專利名稱：低甲基化基因elfn2的應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及低甲基化基因ELFN2在制備腦膠質(zhì)瘤病人預(yù)后預(yù)測(cè)試劑中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腦膠質(zhì)瘤是人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，約占神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的40. 49%。 盡管目前采用手術(shù)治療聯(lián)合化療和放療的方法，膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后仍非常差。據(jù)報(bào)道，膠質(zhì)瘤病人的5年生存率低于25%，而膠質(zhì)瘤母細(xì)胞瘤的病人總生存時(shí)間平均為12. 3個(gè)月。目前，對(duì)腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后判定沒有參考標(biāo)準(zhǔn)，也沒有特異性的指標(biāo)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行預(yù)后判定的需求。因此，對(duì)人腦膠質(zhì)瘤進(jìn)行預(yù)后判定，以便選擇最佳治療方案，顯著提高患者生存率，一直是科學(xué)研究亟待解決的重要課題。表觀遺傳機(jī)制，包括高/低甲基化、組蛋白修飾或非編碼RNA表達(dá)在腫瘤的形成過程中發(fā)揮著重要作用。DNA甲基化狀態(tài)的改變是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的重要標(biāo)志，而低甲基化在多種腫瘤形成中起著非常重要的作用，其中包括腦膠質(zhì)瘤。DNA低甲基化可導(dǎo)致基因表達(dá)增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，如胃癌中R-Ras、cyclin D2及maspin ；黑色素瘤中MAGE ；結(jié)腸癌中S100A4等基因。近年來(lái)，以DNA甲基化為代表的腫瘤表觀遺傳學(xué)及其在臨床診斷、化療敏感性和預(yù)后評(píng)價(jià)等方面的應(yīng)用價(jià)值，已經(jīng)愈來(lái)愈受到研究者的重視。FENl 基因啟動(dòng)子低甲基化導(dǎo)致其在乳腺癌中高表達(dá)，并且其低甲基化狀態(tài)與預(yù)后相關(guān)。PRAME基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、乳腺癌及卵巢腺癌中因低甲基化而高表達(dá)，PRAME低甲基化病人預(yù)后更差。LlCAM CpG島低甲基化致其在結(jié)直腸癌中表達(dá)增加，且與腫瘤進(jìn)展相關(guān)。⑶H3基因在結(jié)直腸癌中低甲基化，與腫瘤分級(jí)相關(guān)。由此可見，基因低甲基化在探尋腫瘤分子標(biāo)志物方面具有巨大潛力。利用亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR法(BSP)分析所獲得的腫瘤特異性甲基化狀態(tài)，是甲基化分析的金標(biāo)準(zhǔn)，它能明確所測(cè)區(qū)域每一個(gè)CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)。ELFN2 基因(Extracellular leucine-rich repeat and fibronectin type III domain containing〗)定位于染色體 22ql3. 1，GeneBank 登錄號(hào)NM_052906。ELFN2 在腦組織各個(gè)區(qū)域的軸突中有表達(dá)。申請(qǐng)人的研究表明該基因在腦組織、肝組織中表達(dá)，在腦膠質(zhì)瘤、肝細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，在部分纖維結(jié)締組織中表達(dá)，而在肺組織和結(jié)腸粘膜及其來(lái)源的腫瘤中不表達(dá)(見圖1)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ELFN2蛋白在正常腦組織及腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示ELFN2在膠質(zhì)瘤中表達(dá)增加(圖1)。亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR結(jié)果顯示， ELFN2在膠質(zhì)瘤中發(fā)生低甲基化。并用SPSS 13. 0軟件對(duì)ELFN2蛋白表達(dá)與ELFN2基因低甲基化進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明兩者間存在相關(guān)性(P < 0. 01)，說明表觀遺傳學(xué)可能參與了 ELFN2基因的表達(dá)調(diào)控。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種低甲基化基因ELFN2的應(yīng)用方法，對(duì)于腦膠質(zhì)瘤的預(yù)后預(yù)測(cè)具有重要意義。
低甲基化基因ELFN2用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑；特別是用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查的試劑盒。如用于制備亞硫酸氫鹽直接測(cè)序法預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤的制劑；所述的制劑中包括 根據(jù)ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島設(shè)計(jì)的，采用亞硫酸氫鹽直接測(cè)序法的引物序列為F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘，R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。一種用于人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)試劑盒，包括以下引物F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘，R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。申請(qǐng)人:發(fā)現(xiàn)ELFN2基因在腦膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)上調(diào)(圖1)。ELFN2轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-788至-114bp為一典型的CpG島(圖2)，該CpG島中CG位點(diǎn)在正常的腦組織中均處于高甲基化狀態(tài)，而在ELFN2表達(dá)上調(diào)的腦膠質(zhì)瘤組織中其甲基化程度降低(部分結(jié)果見圖3)。ELFN2低甲基化的膠質(zhì)瘤病人總生存率明顯低于高甲基化的病人(圖4)，提示ELFN2 基因是膠質(zhì)瘤中的低甲基化基因，是預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤預(yù)后的分子標(biāo)志。本發(fā)明為腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持和分子生物學(xué)基礎(chǔ)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。申請(qǐng)人:在上述研究基礎(chǔ)上，制備了用于人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)試劑盒。該試劑盒包括ELFN2啟動(dòng)子區(qū)亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR試劑盒及用于檢測(cè)ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的引物。


圖1為ELFN2蛋白在多種組織及腫瘤中的表達(dá)；A 結(jié)腸粘膜；B 結(jié)腸腺癌；C 肺組織；D 肺癌；E 肝組織；F 肝細(xì)胞癌；G 腦組織；H 膠質(zhì)瘤(I級(jí))。其中A-F的放大倍數(shù)為10X20，G和H的放大倍數(shù)為10X40 ；圖2為ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)_788bp至_114bp為一典型的CpG島；淺藍(lán)色區(qū)域?yàn)镃pG島，橫坐標(biāo)下紅色豎線為CG位點(diǎn)；圖3為正常腦組織和膠質(zhì)瘤組織中ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)結(jié)果；圖中所示為部分結(jié)果，N2 第2例正常腦組織；N4 第4例正常腦組織；T2 第2例膠質(zhì)瘤組織；T6 第6例膠質(zhì)瘤組織。〇表示非甲基化位點(diǎn)， 表示甲基化位點(diǎn)，每一行表示一個(gè)克隆中所有CG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)，計(jì)算5個(gè)克隆中的甲基化比率進(jìn)行比較。結(jié)果表明，正常腦組織中ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島為高甲基化狀態(tài)，而膠質(zhì)瘤組織中該CpG島發(fā)生低甲基化；圖4ELFN2啟動(dòng)子低甲基化與膠質(zhì)瘤病人預(yù)后的關(guān)系圖。綠色曲線表示ELFN2基因啟動(dòng)子甲基化的膠質(zhì)瘤病人的生存狀況及時(shí)間，藍(lán)色曲線表示ELFN2基因啟動(dòng)子發(fā)生低甲基化的膠質(zhì)瘤病人的生存狀況及時(shí)間。用SPSS 13. 0軟件進(jìn)行Kaplan-Meier檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p = 0. 030)，說明ELFN2低甲基化的病人預(yù)后較高甲基化的病人差。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1 米用 Promoterscan, Genomatix Promoter Inspector 及 CpGplot 等生物信息學(xué)軟件對(duì)ELFN2基因5’端序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明ELFN2基因的啟動(dòng)子區(qū)域可能位于_1037bp至-219bp處(以起始密碼子ATG中A為+1)。Methl primer express軟件和在線軟件Methprimer分析ELFN2啟動(dòng)子預(yù)測(cè)區(qū)域_1037bp至_219bp，結(jié)果顯示為一 CpG 島，設(shè)計(jì)并合成ELFN2啟動(dòng)子區(qū)的甲基化引物，5 ‘ AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3' (F)， 5‘ AACAACTCCTCACCCAAATC 3' (R)，對(duì)10例正常腦組織進(jìn)行經(jīng)亞硫酸鹽處理后的基因組測(cè)序(BSP)，發(fā)現(xiàn)ELFN2基因啟動(dòng)子CpG島中CpG位點(diǎn)在正常的腦組織均處于甲基化狀態(tài)。 同時(shí)對(duì)不同級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本(I級(jí)6例，II級(jí)20例，III級(jí)12例，IV級(jí)12例)50例， 進(jìn)行了 ELFN2啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)82%的腦膠質(zhì)瘤組織中ELFN2的啟動(dòng)子區(qū)發(fā)生低甲基化，與正常腦組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0. 05)，各級(jí)膠質(zhì)瘤的ELFN2啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平?jīng)]有明顯的差異(P > 0.05)(見表1)。ELFN2啟動(dòng)子區(qū)低甲基化的病人預(yù)后較甲基化病人的差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0. 030)。以上研究結(jié)果提示，ELFN2基因是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的腦膠質(zhì)瘤甲基化基因，是一個(gè)膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)標(biāo)志。操作步驟(一 )亞硫酸氫鹽修飾樣品gDNA制備選擇已商品化的亞硫酸氫鹽修飾試劑盒。( 二)亞硫酸氫鹽直接測(cè)序PCR (BSP)試劑盒的使用內(nèi)容該試劑盒包括用于檢測(cè)ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化的PCR引物5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3' (F)5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3' (R)PCR擴(kuò)增體系(_20°C保存)原理利用BSP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增ELFN2啟動(dòng)子區(qū)CpG島。步驟1取經(jīng)亞硫酸氫鹽修飾后的樣品gDNA4 μ 1 (總量約IOOng)，加入含甲基化引物 2 μ 1 的 PCR 擴(kuò)增體系(50 μ 1)，使用 Takara 公司的 EmeraldAmp PCR Master Mix (含 DNA 聚合酶、緩沖液及dNTP混合物)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為
EmeraldAmp PCR Master Mix 25μ DNA (25ng/pl)4μ1甲基化引物(20ηΜ)2μ1
H2O19μ1
總體系50μ1 2加樣后，置PCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下
權(quán)利要求
1.低甲基化基因ELFN2的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因ELFN2用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因ELFN2用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查的試劑盒。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的低甲基化基因ELFN2用于制備亞硫酸氫鹽直接測(cè)序法預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤的制劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的制劑中包括根據(jù)ELFN2 基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島設(shè)計(jì)的，采用亞硫酸氫鹽直接測(cè)序法的引物序列為F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘， R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。
5.一種用于人腦膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)的ELFN2基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括以下引物F 5' AAGTTTGTTTTTAGTTGTTGAATG 3‘， R 5' AACAACTCCTCACCCAAATC 3‘。
全文摘要
本發(fā)明涉及低甲基化基因ELFN2的應(yīng)用，即用于制備腦膠質(zhì)瘤診斷、預(yù)測(cè)、檢測(cè)或篩查制劑。特別是用于制備亞硫酸氫鹽直接測(cè)序法預(yù)測(cè)腦膠質(zhì)瘤預(yù)后的制劑。通過研究證實(shí)ELFN2在膠質(zhì)瘤組織中因啟動(dòng)子發(fā)生低甲基化而高表達(dá)，將檢測(cè)ELFN2基因低甲基化應(yīng)用于膠質(zhì)瘤預(yù)后預(yù)測(cè)，為預(yù)測(cè)膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后提供強(qiáng)有力的分子生物學(xué)依據(jù)，具有深遠(yuǎn)的臨床意義和推廣性。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102352412SQ20111029928
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月29日
發(fā)明者余志斌, 劉曉萍, 卞艷慧, 唐海林, 李桂源, 武明花, 王澤友 申請(qǐng)人:中南大學(xué)