)境、提高種子對(duì)菌群密度的適應(yīng)能力達(dá)到較高的發(fā)酵液菌濃度。通過連續(xù)補(bǔ)料維持生長的最適底物濃度；通過連續(xù)補(bǔ)堿保證芽孢桿菌(酪酸梭菌)生長的最適PH值；通過發(fā)酵過程在線檢測與控制系統(tǒng)維持芽孢桿菌(酪酸梭菌)生長的最適環(huán)境條件(溫度、壓力、厭氧等)。從而保證發(fā)酵得到的菌液菌濃度達(dá)到較高的水平。本發(fā)明的微生物菌粉的生產(chǎn)方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)
1、大幅度提高發(fā)酵液活菌數(shù)(提高10倍)，大幅度提高發(fā)酵系數(shù)(提高10倍)，產(chǎn)量高， 能耗低，成本低，產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高5倍。2、實(shí)現(xiàn)操作簡單、工藝靈活操作，大大減少染菌、菌種退化等問題，整個(gè)發(fā)酵過程實(shí)現(xiàn)優(yōu)化控制，目的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率大大提高。
3、種子經(jīng)過熱處理和冷處理后發(fā)酵培養(yǎng)過程中微生物實(shí)現(xiàn)同步生長，所獲得的菌粉活菌數(shù)高，芽孢成熟快，芽孢轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高。4、用吸附法替代冷凍干燥法干燥濕菌體，充分利用吸附劑的吸水性強(qiáng)，從而使菌泥中水分與吸附劑重新分布，能快速降低菌體的水分含量。5、本發(fā)明的吸附法干燥濕菌體，操作簡單、生產(chǎn)周期短，菌體存活率高，對(duì)活菌基本沒有損傷；吸附法干燥基本不用電能和制冷劑氟里昂，能保護(hù)環(huán)境，降低能耗和生產(chǎn)成本。6、本發(fā)明能促進(jìn)我國微生態(tài)藥物工業(yè)的發(fā)展，進(jìn)而為患者減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)，提高人民生活質(zhì)量和水平。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明一種微生物菌粉的生產(chǎn)方法，其包含如下工藝步驟
1、選擇合適的芽孢桿菌生產(chǎn)種子，采用常規(guī)的分離純化處理，使菌種活化、復(fù)蘇；
2、一級(jí)種子培養(yǎng)將活化后的芽孢桿菌菌種接種至一級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng)6- 小時(shí)；
3、一級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟2所得的一級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60—90°C，時(shí)間5 — 60分鐘；
熱處理的作用，增加微生物生長的同步性、提高微生物對(duì)較高溫度的適應(yīng)能力，選得的菌種更耐高溫，使不能適應(yīng)高溫的菌種被淘汰；
4、二級(jí)種子培養(yǎng)將熱處理后的一級(jí)種子接入二級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng) 6-24小時(shí)；
5、二級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟4所得的二級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60—90°C，時(shí)間5 — 60分鐘6、三級(jí)種子培養(yǎng)將熱處理后的二級(jí)種子接入三級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng) 6-24小時(shí)；
7、三級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟6所得的三級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60—90°C，時(shí)間5 — 60分鐘；
8、三級(jí)種子液冷處理對(duì)步驟7中熱處理后的三級(jí)種子進(jìn)行冷處理處理溫度2— 25°C，時(shí)間6—48小時(shí)；
冷處理的作用，增加菌種生長的同步性、提高微生物對(duì)較低溫度的適應(yīng)能力，選得的菌種更耐低溫，使不能適應(yīng)低溫的菌種被淘汰；
菌種經(jīng)過熱處理和冷處理，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中微生物實(shí)現(xiàn)同步生長，所獲得的菌粉活菌數(shù)高，芽孢成熟快，芽孢轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵水平高，活菌收率高，活菌成活率高，酪酸梭菌活菌膠囊活菌數(shù)提高5倍。9、發(fā)酵培養(yǎng)將步驟8中進(jìn)行了冷處理的三級(jí)種子接入液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)16-36小時(shí)，使其活菌數(shù)及芽孢數(shù)量倍增；并根據(jù)動(dòng)態(tài)檢測發(fā)酵培養(yǎng)過程中的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充液體培養(yǎng)基和/或堿，發(fā)酵培養(yǎng)過程中的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)主要包括溫度、C02濃度、pH值、殘?zhí)恰⒕鷿舛?、溶氧等，都是發(fā)酵培養(yǎng)過程中的常規(guī)指標(biāo)和數(shù)據(jù)；
5發(fā)酵罐內(nèi)的溫度在30— 45°C，最佳溫度為37°C ；
在發(fā)酵過程中，需要進(jìn)行發(fā)酵過程PH值在線監(jiān)測與控制、發(fā)酵過程C02在線監(jiān)測、發(fā)酵過程溶氧在線監(jiān)測系統(tǒng)、發(fā)酵過程溫度、壓力在線監(jiān)測與控制、發(fā)酵過程氧化還原電位在線監(jiān)測與控制，獲得發(fā)酵罐內(nèi)的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，根據(jù)實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)向發(fā)酵罐內(nèi)連續(xù)或斷續(xù)(而且實(shí)時(shí)) 補(bǔ)充液體培養(yǎng)基和/或堿；滿足工藝要求的保持充足但又較低濃度的營養(yǎng)物的需要。加入的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水中的一種，或兩種或兩種以上的混合物。10、對(duì)步驟9中的發(fā)酵液進(jìn)行分離后，在得到的菌泥內(nèi)加入吸附劑，混合均勻；
所述的吸附劑，為淀粉、預(yù)膠化淀粉、面粉、玉米粉、脫脂奶粉、沸石粉、糖粉、乳糖中的一種，或其中兩種或兩種以上，以各自重量百分比大于0%的比例混合； 菌泥與吸附劑的重量比例，菌泥吸附劑為1 :(^100)；
吸附劑中的淀粉、預(yù)膠化淀粉、面粉、玉米粉、脫脂奶粉、沸石粉、糖粉、乳糖，其粒度較細(xì)，一般需過100目或以上篩，以滿足不同菌種分離需要的粒度；而且其水分最好控制在1% 以內(nèi)，以增強(qiáng)吸附效果。發(fā)酵液進(jìn)行常用的離心分離或其他方式分離，得到濕菌泥，濕菌泥的水分< 50%， 吸附劑的水分< 1% ；
菌泥與吸附劑的重量比例，可以為 1 8,1 10,1 12,1 15,1 :16，1 :18，1 -.20,1 :25，1 30，1 35,1 40,1 45,1 :50，1 :55，1 :60，1 :65，1 :68，1 :70，1 -J 2,1 :75，1 :80，1 :85，1 :90， 1 :95，1 :100等，都能滿足要求，適應(yīng)不同水分要求的菌種干燥、保存、運(yùn)輸?shù)鹊男枰?1、將加入了吸附劑的菌泥邊粉碎、邊過篩，將菌體與吸附劑分離。篩網(wǎng)目數(shù)滿足工藝要求，根據(jù)不同的菌種，選擇適用粒度的篩網(wǎng)，常用粒度為 80 100目；
所述的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)種子液體培養(yǎng)基，可以選用現(xiàn)有技術(shù)中適合芽孢桿菌的液體培養(yǎng)基；本發(fā)明提供兩種具體的、區(qū)別于現(xiàn)有技術(shù)的液體培養(yǎng)基，其包括如下重量百分比的組分
蛋白胨0. 2%—3. 0%,，酵母膏0. 3%—2. 0%,葡萄糖0. 3%—5. 5%,磷酸二氫鉀0. 01%— 0. 5%，硫酸鎂0. 01%—0. 5%，其余為水。液體培養(yǎng)基的另外一個(gè)配方為蛋白胨0. 2%—3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏 0. 3%—2. 0%,葡萄糖 0. 3%—5. 5%,磷酸二氫鉀 0. 01%—0. 5%,磷酸氫二鉀 0. 01-0. 05%,硫酸鎂0. 01%—0. 5%，碳酸鈣0. 01-2. 0 %，其余為水。本發(fā)明采用的高密度發(fā)酵技術(shù)(High cell density culture,簡稱HCDC)，實(shí)際上就是指補(bǔ)料分批發(fā)酵，該技術(shù)是在分批培養(yǎng)的前提下，連續(xù)或按某一規(guī)律向發(fā)酵系統(tǒng)中補(bǔ)充營養(yǎng)物，使發(fā)酵系統(tǒng)保持充足但又較低濃度的營養(yǎng)物，其優(yōu)點(diǎn)在于消除了快速利用碳源后造成阻遏效應(yīng)，避免了抑制性副產(chǎn)物的積累，避免了菌體快速生長而造成質(zhì)粒不穩(wěn)定的問題。該技術(shù)替代傳統(tǒng)發(fā)酵工藝進(jìn)行芽孢桿菌(酪酸梭菌)的工業(yè)化生產(chǎn)，能實(shí)現(xiàn)酪酸梭菌發(fā)酵液活菌數(shù)提高10倍，發(fā)酵系數(shù)提高10倍，產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高5倍，大大降低能耗和生產(chǎn)成本，從而推動(dòng)人體腸道益生菌的市場競爭能力，促進(jìn)我國微生態(tài)藥物工業(yè)的發(fā)展，進(jìn)而為患者減輕醫(yī)療負(fù)擔(dān)，提高人民生活質(zhì)量和水平。本發(fā)明用吸附法替代冷凍干燥法干燥濕菌體，充分利用吸附劑的吸水性強(qiáng)，從而使菌泥中水分與吸附劑重新分布，能快速降低菌體的水分含量。 吸附法干燥濕菌體，菌體存活率高，對(duì)活菌基本沒有損傷；而且基本不用電能和制冷劑氟里昂，能保護(hù)環(huán)境，降低能耗和生產(chǎn)成本。
權(quán)利要求
1.一種微生物菌粉的生產(chǎn)方法，其特征在于包含如下工藝步驟(1)選擇合適的芽孢桿菌生產(chǎn)種子，采用常規(guī)的分離純化處理，使菌種活化；(2)一級(jí)種子培養(yǎng)將活化后的芽孢桿菌菌種接種至一級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C 培養(yǎng)6-24小時(shí)；(3)一級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟(2)所得的一級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60— 90°C，時(shí)間5—60分鐘；(4)二級(jí)種子培養(yǎng)將熱處理后的一級(jí)種子接入二級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng) 6-24小時(shí)；(5)二級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟(4)所得的二級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60— 90°C，時(shí)間5—60分鐘；(6)三級(jí)種子培養(yǎng)將熱處理后的二級(jí)種子接入三級(jí)種子液體培養(yǎng)基中，30-40°C培養(yǎng) 6-24小時(shí)；(7)三級(jí)種子液熱處理對(duì)步驟(6)所得的三級(jí)種子液進(jìn)行熱處理處理溫度60— 90°C，時(shí)間5—60分鐘；(8)三級(jí)種子液冷處理對(duì)步驟(7)中熱處理后的三級(jí)種子進(jìn)行冷處理處理溫度2— 25°C，時(shí)間6—48小時(shí)；(9)發(fā)酵培養(yǎng)將步驟(8)中進(jìn)行了冷處理的三級(jí)種子接入液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)16-36小時(shí)，使其活菌數(shù)及芽孢數(shù)量倍增；并根據(jù)動(dòng)態(tài)檢測發(fā)酵培養(yǎng)過程中的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充液體培養(yǎng)基和/或堿；(10)對(duì)步驟(9)中發(fā)酵液進(jìn)行分離，在得到的菌泥內(nèi)加入吸附劑，混合均勻；所述的吸附劑，為淀粉、預(yù)膠化淀粉、面粉、玉米粉、脫脂奶粉、沸石粉、糖粉、乳糖中的一種，或其中兩種或兩種以上，以各自重量百分比大于0%的比例混合；菌泥與吸附劑的重量比例，菌泥吸附劑為1 :(^100)；(11)將加入了吸附劑的菌泥邊粉碎、邊過篩，將菌體與吸附劑分離。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述微生物菌粉的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基，其包括如下重量百分比的組分蛋白胨0. 2%—3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀0. 01%—0. 5%，硫酸鎂0. 01%—0. 5%，其余為水。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述微生物菌粉的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的液體培養(yǎng)基， 蛋白胨0. 2%—3. 0%，月示蛋白胨0. 1-3. 0%，酵母膏0. 3%—2. 0%，葡萄糖0. 3%—5. 5%，磷酸二氫鉀 0. 01%—0. 5%,磷酸氫二鉀 0. 01-0. 05%,硫酸鎂 0. 01%—0. 5%,碳酸鈣 0. 01-2. 0 %，其余為水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述微生物菌粉的生產(chǎn)方法，其特征在于所述的堿為氫氧化鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、氨水中的一種，或兩種或兩種以上的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種微生物菌粉的生產(chǎn)方法，其工藝步驟為對(duì)合適的生產(chǎn)種子經(jīng)一級(jí)種子培養(yǎng)后熱處理，處理溫度60—90℃，時(shí)間5—60分鐘；二級(jí)種子培養(yǎng)后熱處理；三級(jí)種子培養(yǎng)后熱處理和冷處理；再接入液體培養(yǎng)基中，在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)16-36小時(shí)；并根據(jù)動(dòng)態(tài)檢測發(fā)酵培養(yǎng)過程中的實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)向發(fā)酵罐內(nèi)補(bǔ)充液體培養(yǎng)基和/或堿；對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行分離后得到菌泥，將菌泥與吸附劑混合均勻，粉碎過篩即得菌粉。本發(fā)明的方法，大幅度提高發(fā)酵液活菌數(shù)、發(fā)酵系數(shù)高、產(chǎn)量高，能耗低，成本低，產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高；種子經(jīng)過熱、冷處理后發(fā)酵培養(yǎng)過程中微生物實(shí)現(xiàn)同步生長，所獲得的菌粉活菌數(shù)高，芽孢成熟快，芽孢轉(zhuǎn)化率高，發(fā)酵水平高，活菌收率和成活率高。
文檔編號(hào)C12R1/145GK102352329SQ20111029708
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月28日
發(fā)明者尚玉新, 江蘇華 申請(qǐng)人:重慶泰平藥業(yè)有限公司