專利名稱：一種經(jīng)濟(jì)的應(yīng)用大規(guī)模平行測序技術(shù)檢驗(yàn)多目標(biāo)多基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)診斷和生物技術(shù)，涉及一種應(yīng)用大規(guī)模平行測序同時(shí)檢驗(yàn)多目標(biāo)相關(guān)基因突變的方法，具體的是一種采用大規(guī)模平行測序平臺(tái)技術(shù)結(jié)合優(yōu)化后的目標(biāo)基因捕獲技術(shù)。背景知識(shí)下一代測序技術(shù)(Next Generation Sequencing)又稱為二代測序技術(shù)當(dāng)前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物研究領(lǐng)域。其代表技術(shù)為羅氏公司(Roche)的妨4測序儀(Roche GS FLX sequencer)，Illumina 公司的 Solexa 基因組分析儀(IlluminaGenome Analyzer)禾口 ABI 的 SOLiD測序儀(ABI SOLiD sequencer)。它們的共同特點(diǎn)為1.集成了生物醫(yī)學(xué)、計(jì)算機(jī)、微電子學(xué)、光學(xué)、材料科學(xué)和精密加工等多學(xué)科技術(shù)。 例如，Roche GS FLX sequencer的圖像采集技術(shù)就借鑒現(xiàn)代天文望遠(yuǎn)鏡的光學(xué)系統(tǒng)技術(shù)， 即超高分辨率的CCD集成光纖束技術(shù)。2.測序策略主要基于循環(huán)芯片測序法(Cyclic-array sequencing)，即制備DNA 文庫，單分子擴(kuò)增，在固相載體上形成DNA簇陣列，并行地利用DNA聚合酶或者連接酶進(jìn)行酶促反應(yīng)(模板變性、引物退火雜交、延伸或連接)，同時(shí)讀取反應(yīng)產(chǎn)生的特異性熒光信號(hào)， 最終得到超大量的DNA序列信息。3.高通量并行測序。例如，Roche GS FLX sequencer—次就可對上百萬條DNA分子同時(shí)進(jìn)行序列測定，一次運(yùn)行通量達(dá)到400Mb以上，而傳統(tǒng)測序(一代測序)一輪測序的通量僅為80Kb左右。4.單分子測序。傳統(tǒng)測序(一代測序)是對多個(gè)DNA分子的混合物進(jìn)行測序，其測序結(jié)果是多個(gè)DNA分子綜合的序列信息；而二代測序先對單個(gè)DNA分子進(jìn)行PCR以放大 DNA分子數(shù)量(相當(dāng)于單個(gè)DNA分子的克隆復(fù)制)，再對這些DNA分子進(jìn)行測序，就可以得到原來單個(gè)DNA分子的序列信息。新一代測序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域相當(dāng)廣泛，除了在科研領(lǐng)域(例如通過人類基因組上的SNP位點(diǎn)、基因缺失、基因拷貝數(shù)變異來分析研究人類基因的多態(tài)性等)，在臨床醫(yī)學(xué)及食品安全領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用前景。(一 )臨床醫(yī)學(xué)1.遺傳病的診斷遺傳病是一種人類基因組DNA缺陷，即由基因突變或染色體畸變造成的疾病，包括單基因遺傳病、多基因遺傳病和染色體異常遺傳病等。通過下一代測序技術(shù)強(qiáng)大的測序能力，就可分析出待檢者的全部基因組中哪部分基因存在缺陷，一方面可以找到很多病因不明的遺傳病的致病基因，另一方面結(jié)合產(chǎn)前篩查，可以有效的避免遺傳病患兒的誕生，這對提高我們中華民族的人口質(zhì)量，減少出生缺陷、殘疾等至關(guān)重要。2.傳染性疾病的快速診斷傳染性疾病的突然爆發(fā)造成嚴(yán)重的公共安全威脅，但在疾病爆發(fā)初期往往沒有有效的檢測手段能快速鑒定出病原體，特別是未知的病原體。一個(gè)典型例子就是2003年的 SARS(傳染性冠狀病毒肺炎)，是由一種具有強(qiáng)傳染性的新型冠狀病毒在人群中快速傳播引起。而通過下一代測序技術(shù)，我們可快速檢測分析出一個(gè)個(gè)體內(nèi)基因組中有無外來病原體的基因序列，根據(jù)這些序列信息就能鑒定出人群中感染的病原體，為較短時(shí)間內(nèi)制定疫情防控策略提供科學(xué)依據(jù)和堅(jiān)實(shí)保障，避免疾病的大規(guī)模爆發(fā)流行。3.個(gè)體化醫(yī)療由于人類全基因組測序工作的完成以及對疾病與基因關(guān)系的深入研究，現(xiàn)在的臨床醫(yī)學(xué)已由群體治療向個(gè)體化醫(yī)療轉(zhuǎn)變，即根據(jù)個(gè)體的遺傳學(xué)信息來針對性的制定預(yù)防疾病的措施以及合理的治療方案。腫瘤的靶向治療就是一個(gè)成功應(yīng)用。另外，臨床研究表明很多重大疾病往往與多個(gè)基因密切相關(guān)，而不是由單個(gè)基因決定。這些都需要我們對個(gè)體的遺傳學(xué)信息有全面準(zhǔn)確的了解，因此具有強(qiáng)大的測序能力的下一代測序技術(shù)顯得至關(guān)重要。(二)食品安全在食品安全領(lǐng)域，下一代測序技術(shù)同樣有著廣泛應(yīng)用的前景。食品安全是各國公共安全的焦點(diǎn)，其中相當(dāng)重要的問題是致病微生物污染食品導(dǎo)致的食源性疾病。根據(jù)世衛(wèi)組織統(tǒng)計(jì)，每年全球發(fā)生的食源性疾病數(shù)以億計(jì)。發(fā)達(dá)國家如美國每年因食源性疾病帶來的醫(yī)療費(fèi)用及相關(guān)損失達(dá)幾十億美元。此外，群體食源性疾病的爆發(fā)還會(huì)給社會(huì)帶來嚴(yán)重的公共安全問題。由于可污染食品的致病微生物種類繁多，如何及時(shí)有效地檢測出食品中致病微生物是哪一種，目前仍是一個(gè)巨大挑戰(zhàn)。下一代測序技術(shù)是一個(gè)很好解決方案，利用其強(qiáng)大測序能力，可同時(shí)對食品中等所有微生物的基因組進(jìn)行測序，有效鑒定出食品是否存在以及何種致病微生物污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種經(jīng)濟(jì)的應(yīng)用大規(guī)模平行測序技術(shù)檢驗(yàn)多目標(biāo)多基因的方法。這個(gè)方法可以平行進(jìn)行多樣本的目的基因捕獲，提高基因平行測序的通量和效率，降低每個(gè)樣品的檢驗(yàn)成本。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種新的多重目標(biāo)捕獲再測序方法， 其特征在于包括以下步驟a.設(shè)計(jì)并制備用于捕獲目的基因片段的突變捕獲探針。并將這些探針結(jié)合在磁珠、薄膜或者玻片上。b.將待測基因組DNA樣品分別片段化至100_500bp，然后將末端補(bǔ)平，加入的ATP 使片段兩端引入粘性末端。c.分別加入設(shè)計(jì)好的一端帶有標(biāo)簽序列的接頭序列片段，加入連接酶，使每個(gè)片段都與一對接頭連接，形成新的片段。標(biāo)簽序列的設(shè)定位置在接頭的粘性末端。接頭序列見附表1。d.調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度激活DNA聚合酶，用一對標(biāo)準(zhǔn)引物，引物序列見附表2。對步驟c 所得不同基因組完成接頭連接的片段序列混合后進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。e.將步驟d所得PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物與步驟a所設(shè)計(jì)的捕獲探針雜交，雜交反應(yīng)后通過多次洗脫純化反應(yīng)，得到待測片段。
f.將待測片段通過大規(guī)模平行DNA測序平臺(tái)的標(biāo)準(zhǔn)方案進(jìn)行測序。g.將得到的測序結(jié)果同標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比較，得到診斷結(jié)果。為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)方案，步驟a所述的捕獲探針可以是脫氧核糖核酸(DNA)，也可以是核糖核酸(RNA)組成，但不僅限于DNA和RNA。附

圖1是探針設(shè)計(jì)示意圖。探針的長度從IObp至IOObp不等的與目標(biāo)互補(bǔ)的片段組成，最優(yōu)為22bp。探針以疊瓦式設(shè)計(jì)，完整覆蓋全部待測基因片段和兩端50bp范圍的序列。探針間重疊部分為3-10bp最優(yōu)為^p。覆蓋率根據(jù)區(qū)域特點(diǎn)可以設(shè)定為1X-10X，最優(yōu)為3X。(見附圖)其中，步驟c所述的接頭在引物結(jié)合區(qū)的下游設(shè)計(jì)標(biāo)簽，標(biāo)簽?zāi)┒藶檎承阅┒丝梢院突蚪M片段結(jié)合。其中，步驟d的引物能夠在同樣條件下效率均一地?cái)U(kuò)增含有不同標(biāo)簽接頭的片段，擴(kuò)增出的片段包含作為標(biāo)簽的堿基序列。本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于1)本發(fā)明的方法可以在一次測序反應(yīng)中同時(shí)進(jìn)行全部目的基因的檢測；全部序列直接測出，準(zhǔn)確率可以達(dá)到99. 99%。沒有額外的無效數(shù)據(jù)，極大提高了測序效率。2)本發(fā)明的方法可以一次完成1-12個(gè)樣品的平行捕獲，極大地降低了樣品準(zhǔn)備的成本，提高了樣品準(zhǔn)備效率。3)本發(fā)明的試劑盒可以一次完成8-96個(gè)樣品的所有目的基因檢測甚至全外顯子檢測，充分利用設(shè)備的高通量特性，極大降低了每個(gè)樣品的測序成本。4)本發(fā)明的檢測方法步驟簡單，因而避免了復(fù)雜操作過程中存在的諸多不確定引物，提高了檢測準(zhǔn)確率和穩(wěn)定性。5)本發(fā)明所提供的檢測方法所需時(shí)間大大少于Sanger法的測序技術(shù)，檢測的準(zhǔn)確度大大優(yōu)于基因芯片技術(shù)，更符合臨床等實(shí)際檢測要求。
具體實(shí)施例方式下面用實(shí)施例僅是對本發(fā)明實(shí)際應(yīng)用的舉例描述，本發(fā)明的實(shí)際應(yīng)用不僅限于以下實(shí)施例實(shí)施例一、肥厚型心肌病221 例檢測 MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、TNNl3, TNNCU ACTCl、TPMl、TTN、CSRP3、DES、DMD、LDB3、VCL, TCAP, PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、MYPN、TMPO, ANKRD1、PSENl、PSEN2、ABCC9、SGCD, DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA, MURC 基因外顯子，尋找新的突變位點(diǎn)。一、探針設(shè)計(jì)根據(jù)人類基因組數(shù)據(jù)庫公布的基因MYH7、MYH6、MYBPC3、TNNT2、 TNNI3、TNNCl、ACTCl、TPMl、TTN、CS RP3、DES、DMD、LDB3、VCL、TCAP、PLN、NEXN、ACTN2、FKTN、 MYPN、TMPO, ANKRDl、PSENl、PSEN2、ABCC9、SGCD、DSG2、EYA4、DSP、SCN5A、LMNA, MURC 的外顯子序列設(shè)計(jì)合成探針，探針為RNA，在目標(biāo)區(qū)段疊瓦式設(shè)計(jì)，探針長度20bp，重疊區(qū)域恥？， 覆蓋范圍達(dá)到目標(biāo)區(qū)段兩端15bp。采用agilent公司的Sureklect緩沖系統(tǒng)體系。二、基因組提取采用 Qiagen FlexiGene DNA Kit (Code No :51204)進(jìn)行提取待測 96份樣本的基因組，OD值達(dá)到1. 8-2. 0，各取5ug做為起始模板。三、測序前樣品制備1)目的基因片段化取定量過的96份基因組DNA，稀釋至每100 μ L中含有5 μ g基因組DNA，即50ng/ μ L0取110 μ L，用超聲破碎儀分別進(jìn)行片段化。2)末端補(bǔ)平取1. 5mL EP管，96份基因組樣品分別按下表所示，在冰盒上加入各種試劑，保持冰浴狀態(tài)
權(quán)利要求
1.一種應(yīng)用大規(guī)模平行測序技術(shù)同時(shí)檢驗(yàn)多目標(biāo)相關(guān)基因突變的方法其特征在于所述方法包括以下步驟a.設(shè)計(jì)并制備捕獲目標(biāo)區(qū)域的探針；b.將多個(gè)待測DNA樣品分別連接到設(shè)計(jì)好的加了特異性標(biāo)簽的接頭；c.將經(jīng)過步驟b所得的不同樣品的DNA片段混合然后使用設(shè)計(jì)好的通用引物進(jìn)行擴(kuò)增；d.將處理好的待測DNA片段混合物和步驟a所得探針加入反應(yīng)管中，DNA樣本與探針雜交，通過洗脫得到待測的目標(biāo)片段；；e.調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度激活DNA聚合酶，用一對通用引物對步驟d所得序列同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；f.將步驟e所得PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物通過大規(guī)?；蚱叫蟹治銎脚_(tái)進(jìn)行測序。g.根據(jù)標(biāo)簽特征分別對不同來源的基因樣本比對進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針可以是寡聚核糖核酸(RNA)，也可以是寡聚脫氧核糖核酸(DNA)，但是不僅限于RNA和DNA，可以包括修飾后的DNA或者RNA等。
3.權(quán)利要求2所述探針以疊瓦式設(shè)計(jì)，完整覆蓋全部待測基因序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針可以是結(jié)合在磁珠上的，也可以結(jié)合在載玻片上，但不僅限于這介質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的特異性標(biāo)簽序列其特征在于；標(biāo)簽序列位于接頭的最內(nèi)側(cè)， 通過粘性末端與待測片段結(jié)合；接頭5’和3’端分別進(jìn)行磷酸化和硫化修飾。
6.這種方法可以廣泛應(yīng)用于多樣品的基因測序，適用于遺傳性疾病的診斷、食品衛(wèi)生和公共衛(wèi)生行業(yè)大批量檢測的需要。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)濟(jì)的應(yīng)用大規(guī)模平行測序技術(shù)檢驗(yàn)多目標(biāo)多基因的方法。具體的是一種采用大規(guī)模平行測序平臺(tái)技術(shù)結(jié)合優(yōu)化后的目標(biāo)基因捕獲技術(shù)。本發(fā)明的方法可以一次完成1-12個(gè)樣品的平行捕獲，極大地降低了樣品準(zhǔn)備的成本，提高了樣品準(zhǔn)備效率。同時(shí)通過特異性的標(biāo)簽可以實(shí)現(xiàn)一次96個(gè)樣品的同時(shí)上機(jī)檢驗(yàn)。這個(gè)方法有效利用大規(guī)模平行測序平臺(tái)樣品通量大、效率高的優(yōu)勢，操作簡便，極大地降低了測序檢驗(yàn)成本。適用于臨床醫(yī)療基因診斷和食品衛(wèi)生等公共衛(wèi)生安全檢驗(yàn)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102344961SQ20111029951
公開日2012年2月8日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月30日
發(fā)明者侯青 申請人:康旭基因技術(shù)(北京)有限公司