專利名稱：一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)與基因工程領(lǐng)域，涉及一種基因工程中得以廣泛使用的 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA Marker)的生產(chǎn)方法。具體地，本發(fā)明涉及一種用于低成本快速生產(chǎn)高質(zhì)量DNA Marker的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法，同時(shí)涉及利用該質(zhì)粒生產(chǎn)DNA Marker的方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因工程又稱重組DNA技術(shù)，是指在體外在分子水平上對DNA進(jìn)行切割、連接、修飾等一系列操作的過程，是在分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的基礎(chǔ)上綜合發(fā)展起來，誕生于20 世紀(jì)70年代的一門嶄新的生物科學(xué)技術(shù)。盡管該技術(shù)是一門年輕的技術(shù)，但其在生命科學(xué)、生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域甚至是物理學(xué)、高分子科學(xué)等領(lǐng)域的研究和應(yīng)用中起到了非常巨大的作用。在對DNA的體外操作中，涉及到DNA分子的分離、純化、切割、修飾、連接、擴(kuò)增、序列測定等許多過程，其中，最基礎(chǔ)而且應(yīng)用非常廣泛的一項(xiàng)操作是DNA的電泳。DNA電泳是指利用DNA在中性緩沖液中帶負(fù)電的性質(zhì)，在一定的電場作用下，在特定的支持介質(zhì)中(比如瓊脂糖凝膠)，不同大小的DNA片段由于帶有的電荷量以及空間位阻等的不同而在支持介質(zhì)中具有不同的泳動速度從而得以分離的過程。DNA電泳是基因工程中最基本的技術(shù)， DNA制備、檢測、濃度測定、目的DNA片段的純化，重組子的酶切鑒定等均需要電泳完成。在凝膠電泳中，在一定的范圍內(nèi)，具有相同構(gòu)型的DNA在相同的凝膠濃度和電場強(qiáng)度下，其遷移率與DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的長度)呈線性關(guān)系。因此，可以用一組分子量(長度)已知的DNA片段混合物來指示未知DNA分子的大小。這種由一組分子量已知的，電泳后按其分子量大小和遷移率的不同可以在凝膠上形成一個(gè)DNA片段分布梯度，從而可以指示電泳過程中未知DNA樣品的分子量的DNA片段混合物就稱為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，簡稱DNA Marker。DNA Marker的應(yīng)用非常廣泛，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室的常用試劑。盡管實(shí)現(xiàn) DNAMarker的原理非常簡單，但要制作低成本高質(zhì)量的DNA Marker還是有相當(dāng)?shù)碾y度。目前各實(shí)驗(yàn)室中DNA Marker的使用大部分是從商業(yè)公司購買，而且由于DNA Marker是消耗品，每個(gè)實(shí)驗(yàn)室中的使用量非常大，具有廣闊而良好的市場前景。目前，許多生物公司也為此開發(fā)了多種針對不同應(yīng)用的，具有不同分子量范圍的DNAMarker產(chǎn)品。DNA Marker的制備上，目前主要有兩種方法PCR法和酶切法。PCR法實(shí)現(xiàn)簡單，通過PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，在DNA聚合酶的作用下，根據(jù)特定的模板設(shè)計(jì)特定的引物擴(kuò)增出一系列不同大小的DNA片段，通過純化、 定量和組合即形成了 DNA Marker。該方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、制作方便，各條帶的大小控制方便，不同大小的條帶可以靈活的組合成不同的DNAMarker。為了改善重復(fù)性和降低成本， 目前的主流方法已經(jīng)由獲得單一的DNA片度PCR向多重PCR(多對引物針對同一模板或一對引物針對多個(gè)面板的情況)技術(shù)發(fā)展。但其仍然存在成本較高，長片段擴(kuò)增困難或效率不高，條帶不夠銳利，條帶之間的亮度難以完全一致，重復(fù)性差等缺點(diǎn)。酶切法又分為以天然來源的基因組DNA的限制性酶切和基于人工構(gòu)建載體的限制性酶切。天然來源的基因組DNA酶切是指分離某種來源固定、背景信息清晰的基因組DNA 分子，用一種或幾種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，從而產(chǎn)生一系列DNA片段組合。用該方法生產(chǎn)的最經(jīng)典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker，Lambda噬菌體基因組DNA經(jīng)過內(nèi)切酶Hind III消化后，產(chǎn)生125bp至23130bp大小的8條條帶。用這種方法生產(chǎn)DNA Marker 制作方便，在DNA來源方便的情況下，成本也比較低。但其缺點(diǎn)也是顯然易見的1、條帶距離不均勻，由于來自天然的基因組，DNA分子上的酶切位點(diǎn)的位置也是天然的，是不可控的， 因此DNAMarker中有的兩個(gè)條帶之間相聚很遠(yuǎn)，不能清晰地指示該區(qū)域內(nèi)的未知DNA分子量情況，有的兩個(gè)條帶之間距離很近，難以清晰地分開；2、基于同樣的原因，條帶的分子量未能是整數(shù)；3、條帶亮度嚴(yán)重不均一，這也是最嚴(yán)重的問題，由于對應(yīng)片段在基因組中的拷貝數(shù)不可控，分子量大的條帶的亮度與分子量較小的條帶的亮度相差很遠(yuǎn)，以Lambda DNA/ Hind III Marker為例，最大的條帶23130bp與最小的條帶125bp在亮度上要相差上百倍， 電泳過程中往往導(dǎo)致大條帶未實(shí)現(xiàn)良好分離而小條帶已經(jīng)嚴(yán)重?cái)U(kuò)散導(dǎo)致亮度很低甚至不可見。為此，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，人們想到用人工構(gòu)建的DNA分子(比如質(zhì)粒)進(jìn)行限制性酶切來制備DNA Marker0通過一次性將所需要的片段以設(shè)計(jì)好的酶切方式連接到載體中，通過發(fā)酵培養(yǎng)和質(zhì)粒DNA提取，適當(dāng)酶切后既可獲得大量目標(biāo)DNA片段。這種方法的優(yōu)勢在于可以通過大腸桿菌的培養(yǎng)獲得大量廉價(jià)的質(zhì)粒DNA，通過酶切方法獲得的片段電泳時(shí)條帶銳利，生產(chǎn)重復(fù)性高，一旦質(zhì)粒構(gòu)建好，后續(xù)生產(chǎn)成本極低。酶切的方法又分為部分酶切和完全酶切。部分酶切是將具有某種單位長度而且?guī)в性O(shè)計(jì)好的酶切位點(diǎn)的片段順序連接到載體中，通過控制酶的活性、溫度和反應(yīng)時(shí)間等酶切條件，實(shí)現(xiàn)載體的部分酶切，酶切產(chǎn)物將是質(zhì)粒上該單位長度的倍數(shù)的片段。該方法適用于以單位長度遞增的DNA Marker (比如IOObp DNA Ladder，條帶為lOObp，200bp，300bp等依次遞增)的制備，其優(yōu)點(diǎn)是制備方便，條帶分布均勻，但其缺點(diǎn)是部分酶切的程度難以掌握，條帶亮度與酶切的完全程度相關(guān)。完全酶切是將設(shè)計(jì)好的一組不同大小的DNA片段克隆到特定的載體中，經(jīng)過大腸桿菌擴(kuò)增后，將純化得到的質(zhì)粒DNA通過完全酶切，獲得相應(yīng)大小的DNA片段。該方法制備的DNA Marker質(zhì)量較好，但其缺點(diǎn)是前期載體構(gòu)建復(fù)雜，而且目前所報(bào)道的利用完全酶切的方法產(chǎn)生的DNA Marker均未完美地解決不同大小的DNA片段在質(zhì)粒中的拷貝數(shù)的問題， 從而未能解決酶切后所得到的各條DNA分子之間亮度的均一性問題。綜上所述，在目前DNA Marker的生產(chǎn)過程中，主要采用的PCR擴(kuò)增的方式雖然簡單，但是一種勞動密集型的，難以保證批次之間重復(fù)性，從而難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，總體成本較高的方法。酶切法中的人工構(gòu)建DNA分子的酶切是將來技術(shù)發(fā)展的主流，但目前仍然存在前期載體分子構(gòu)建復(fù)雜，制備不同種類的Marker靈活性欠佳，后期制備過程中條帶亮度不能完全均一的瓶頸。本發(fā)明通過在載體構(gòu)建過程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷貝數(shù)，使得質(zhì)粒DNA通過完全酶切后，各條帶的量完全一致，從而實(shí)現(xiàn)DNA Marker在凝膠上的均一性，尤其是小條帶的亮度問題。同時(shí)，本發(fā)明利用同尾酶的特點(diǎn)和巧妙的設(shè)計(jì)思路極大地簡化此類DNA分子的構(gòu)建過程，大大提高了 DNA Marker制備的效率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種低成本DNA Marker生產(chǎn)和制備的方法。利用這種方法制備DNA Marker具有成本低、速度快，產(chǎn)物條帶均一、銳利，條帶間亮度均一性極佳的特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于DNA電泳過程中的分子量指示。本發(fā)明同時(shí)也提供了用于制備該DNA Marker的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法。本發(fā)明根據(jù)準(zhǔn)備生產(chǎn)的DNA Marker的條帶組成設(shè)計(jì)載體，使得可以用單一的酶釋放組成DNA Marker中的各片段，對載體中各片段拷貝數(shù)的設(shè)計(jì)使得酶切后得到的各條帶的量一致或可根據(jù)設(shè)計(jì)變化，從而實(shí)現(xiàn)所生產(chǎn)的DNA Marker的條帶間亮度的一致性或可根據(jù)設(shè)計(jì)變化。然后，將構(gòu)建好的質(zhì)粒擴(kuò)增后，用完全酶切的方法制備DNA Marker0由于該載體片段較多，按常規(guī)方法構(gòu)建復(fù)雜，工作量大，本發(fā)明利用同尾酶的特點(diǎn)對組成片段進(jìn)行拼裝，大大簡化了載體構(gòu)建的流程。本發(fā)明首先提供了一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒符合下列要求含有組成目標(biāo)DNAMarker的各大小不同的DNAMarker片段(為DNA片段)，各大小不同的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上(包括一個(gè))，且各DNA Marker 片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)。目標(biāo)DNA Marker的片段大小可以根據(jù)需求設(shè)計(jì)，可以是任意數(shù)量任意長度片段的組合。所述單酶切位點(diǎn)可以是II型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。較佳的，所述單酶切位點(diǎn)是任意片段內(nèi)不存在多余的識別位點(diǎn)而且不與載體構(gòu)建過程中的酶相沖突的II型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。更佳地，應(yīng)該選擇酶切效果好而且成本較低的酶切位點(diǎn)如Hind III，EcoR I，BamH I,Pst I等的酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步的，所述單酶切位點(diǎn)僅存在于各DNA Marker片段之間，不存在于各DNA Marker片段內(nèi)部。由于單一的酶釋放即能得到組成目標(biāo)DNA Marker的各片段，因此，質(zhì)粒中每兩個(gè)相鄰的所述單酶切位點(diǎn)之間的距離都應(yīng)等于目標(biāo)DNA Marker中某一 DNA片段的大小，即每兩個(gè)相鄰的所述單酶切位點(diǎn)之間的堿基數(shù)均與目標(biāo)DNAMarker中某一 DNA片段的堿基數(shù)相等。滿足上述設(shè)計(jì)要求的質(zhì)粒能用單一的酶釋放得到組成目標(biāo)DNA Marker的各片段。進(jìn)一步的，組成DNA Marker的各片段在該質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該片段的長度有關(guān)， 要達(dá)到同樣信號強(qiáng)度，長度越小的片段在質(zhì)粒中的拷貝數(shù)越高。進(jìn)一步的，某DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該DNA Marker片段長度的乘積，比上另一 DNAMarker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該另一 DNAMarker片段長度的乘積獲得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段與所述另一 DNA Marker片段的信號強(qiáng)度比值。艮P: (Na X Ca) (NbXCb) = Sa Sb其中，Na表示DNA Marker片段a的堿基數(shù)，Nb表示DNA Marker片段b的堿基數(shù)， Na Φ Nb ；Ca表示DNA Marker片段a在質(zhì)粒中的拷貝數(shù)，Cb表示DNA Marker片段b在質(zhì)粒中的拷貝數(shù)；Sa表示DNA Marker片段a的信號強(qiáng)度；Sb表示DNAMarker片段b的信號強(qiáng)
例如，質(zhì)粒中，IOObp大小的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)是200bp大小的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)的2倍，那么最終獲得的DNAMarker中，IOObp 大小的DNA Marker片段與200bp大小的DNA Marker片段的信號強(qiáng)弱比例即為1 1 ；再比如，質(zhì)粒中，IOObp大小的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與200bp大小的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)相等，那么最終獲得的DNA Marker中，IOObp大小的DNA Marker片段與200bp大小的DNA Marker片段的信號強(qiáng)弱比例即為1 2，其余以此類推?？梢酝ㄟ^調(diào)整各大小不同的DNA Marker片段的拷貝數(shù)來使得DNA Marker中，各大小不同的DNA Marker片段的信號強(qiáng)弱比例符合預(yù)期。較佳的，拷貝數(shù)與片段長度的關(guān)系為各條帶拷貝數(shù)與片段長度的乘積一致(為了便于觀察在DNA Marker中需要特意加強(qiáng)亮度的條帶除外)，保持這種關(guān)系使得組成DNA Marker的各條帶在質(zhì)粒酶切后，各片段的量相等，從而在凝膠上亮度一致。以目前廣泛使用的含有 6 條帶(lOObp, 250bp, 500bp, 750bp, IOOObp, 2000bp)的 DNA Marker 為例，如圖 1 所示，則該質(zhì)粒中，2000bp片段的拷貝數(shù)為1個(gè)，IOOObp片段的拷貝數(shù)為2個(gè)，500bp片段的拷貝數(shù)為4個(gè)，250bp片段拷貝數(shù)為8個(gè)，IOObp片段拷貝數(shù)為20個(gè)，750bp的片段為了加強(qiáng)顯示，拷貝數(shù)為4個(gè)，該條帶的亮度將是其他條帶的1. 5倍。則整個(gè)質(zhì)粒分子的結(jié)構(gòu)如圖2 所示，完整質(zhì)粒大小為13000bp，當(dāng)然，在構(gòu)建質(zhì)粒載體時(shí)，條帶之間的順序并不重要。所述質(zhì)粒應(yīng)當(dāng)與其他常用質(zhì)粒載體一樣，包括一些必須的元件，如復(fù)制子、抗性基因和篩選標(biāo)記。為便于設(shè)計(jì)，所述元件可以位于質(zhì)粒中堿基數(shù)最多的DNA Marker片段中。如實(shí)施例具體列舉的，所述制備DNA Marker的質(zhì)粒的DNA序列為SEQ ID NO 1。本發(fā)明還進(jìn)一步公開了符合上述設(shè)計(jì)要求的用于DNA Marker制備的質(zhì)粒的制備方法。從圖2可以看出，以該質(zhì)粒為例，質(zhì)粒共有39個(gè)條帶，如果按照常規(guī)的克隆，需要做38次克隆，工作量非常大，這也是為什么目前該方法未能在商業(yè)上廣泛使用的原因之一。本發(fā)明利用同尾酶的特點(diǎn)完成質(zhì)粒的構(gòu)建，極大地簡化了構(gòu)建過程。同尾酶是一類來源各異，識別序列不同，但切割DNA產(chǎn)生相同的，可以相互連接的粘性末端的限制性內(nèi)切酶， 常見的同尾酶對有 BamH I/Bgl II/Bcl I，Spe I/Xba I/Nhe I，Nco I/Pci I, Sal I/Xho I等。同尾酶的特點(diǎn)如圖3所示，以BamH I和Bal II為例，這兩個(gè)酶分別識別“GGATCC”和 “AGATCT”的DNA序列，酶切后留下相同的5，突出“GATC”的粘性末端，這兩個(gè)粘性末端匹配連接后，形成“GGATCT”的序列，該序列將不被BamH I或Bgl II中的任意一個(gè)切割。利用這個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行載體構(gòu)建，使得完成整個(gè)載體僅需要用到BamH I或Bgl II這兩個(gè)酶，極大地簡化了內(nèi)切酶的選擇和使用。具體構(gòu)建流程如圖4所示，首先在受體質(zhì)粒上引入一個(gè)BamH I和一個(gè)后期DNA Marker制備過程中用到的酶切位點(diǎn)(此處以Hind III為例)，在提供片段的供體載體上，片段的兩端分別引入BamH I和Bgl II位點(diǎn)，在其內(nèi)部引入一個(gè)Hind III 位點(diǎn)，所有片段中BamH I位點(diǎn)與Hind III之間的距離一致，從而保證每兩個(gè)Hind III位點(diǎn)之間的距離等于預(yù)設(shè)好的片段大小。構(gòu)建時(shí)，用BamH I單酶切受體質(zhì)粒并進(jìn)行去磷酸化處理以減少自連率，用BamH I和Bgl II雙酶切供體質(zhì)粒釋放片段，該片段與供體質(zhì)粒相連后，將形成一個(gè)帶有該片段的質(zhì)粒，由于BamH I與Bgl II相連后兩個(gè)酶切位點(diǎn)消失，所以該質(zhì)粒仍然只帶有一個(gè)BamH I位點(diǎn)。以同樣的方式，可以接受另一個(gè)片段，直到所有片段按照預(yù)定的方式進(jìn)入載體。由于本載體中涉及到的片段眾多，如果逐個(gè)添加，僅以20個(gè)IOObp的片段為例則需要19個(gè)克隆步驟才能完成整個(gè)載體。同樣地，本發(fā)明采用同尾酶的方法，如圖5所示，將這些片段按幾何級數(shù)的方式連接，則僅需要5個(gè)克隆步驟即可完成20個(gè)片段的連接。采用同樣的方式，構(gòu)建8個(gè)串聯(lián)的250bp片段，4個(gè)串聯(lián)的500bp片段，4個(gè)串聯(lián)的750bp片段和 2個(gè)串聯(lián)的IOOObp片段。本發(fā)明質(zhì)粒的制備方法具體包括如下的步驟(1)根據(jù)目標(biāo)DNA Marker的片段組成設(shè)計(jì)目標(biāo)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒滿足下列要求含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNAMarker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上(包括一個(gè))，且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)；(2)確定用于質(zhì)粒構(gòu)建的同尾酶對，確定用于完全酶切法制備DNA Marker的所述單酶切位點(diǎn)對應(yīng)的酶；(3)選擇高拷貝數(shù)質(zhì)粒作為骨架載體并在其中引入一個(gè)所述同尾酶對中任意一個(gè)同尾酶的酶切位點(diǎn)和一個(gè)所述單酶切位點(diǎn)，構(gòu)建完成的骨架載體中，所述同尾酶的酶切位點(diǎn)及所述單酶切位點(diǎn)均為唯一。(4)制備組成目標(biāo)DNA Marker的各個(gè)條帶的DNA Marker前體片段，并分別連接到中間載體中獲得各DNA Marker前體片段的中間載體，這些前體片段兩端為所述同尾酶對的酶切位點(diǎn)，中間包含一個(gè)所述單酶切位點(diǎn)，各DNA Marker前體片段中所述單酶切位點(diǎn)離片段某一端的距離一致，且各DNA Marker前體片段中該端的同尾酶酶切位點(diǎn)相同，在構(gòu)建完成的中間載體中，所述同尾酶對中任一同尾酶的酶切位點(diǎn)及所述單酶切位點(diǎn)均為唯一。(5)將中間載體中的各DNA Marker前體片段依次連接起來，構(gòu)建到步驟3制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質(zhì)粒。步驟1中目標(biāo)質(zhì)粒的設(shè)計(jì)還可進(jìn)一步滿足之前所述的各種要求。步驟2中，所述同尾酶對應(yīng)的酶切位點(diǎn)應(yīng)不同于所述單酶切位點(diǎn)。進(jìn)一步的，步驟3構(gòu)建的骨架載體中，引入的同尾酶酶切位點(diǎn)應(yīng)當(dāng)至少包括步驟4 制備的所有DNA Marker前體片段中，與所述單酶切位點(diǎn)距離一致的一端所含的同尾酶酶切位點(diǎn)，且在骨架載體與步驟4制備的所有DNA Marker前體片段中，該同尾酶酶切位點(diǎn)與所述單酶切位點(diǎn)的距離一致。步驟4中，所述DNA Marker前體片段中，所述同尾酶對的酶切位點(diǎn)之間的堿基數(shù)與其對應(yīng)的DNA Marker片段相同，兩者的不同在于如圖6所示，若以前體片段中與所述單酶切位點(diǎn)距離一致的一端所在的同尾酶酶切位點(diǎn)到所述單酶切位點(diǎn)的序列為A，所述單酶切位點(diǎn)到前體片段中另一同尾酶酶切位點(diǎn)的序列為B，那么所述DNA Marker前體片段中， 所述同尾酶對的酶切位點(diǎn)之間的序列就為A-B，而與其對應(yīng)的DNA Marker片段的序列就為 B-A。步驟4中，制備組成DNA Marker的各個(gè)條帶的DNA Marker前體片段的方法可采用各種現(xiàn)有的制備DNA片段的方法，包括但不限于用PCR或酶切的方法、化學(xué)合成等。進(jìn)一步的，步驟5可分別以步驟4獲得的各DNA Marker前體片段的中間載體為起點(diǎn)，反復(fù)利用同尾酶酶切及拼接的方式獲得含有各DNA Marker前體片段串聯(lián)重復(fù)片段的中間載體，直至各DNA Marker前體片段的中間載體中，DNA Marker前體片段的拷貝數(shù)達(dá)到設(shè)計(jì)要求；而后再次利用同尾酶酶切及拼接的方式，將含有符合設(shè)計(jì)DNA Marker前體片段拷貝數(shù)要求的各中間載體中的DNA Marker前體片段拼接入步驟3制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質(zhì)粒。所述同尾酶對是指，兩個(gè)識別不同DNA序列但酶切后產(chǎn)生相同DNA末端的限制性內(nèi)切酶。適用于本發(fā)明中的同尾酶對可以是，但不局限于BamH I/Bgl II/BclI中的任意兩個(gè)，Spe I/Xba I/Nhe I 中的任意兩個(gè)，Nco I/Pci I，Sal I/Xho I 等。所述高拷貝數(shù)質(zhì)粒是指，可以存在于細(xì)菌體內(nèi)的，其復(fù)制與細(xì)菌基因組DNA的復(fù)制不關(guān)聯(lián)的，在單個(gè)細(xì)菌體內(nèi)可以達(dá)到300個(gè)拷貝數(shù)以上的質(zhì)粒。適用于本發(fā)明的質(zhì)粒可以是，但不局限于PUC系列，pBluescript系列，pGEM系列，pTZ系列等。所述中間載體可選自pUC18，pUC19,pUC57, pBR322, pUCm-T，pSG-TS，pMD18_T， PMD19-T等多種克隆載體。本發(fā)明還提供了一種DNA Marker的制備方法，包括下列步驟A.構(gòu)建前述用于制備DNA Marker的質(zhì)?；蛘咧苯硬捎脴?gòu)建好的用于制備 DNAMarker 的質(zhì)粒；B.將步驟A所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入合適的宿主菌后擴(kuò)增質(zhì)粒；C.分離質(zhì)粒并采用所述單酶切位點(diǎn)對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶完全酶切質(zhì)粒獲得DNA Marker。所述的宿主菌可以是大腸桿菌。所述完全酶切法制備DNA Marker是指，用一個(gè)或多個(gè)限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒DNA過量消化，使得質(zhì)粒上的每一個(gè)該酶的識別位點(diǎn)均被切開，釋放相應(yīng)大小的片段。所述用于完全酶切法制備DNA Marker的所述單酶切位點(diǎn)對應(yīng)的酶是指，用于切割質(zhì)粒后產(chǎn)生如設(shè)計(jì)所示的各DNA條帶的酶。適用于本發(fā)明中的該酶可以是質(zhì)粒中除了片段相連處之外的序列中不含有的任意II型限制性內(nèi)切酶，更佳地，宜選用成本較低的酶，如 Hind III，BamH I, EcoR I，Pst I 等。當(dāng)采用實(shí)施例列舉的序列為SEQ ID NO 1的質(zhì)粒制備DNA Marker時(shí)，可將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌復(fù)制，并采用Hind III完全酶切質(zhì)粒獲得DNA Marker.采用本發(fā)明的方法用制備DNA Marker具有如下優(yōu)點(diǎn)1、所制備的Marker條帶銳利，尤其是條帶間亮度均一性極佳。2、前期載體構(gòu)建好后，后期Marker生產(chǎn)成本很低，生產(chǎn)量可大可小，縮放非常方便。3、穩(wěn)定性高，生產(chǎn)過程簡單，批次間重復(fù)性極好。4、解決了前期載體構(gòu)建流程復(fù)雜的問題，本發(fā)明的方法可以方便地拓展用于不同種類DNA Marker的制備。


圖1是DNA Marker組成片段大小與拷貝數(shù)的關(guān)系示意2是用于制備DNA Marker的質(zhì)粒DNA及其中的片段大小與拷貝數(shù)關(guān)系示意3是同尾酶酶切位點(diǎn)的特點(diǎn)示意圖
10
圖4是同尾酶在本發(fā)明中的應(yīng)用原理示意5是相同長度的片段幾何倍數(shù)克隆原理示意6DNA Marker前體片段及其對應(yīng)的DNA Marker片段示意圖a :DNA Marker前體片段示意圖b 對應(yīng)的DNA Marker片段示意7是不同長度的片段幾何倍數(shù)克隆原理示意8是實(shí)施例中所述DNA Marker瓊脂糖凝膠電泳效果圖
具體實(shí)施例方式下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，旨在進(jìn)一步舉例說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明所要保護(hù)的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1一種通用小分子量DNA Marker的制備本實(shí)施例講述一種通用的小分子量DNA Marker的制備，該Marker含有6個(gè)DNA 條帶，分別為2000bp，IOOObp, 750bp, 500bp, 250bp, IOObp,是目前在各實(shí)驗(yàn)室中應(yīng)用最為廣泛的DNA Marker，為了易于識別，我們對750bp的條帶亮度進(jìn)行了加強(qiáng)。如未特別注明，本實(shí)施例中所用的生化試劑以及PCR或核酸提取與純化試劑盒等均來自生工生物工程(上海)有限公司；所有引物合成均由生工生物工程(上海)有限公司采用固相亞磷酰胺三酯法合成，用聚丙烯酰胺凝膠電泳方法純化；所有DNA序列測定均由生工生物工程(上海)有限公司采用雙脫氧鏈終止法結(jié)合Applied Biosystems 3730/3730x1 DNA Analyzers儀器分析；所有限制性內(nèi)切酶均采購自富酶泰斯生物技術(shù) (深圳)有限公司(Fermentas China Co.，Ltd.)。如未特別注明，本實(shí)施例中所用的PCR反應(yīng)體系為
10 X PCR buffer5 μ L
25 mM MgSO43 μ L
2. 5 mM dNTP mix2 μ L
Primer F (10 μ mol/L)2 μ L
Primer R (10 μ mol/L)2 yLPlasmid DNA (50 ng/μ )0. 1 μ L
細(xì)2035 μ L
tag DNA polymerase_1 μ L
Total volume50 μ L反應(yīng)程序94V for 2min, (94 V for 15sec，65 V ramp to 58 V for 15sec，72 "C for 80sec) XlOcycles, (94 "C for 15sec，58 "C for 15sec，72 "C for 80sec) X20cycles,72°C for 2min。如未特別注明，本實(shí)施例中所用PCR產(chǎn)物或酶切產(chǎn)物均用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離，用EB染色后于紫外線下觀察，DNA定量均用Bio-Tek公司微孔板微量分光光度計(jì)測定。如未特別注明，本實(shí)施例中所用的限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)體系為
10 χ Buffer 5 μ L BSA (10 mg/ml) 0.5 μ L Target DNA (50 ng/μ ) 10 μ L Restriction Enzyme (5 U/μ 1) 2 μ L ddH20_32. 5 μ L
Total volume50 μ L反應(yīng)條件為37°Cfor 3hour0如未特別注明，本實(shí)施例中所用的DNA連接反應(yīng)體系為
10 χ Buffer 2 μ L DNA fragment A 0.5 μ L DNA fragment B 0. 5 μ L T4 DNA ligase (5 U/μ 1) 2 μ L ddH20_15 μ L
Total volume20 μ L反應(yīng)條件為16°Cfor 3hour。如未特別注明，本實(shí)施例中所用的轉(zhuǎn)化菌株為大腸桿菌DH5 α。如未特別注明，本實(shí)施例中所用的DNA去磷酸化酶為小牛堿性磷酸酶(CIP)反應(yīng)體系為10 X Buffer 2 μ L DNA fragment 0.5 μ L CIP (5 U/μ 1) 2 μ L ddH20_15 μ L
Total volume20 μ L反應(yīng)條件為37°C for 30min,75°C for IOmin0反應(yīng)結(jié)束后，用DNA膠回收或PCR Cleanup試劑盒的方法回收目標(biāo)片段。1. 1載體分子的設(shè)計(jì)根據(jù)本發(fā)明的方法，本實(shí)施例中選擇克隆載體pUC18為骨架載體，帶有氨芐青霉素抗性基因；選用Hind III作為完全酶切法制備DNA Marker的酶；選則BamH I/Bgl II作為同尾酶對；每個(gè)片段中的Hind III位點(diǎn)位于BamH I端，相隔Obp。根據(jù)本發(fā)明的方法， 用于制備該DNA Marker的質(zhì)粒總大小為13000bp，以Hind III為間隔，其中包含2000bp片段1個(gè)拷貝，IOOObp片段2個(gè)拷貝，750bp片段4個(gè)拷貝，500bp片段4個(gè)拷貝，250bp片段 8個(gè)拷貝，IOObp片段20個(gè)拷貝。該質(zhì)粒的完整序列如SEQ ID NO. 1所示。1. 2各目標(biāo)DNA前體片段的獲得1. 2. 12000bp 前體片段合成弓丨物 p2000F(5，-cgcggatccaagcttgctcactgactcgctgcg-3‘)禾口 p2000R( 5，-cgcggatccgacgaaagggcctcgtgata-3‘)，以載體 pUC18 質(zhì)粒 DNA 為模板，用 taq DNA polymerase進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的2000bp片段用BamH I酶切后進(jìn)行自身環(huán)化。轉(zhuǎn)化大腸桿菌篩選正確的克隆，該質(zhì)粒命名為P2000-1。該質(zhì)粒的完整序列如SEQ ID N0. 2所示。1. 2. 2 IOOObp 前體片段合成弓I物 pl000F(5，-ggatccaagcttggcaagcataagcacacaga-3‘)禾口 pl000R(5，-a gatctcaccgcttcagaagttcaca-3‘)，VX Lambda ΒΜ Ι ' Φ DNA 1 , M taqDNA polymerase 3 行擴(kuò)增，獲得的IOOObp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體PSG-TS中，選用該載體的原因是，該載體多克隆位點(diǎn)被移除，后續(xù)酶切釋放片段時(shí)不會產(chǎn)生干擾。轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質(zhì)粒命名為plOOO-1。該片段的序列如SEQ ID N0. 3所示。1. 2. 3750bp前體片段合成弓I物 p750F(5，-ggatccaagcttcgccaccatggtgagc-3‘)和 p750R(5，-agatct tcgcggccgctttac-3’)，以載體 pEGFP-Nl 為模板，用 taq DNApolymerase 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的 750bp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體 pSG-TS中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質(zhì)粒命名為P750-1。該片段的序列如SEQ ID N0. 4所示。1. 2. 4500bp 前體片段合成弓I物 p500F(5，-ggatccaagcttatttccccgaaaagtgcc-3‘)禾口 p500R(5，-agat ctgcgaatgggacgcg-3')，以載體 pET30a 為模板，用 taq DNA polymerase 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的 500bp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體 pSG-TS中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質(zhì)粒命名為P500-1。該片段的序列如SEQ ID N0. 5所示。
1. 2. 5250bp 前體片段合成弓丨物 P250F (5，-ggatccaagctttcgcgcgtttcggt-3，)和 p250R(5，-agatctcgcc tgatgcggtatttt-3，)，以載體pUC18 為模板，用 taq DNApolymerase 進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的 250bp 片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體pSG-TS 中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質(zhì)粒命名為P250-1。該片段的序列如SEQ ID NO. 6 所示。1. 2. 6100bp 前體片段合成弓丨物 pl00F(5，-ggatccaagcttcaactcaaccctgtccgatt-3，)禾口 pl00R(5，~aga tctggacaggaccagcatacgat-3‘)，Lambda ΒΜ Ι ' Φ DNA 1 , M taqDNA polymerase 3 ^ff 擴(kuò)增，獲得的IOObp片端，將該片段用TA克隆的方法克隆至生工生物工程(上海)有限公司提供的載體PSG-TS中。轉(zhuǎn)化大腸桿菌并篩選正確克隆，該質(zhì)粒命名為plOO-1。該片段的序列如SEQ ID NO. 7所示。以上載體均進(jìn)行DNA序列測定確定插入片段的長度。1. 3前體片段的幾何級數(shù)拼裝用BamH I單酶切質(zhì)粒ρ100_1，回收大片段，并將該片段進(jìn)行去磷酸化處理；用 BamH I和Bgl II雙酶切同樣的質(zhì)粒pl00_l，回收IOObp大小的小片段；將該片段與上述載體連接，轉(zhuǎn)化后挑選正確克隆，則得到一個(gè)還有2個(gè)拷貝IOObp片段的載體，這兩個(gè)片段上分別帶有Hind III酶切位點(diǎn)且這兩個(gè)位點(diǎn)之間的距離為lOObp，該質(zhì)粒命名為plOO-2。以載體plOO-2為起始載體，用同樣的方法獲得帶有4個(gè)拷貝IOObp片段的載體plOO-4。以載體plOO-4為起始載體，用同樣的方法獲得帶有4個(gè)拷貝IOObp片段的載體plOO-8。以載體 plOO-8為起始載體，用同樣的方法獲得帶有4個(gè)拷貝IOObp片段的載體plOO-16。用BamH I單酶切質(zhì)粒plOO-16，回收大片段，將其與用BamH I和Bgl II雙酶切從pl00_4上獲得的片段連接，形成帶有20個(gè)拷貝IOObp片段的載體P100-20。以同樣的方法獲得帶有8個(gè)拷貝250bp片段的載體P250-8 ；帶有4個(gè)拷貝750bp 片段的載體P750-4 ；帶有4個(gè)拷貝500bp片段的載體p500-4 ；帶有2個(gè)拷貝IOOObp片段的載體 ρ 1000-2。1.4終載體的組裝用BamH I單酶切質(zhì)粒p2000_l，回收大片段，并將該片段進(jìn)行去磷酸化處理；用 BamH I和Bgl II雙酶切質(zhì)粒pl00_20，回收大小為2000bp的片段；將該片段連接到上述載體中，轉(zhuǎn)化后挑選陽性克隆。重復(fù)同樣的步驟，直至上述各種大小的重復(fù)片段均進(jìn)入骨架載體中，終載體命名為PSDM2000。經(jīng)測序，載體的序列為SEQ ID NO :1。1. 5DNA Marker 的制備將pSDM2000質(zhì)粒以常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將帶有pSDM2000質(zhì)粒的大腸桿菌大量繁殖，用堿裂解法結(jié)合柱式DNA純化法抽提質(zhì)粒。用Hind III對質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，反應(yīng)
體系如下10 X Buffer 50 μ L BSA (10 mg/ml) 5 μ L PSDM2000 DNA (100 ng/μ ) 250 μ L Η η III (5 U/μ 1) 25 μ L ddH20_170 μ L
Total volume500 μ L反應(yīng)條件為37°Cfor IOhours。反應(yīng)結(jié)束后，按照1 5的比例加入6x DNA Loading Buffer，所制備的Marker即可應(yīng)用于瓊脂糖凝膠電泳。如圖8所示，三個(gè)泳道上樣量分別為3ul，5ul和8ul，可以看到該DNA Marker條帶分布均勻，亮度均一(750bp條帶如設(shè)計(jì)所示有亮度增強(qiáng)的效果)，符合本發(fā)明的設(shè)計(jì)要求。
權(quán)利要求
1.一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒，所述質(zhì)粒含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上， 且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，所述單酶切位點(diǎn)為II 型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
3.如權(quán)利要求1所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，所述單酶切位點(diǎn)選自 Hind III, EcoR I.BamH I 或 I3St I 的酶切位點(diǎn)。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，所述單酶切位點(diǎn)僅存在于各DNA Marker片段之間，不存在于各DNA Marker片段內(nèi)部，且質(zhì)粒中每兩個(gè)相鄰的所述單酶切位點(diǎn)之間的距離均對應(yīng)等于目標(biāo)DNA Marker中某一 DNA片段的大小。
5.如權(quán)利要求4所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，組成目標(biāo)DNAMarker 的各大小不同的片段在該質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該片段的長度有關(guān)，要達(dá)到同樣信號強(qiáng)度，長度越小的片段在質(zhì)粒中的拷貝數(shù)越高。
6.如權(quán)利要求5所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，某DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該DNA Marker片段長度的乘積，比上另一 DNAMarker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該另一DNA Marker片段長度的乘積獲得的比值，等于DNA Marker中，所述某DNA Marker片段與所述另一 DNAMarker片段的信號強(qiáng)度比值。
7.如權(quán)利要求5所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，各DNA Marker片段拷貝數(shù)與片段長度的關(guān)系為各DNA Marker片段拷貝數(shù)與片段長度的乘積一致。
8.如權(quán)利要求1所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，所述質(zhì)粒的DNA序列為 SEQ ID NO :1ο
9.一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒的制備方法，包括下列步驟(1)根據(jù)目標(biāo)DNAMarker的片段組成設(shè)計(jì)目標(biāo)質(zhì)粒，設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒滿足下列要求 含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNAMarker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上，且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)；(2)確定用于質(zhì)粒構(gòu)建的同尾酶對，確定用于完全酶切法制備DNAMarker的所述單酶切位點(diǎn)對應(yīng)的酶；(3)選擇高拷貝數(shù)質(zhì)粒作為骨架載體并在其中引入所述同尾酶對中任意一個(gè)同尾酶的酶切位點(diǎn)和一個(gè)所述單酶切位點(diǎn)，構(gòu)建完成的骨架載體中，所述同尾酶的酶切位點(diǎn)及所述單酶切位點(diǎn)均為唯一；(4)制備組成DNAMarker的各個(gè)條帶的DNA Marker前體片段，并分別連接到中間載體中獲得各DNA Marker前體片段的中間載體，這些片段兩端為所述同尾酶對的酶切位點(diǎn)，中間包含一個(gè)所述單酶切位點(diǎn)，各DNA Marker前體片段中所述單酶切位點(diǎn)離片段某一端的距離一致，且各DNA Marker前體片段中該端的同尾酶酶切位點(diǎn)相同，在構(gòu)建完成的中間載體中，所述同尾酶對中任一同尾酶的酶切位點(diǎn)及所述單酶切位點(diǎn)均為唯一；(5)將中間載體中的各DNAMarker前體片段依次連接起來，構(gòu)建到步驟(3)制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質(zhì)粒。
10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中，所述同尾酶對應(yīng)的酶切位點(diǎn)應(yīng)不同于所述單酶切位點(diǎn)。
11.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，步驟(5)為分別以步驟(4)獲得的各DNA Marker前體片段的中間載體為起點(diǎn)，反復(fù)利用同尾酶酶切及拼接的方式獲得含有各 DNA Marker前體片段串聯(lián)重復(fù)片段的中間載體，直至各DNA Marker前體片段的中間載體中，DNA Marker前體片段的拷貝數(shù)達(dá)到設(shè)計(jì)要求；而后再次利用同尾酶酶切及拼接的方式， 將含有符合設(shè)計(jì)DNA Marker前體片段拷貝數(shù)要求的各中間載體中的DNA Marker前體片段拼接入步驟3制備的骨架載體中，形成可以用于DNA Marker制備的質(zhì)粒。
12.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述同尾酶對選自BamHI/Bgl II/Bcl I中的任意兩個(gè)，Spe I/Xba I/Nhe I中的任意兩個(gè)，Nco I/Pci I或Ml I/Xho I。
13.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述中間載體選自pUC18，pUC19， pUC57, pBR322, pUCm-T，pSG-TS，pMD18_T 或 pMD19_T。
14.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，所述單酶切位點(diǎn)為II型限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。
15.如權(quán)利要求14所述的制備方法，其特征在于，所述單酶切位點(diǎn)選自HindIII.EcoR I、BamH I或I3St I的酶切位點(diǎn)。
16.如權(quán)利要求9-15任一權(quán)利要求所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒中，所述單酶切位點(diǎn)僅存在于各DNA Marker片段之間，不存在于各DNA Marker片段內(nèi)部，且質(zhì)粒中每兩個(gè)相鄰的所述單酶切位點(diǎn)之間的距離均對應(yīng)等于目標(biāo)DNA Marker中某一 DNA片段的大小。
17.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒中，組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的片段在該質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該片段的長度有關(guān)，要達(dá)到同樣信號強(qiáng)度，長度越小的片段在質(zhì)粒中的拷貝數(shù)越高。
18.如權(quán)利要求17所述的制備方法，其特征在于，步驟(1)設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒中，某 DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該DNA Marker片段長度的乘積，比上另一 DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)與該另一 DNAMarker片段長度的乘積獲得的比值，等于 DNA Marker中，所述某DNA Marker片段與所述另一 DNA Marker片段的信號強(qiáng)度比值。
19.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其特征在于，步驟⑴設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒中，各DNA Marker片段拷貝數(shù)與片段長度的關(guān)系為各DNA Marker片段拷貝數(shù)與片段長度的乘積一致。
20.如權(quán)利要求1所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒，其特征在于，步驟(1)設(shè)計(jì)的目標(biāo)質(zhì)粒的DNA序列為SEQ ID NO :1。
21.—種DNA Marker的制備方法，包括下列步驟A.采用權(quán)利要求9-20任一權(quán)利要求所述制備方法構(gòu)建用于制備DNAMarker的質(zhì)粒； 或者直接采用權(quán)利要求1-8任一權(quán)利要求所述用于DNAMarker制備的質(zhì)粒；B.將步驟A所述質(zhì)粒轉(zhuǎn)入合適的宿主菌后擴(kuò)增質(zhì)粒；C.分離質(zhì)粒并采用所述單酶切位點(diǎn)對應(yīng)的限制性內(nèi)切酶完全酶切質(zhì)粒獲得DNA Marker0
22.如權(quán)利要求21所述一種DNAMarker的制備方法，其特征在于，所述的宿主菌為大腸桿菌。
23.如權(quán)利要求21所述一種DNAMarker的制備方法，其特征在于，步驟A所述質(zhì)粒為序列為SEQ ID NO :1的質(zhì)粒，步驟B所述宿主菌為大腸桿菌，步驟C所述限制性內(nèi)切酶為 Hind III。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于DNA Marker制備的質(zhì)粒及其構(gòu)建方法與用途。本發(fā)明所述質(zhì)粒含有組成目標(biāo)DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述質(zhì)粒中的拷貝數(shù)為一個(gè)以上，且各DNA Marker片段之間含有同樣的單酶切位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了低成本快速制備DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)的方法，用該方法生產(chǎn)的DNA Marker具有條帶銳利，亮度均一或可隨意控制，批次間重復(fù)性好等特點(diǎn)。
文檔編號C12N15/70GK102337284SQ20111029762
公開日2012年2月1日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者萬軍飛, 李威 申請人:生工生物工程(上海)有限公司