專利名稱：檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析方法，特別是涉及一種通過流動方式測量存在于病人外周血樣和其他細胞樣品中的腫瘤細胞相干散射光所形成的波長及偏振可調(diào)的衍射圖像信號，計算提取其與細胞內(nèi)部三維結構特征高度相關的圖像特征，可自動快速準確辯別腫瘤細胞并提供其分布數(shù)據(jù)的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法。
背景技術：
研究人員發(fā)現(xiàn)源于人體上皮組織的惡性實體腫瘤是最為普遍的癌癥，如肺癌、 乳癌、前列腺癌、胰腺癌和結腸直腸癌等。惡性實體腫瘤在原位發(fā)育過程中會生成自有的微血管系統(tǒng)，腫瘤細胞可直接或通過微血管進入血液循環(huán)系統(tǒng)，稱為循環(huán)腫瘤細胞 (circulating tumor cells或CTCs)。循環(huán)腫瘤細胞可隨血細胞一起進入身體的淋巴結及其他器官，一旦生長條件合適，循環(huán)腫瘤細胞會在所寄居的器官組織中形成轉(zhuǎn)移瘤后不斷增殖，以此為標志開始腫瘤轉(zhuǎn)移擴散期。目前大量臨床研究已證明癌癥病人外周血樣中的循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量與腫瘤轉(zhuǎn)移擴散程度直接相關，其數(shù)量與類型測定可作為腫瘤分期與治療效果的生物學依據(jù)。所以如能在腫瘤轉(zhuǎn)移擴散形成之前發(fā)現(xiàn)并定量測量外周血樣中的循環(huán)腫瘤細胞，可實現(xiàn)癌癥的早期檢查；還可為制定個體化癌癥治療方案與治療過程中調(diào)整治療劑量提供可靠的生物學依據(jù)。除外周血樣外，其他細胞樣品如取自惡性腫瘤附近的淋巴結的針吸細胞等也可能包括腫瘤細胞，其檢測與計數(shù)可為癌癥早期診斷和治療提供可靠的病理依據(jù)。
目前癌癥診斷檢查方法一般基于影像學方法，如χ光計算斷層影像、超聲影像、核磁共振影像和正電子發(fā)射斷層影像等。影像方法則只能檢測尺寸在2毫米以上的腫瘤，難以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移或復發(fā)，一般無法確診。病理細胞分析檢查是最為常用的癌癥確診方法，但病理檢查一般需要經(jīng)過專業(yè)訓練的病理醫(yī)生進行，成本高且易受主觀因素影響。與病理檢查與影像方法相比，循環(huán)腫瘤細胞檢測可成為一種用于癌癥早期診斷的高靈敏度方法，并可提供轉(zhuǎn)移癌準確分期依據(jù)，為癌癥病人治療方案的制定提供生物學監(jiān)測數(shù)據(jù)，因此近年來對外周血樣中循環(huán)腫瘤細胞以及其他血樣中的腫瘤細胞測量的方法研究受到了極大重視。目前尚未見到有關淋巴結的針吸細胞自動檢測儀器的研究報道。
盡管腫瘤細胞的測量可成為癌癥早期診斷和治療監(jiān)測的有效方法，但由于人體外周血樣中的循環(huán)腫瘤細胞的數(shù)量極小，其準確測定難度極大。在取自早期轉(zhuǎn)移癌病人的體積為7. 5毫升的外周血樣中，各種血細胞如血小板、紅細胞和白細胞等的數(shù)量級一般為100 億或IOltl個，而循環(huán)腫瘤細胞可能只有幾到十幾個。盡管如此，由于絕大多數(shù)血細胞的體積、密度和/或其他特性與循環(huán)腫瘤細胞相比有較大差別，所以實現(xiàn)在外周血樣中檢測循環(huán)腫瘤細胞是可能的，但如何能夠在血樣中眾多的血液細胞及碎片中快速可靠地檢測數(shù)量極少的循環(huán)腫瘤細胞并對其分類是一個困難的技術問題。
目前外周血樣中循環(huán)腫瘤細胞的測量方法通常由兩階段組成富集和檢測。富集階段一般采用傳統(tǒng)的細胞分類方法將外周血樣中的絕大多數(shù)血細胞去掉，如使用具有不同大小和形狀微孔的薄膜過濾，或在密度梯度介質(zhì)中離心分離等。檢測階段目前一般使用免疫熒光顯微檢測或免疫熒光流式儀方法，通過殘余血細胞與循環(huán)腫瘤細胞之間對不同熒光試劑吸附特性檢測后者。例如現(xiàn)在最常用的臨床方法為美國Veridex公司生產(chǎn)的 Cellkarch系統(tǒng)，使用鍍有可與循環(huán)腫瘤細胞結合的免疫磁性納米球，基于循環(huán)腫瘤細胞對納米磁球的吸附對其進行離心分離富集，然后再對富集后的細胞進行免疫熒光染色顯微檢測。盡管該方法可對外周血樣中的循環(huán)腫瘤細胞進行定量測量并具有提供與目前方法相比更為準確的預后評估指標，但其手續(xù)繁復，測量成本高而且靈敏度低，應用范圍有限，因此亟待改進。
如上所述循環(huán)腫瘤細胞一般為上皮細胞。與血小板(平均線性尺寸約為2至4微米)、紅細胞(平均線性尺寸約為5至7微米)、白細胞(平均線性尺寸約為8至14微米) 相比，上皮細胞體積較大(平均線性尺寸約為12至20微米)。但與血樣中存在的少量其他循環(huán)細胞如單核細胞及分化后的巨嗜細胞等相比，上皮細胞體積并不大。更為重要的判據(jù)應該在于上皮細胞內(nèi)部的三維結構與血細胞內(nèi)部的三維結構差別，因此顯微檢測循環(huán)腫瘤細胞的關鍵在于識別不同種類細胞的結構形態(tài)之間的差別。但顯微檢測基于對細胞三維結構的非衍射二維投影圖像，由于細胞結構的復雜性，自動識別易于出錯，一般需要人工復檢，相應的的缺點為檢測速度低且成本高。熒光流式儀檢測循環(huán)腫瘤細胞的方法具有速度高和可檢測細胞體積的優(yōu)點，但無法測量細胞內(nèi)部結構特征。
細胞功能和與外界的相互作用與其三維結構形態(tài)緊密關聯(lián)。因此通過檢測細胞三維結構形態(tài)特征與差異是分析辨別細胞的最佳方法之一。例如光學顯微鏡是人類用于觀察細胞結構形態(tài)最早也是目前最常用的儀器之一。但由于下述原因，使用光學顯微方法識別細胞的方法具有局限性，很難用于對包含極小量循環(huán)腫瘤細胞的富集后的血樣進行快速分析辨別。第一，常用的光學顯微鏡(如熒光顯微鏡，明視場或暗視場顯微鏡等)是基于非衍射成像原理設計的，其圖像是通過對細胞三維結構的二維投影而形成，利用這種圖像所測的細胞結構特征為結構二維投影特征，無法真實反映細胞的三維結構形態(tài)與特征。第二，由于顯微圖像是對細胞三維結構的二維投影，據(jù)此圖像分析辨別細胞通常需要非常復雜的圖像分析方法，在分析具有復雜三維結構形態(tài)的細胞時更是如此，一般需要人工分析，因而基于光學顯微鏡的圖像分析方法很難自動化，而且相關的光學顯微鏡操作與圖像測量也需人工操作，費時，易產(chǎn)生誤差且分析速度極低。第三，免疫熒光染色往往需要昂貴的試劑和復雜費時的工序。近年來，光學顯微鏡技術取得了新進展，例如使用共聚焦技術，可獲取多幅景深很短的二維圖像，通過二維圖像疊加重建細胞的三維結構形態(tài)。但共聚焦光學顯微鏡技術只解決了上述第一個問題，通常需要更長的圖像數(shù)據(jù)測量和分析時間，而其他問題依然未解決。
上世紀六十年代以來對以細胞為代表的細胞在層流快速流動狀態(tài)下進行光學測量的研究基礎之上，流式細胞儀成為一種集流體力學，激光技術，光電測量以及數(shù)據(jù)處理研究成果之大成的可對大量單個細胞進行快速測量分析的儀器。流式細胞儀利用同心噴嘴和液體壓強差在樣品室內(nèi)形成由樣品流和鞘流組成的層流。環(huán)包在樣品流外的鞘流通過壓強差減小含有細胞的樣品流直徑，迫使細胞以單列方式流動通過激發(fā)光束，被激發(fā)光束照射的細胞會產(chǎn)生與激發(fā)光波長相同的散射光，其強度隨散射角度變化而變化。這種波長與激發(fā)光波長相等的散射光也稱為彈性散射光，是由于細胞內(nèi)部的被激發(fā)光束電磁場感應而形成的分子電偶極子產(chǎn)生的輻射。細胞內(nèi)部的感應分子電偶極子濃度分布由其內(nèi)部的光折射率分布表達，因此細胞內(nèi)部三維結構可通過其光折射率三維分布表達。如細胞內(nèi)部的光折射率三維分布不均勻或與其所懸浮的載體材料光折射率不同，散射光即存在，并且通常是細胞被光照的條件下所產(chǎn)生的各種光信號中最強的信號。被激發(fā)光束照射的細胞如含有熒光分子還會產(chǎn)生其波長大于激發(fā)光波長的熒光，熒光是由于細胞內(nèi)部的熒光分子被激發(fā)后產(chǎn)生的輻射光。許多包括細胞在內(nèi)的細胞不含或含有很少的熒光分子，所以這些細胞只有在染色后才可產(chǎn)生足夠強度熒光信號。流式細胞儀通過測量染色后細胞產(chǎn)生的熒光以及散射光信號，可對細胞進行快速分析辨別，其處理速度可達每秒數(shù)千個細胞。與光學顯微分析方法相比，在分析包含大量細胞的群落及統(tǒng)計分布有其獨特的優(yōu)勢。自上世紀八十年代以來，流式細胞儀在細胞生物學研究，污染監(jiān)測和其他領域領域內(nèi)得到廣泛應用。
目前流式細胞儀產(chǎn)品可按其光學信號測量方式分為角度積分型與非相干圖像型兩種，絕大多數(shù)現(xiàn)有流式細胞儀為角度積分型。在這種流式細胞儀中，流動細胞在入射光束照射下產(chǎn)生的散射光信號和熒光信號由不同的單體光電傳感器(如光電二極管，光電倍增管等)接受而產(chǎn)生相應的輸出電信號。單體傳感器為只輸出1個電信號的傳感器，其信號強度正比于散射光或熒光信號強度在傳感器面積相對于光源所形成的立體角度內(nèi)的積分值， 簡稱為散射光或熒光信號。熒光信號與細胞內(nèi)部包含的特定分子(如細胞中的可與熒光分子結合的某種蛋白質(zhì)分子)存在與否以及數(shù)量有關，而角度積分后的散射光信號則只與細胞體積和內(nèi)部光折射率均勻度即顆粒度有關，與光折射率分布不同，顆粒度為光折射率分布的角度積分值。將散射光和熒光信號結合，通過計算機進行數(shù)據(jù)分析，可對包含大量細胞的群落進行自動分析辨別，達到將群落中的細胞進行快速種類區(qū)分的目的。目前角度積分型流式細胞儀通常可測量2到10個熒光信號以及2個散射光信號。熒光信號不包含結構信息，雖然2個散射光信號(前向與側向散射光信號)可提供體積和內(nèi)部顆粒度的信息，但其結構信息含量極其有限，因而角度積分型流式細胞儀主要依靠熒光信號對細胞進行快速分析辨別。
近年來圖像測量技術開始在流式細胞儀得到應用，形成非相干圖像型流式細胞儀。這種流式細胞儀基于傳統(tǒng)的光學顯微鏡方法，利用如電荷耦合器件(CCD)相機等圖像傳感器測量非相干光信號在空間的角度分布，可輸出熒光，明視場和暗視場等圖像數(shù)據(jù)，但各種圖像均為細胞三維結構的二維投影。與角度積分型流式細胞儀相比，非相干圖像型流式細胞儀可對每個流動細胞測量并輸出多幅圖像，其包含的結構信息顯然大為增加，因此可對細胞結構進行更細致的分析。但與傳統(tǒng)的光學顯微鏡方法相同，利用非相干光信號成像的圖像型流式細胞儀具有類似的局限性，如無法根據(jù)細胞三維結構位形態(tài)特征分析辨別細胞，需要對細胞染色才能獲得熒光圖像等。更為重要的是，由于二維投影圖像與三維結構之間的關系非常復雜，通常需要人工分析，因此很難實現(xiàn)通過計算機軟件對包含大量細胞的群落進行自動圖像數(shù)據(jù)分析，無法達到將群落中的細胞進行快速種類區(qū)分的目的。由于圖像信號型流式細胞儀可以每秒測量幾百至上千個細胞，其圖像信號數(shù)據(jù)總量非常大，如無法實現(xiàn)自動圖像信號分析，其應用受到極大的限制。
如前所述，在激發(fā)光束照射下的細胞會產(chǎn)生散射光，其波長與激發(fā)光波長相同。如果激發(fā)光束為一具有高度相干性的光束，在波長相等的條件下散射光也具有高度相干性。含有熒光分子的細胞也會同時產(chǎn)生熒光，其波長與激發(fā)光束波長不同，不具有相干性。如使用具有高度相干性的激光束作為激發(fā)光束，細胞內(nèi)部的感應分子電偶極子產(chǎn)生的具有高度相干性的散射光電磁場會在空間內(nèi)形成由于相位差造成的光強度隨角度變化的衍射分布， 相干散射光的衍射分布及偏振態(tài)由激發(fā)光束波長與偏振態(tài)以及細胞內(nèi)部的光折射率與其懸浮介質(zhì)折射率差的三維分布決定，因此相干散射光強的衍射分布及偏振態(tài)與細胞內(nèi)部三維結構形態(tài)高度相關，也與激發(fā)光束波長及偏振態(tài)有關。利用圖像傳感器測量相干散射光的衍射分布即為衍射圖像。通過多幅衍射圖像計算分析細胞三維結構特征，可獲得細胞三維結構形態(tài)或相關之信息。這種方法的最早應用為可見光波長范圍內(nèi)的激光全息成像技術以及在X光波長范圍內(nèi)推算生物大分子三維結構的X射線衍射技術。一般情況下，推算細胞三維結構需要在不同激發(fā)光束入射角度下獲得足夠多幅(5至10幅或更多)衍射圖像后再做復雜的三維結構重建計算。在細胞流式儀中由于細胞快速流動，很難同時得到足夠多幅不同角度的衍射圖像數(shù)據(jù)，即使能夠獲得足夠多幅的圖像，也不可能在數(shù)秒或更短時間內(nèi)完成三維重建計算。此外細胞在層流液體內(nèi)流動經(jīng)過入射光束時，其附近會存在曲率半徑極小的光學界面，包括鞘流與流體室材料如玻璃等的折射率不同造成的界面等。這些曲率半徑極小的光學界面通常會引起成為圖像噪音的散射光場，一般可大于或遠大于細胞所產(chǎn)生的衍射光強分布，使得所測量到的衍射圖像與細胞結構有關的信號對比度很小。獲得高質(zhì)量的與細胞結構有關的光學衍射圖像需要減小或消除由于這些光學界面所產(chǎn)生的圖像噪音，是一個很難解決的技術問題。此外如何利用所獲得的衍射圖像數(shù)據(jù)，得到與細胞三維結構特征高度相關的信息并據(jù)此快速分析包含大量細胞的群落并分類，也是一個技術難題。由于這些問題，盡管目前商用流式細胞儀大多使用激光束作為激發(fā)光束，但均無法通過測量與分析衍射圖像的方式辨別細胞。在角度積分型流式細胞儀中，其所測得的散射光信號為角度積分，因此由于散射光相干性造成的隨角度變化的衍射分布在經(jīng)過角度積分后的信號中基本消失，所得到的結構特征只包括體積和內(nèi)部顆粒度類的簡單特征；而在非相干圖像信號型流式細胞儀中，其熒光圖像由于熒光波長相對于激發(fā)光束波長的變化為非相干圖像，而明視場或暗視場圖像則一般是在非相干白光照射條件下獲得的，也屬于非相干圖像。
最近在對包括細胞在內(nèi)的細胞光散射的理論和實驗多年研究基礎之上，一種新型衍射圖像型流式細胞儀方法已經(jīng)公布，詳細討論可見參考文獻(例如X. H. Hu,K. M. Jacobs, J.Q.Lu. "Flow cytometer apparatus for three dimensional diffraction imaging and related methods", PCT Application No. WO 2009/151610by East Carolina University) 0這種新型衍射圖像型流式細胞儀提出了將層流置于主要由液體形成的流體室的設計概念，使用如電荷耦合器件相機等圖像傳感器紀錄細胞所產(chǎn)生相干散射光的角度分布，可獲得高對比度的衍射圖像信號。實驗結果表明這種新型衍射圖像信號型流式細胞儀可根據(jù)細胞衍射圖像信號分析辨別具有不同三維結構的細胞，詳細討論可見參考文獻(例如 K. M. Jacobs，L V. Yang，J. Ding，Α. Ε. Ekpenyong, R. Castellone，J. Q. Lu， X. H. Hu, "Diffraction imaging of spheres and melanoma cells with a microscope objective，，，Journal of Biophotonics，vol. 2, pp. 521-527 (2009) ；K. Μ. . Jacobs,. J.Q. Lu，X. H. Hu, "Development of adiffraction imaging flow cytometer”，Optics Letters, vol. 34，pp.四85_2987 (2009))。通過基于經(jīng)典電動力學理論的細胞光散射模型和大規(guī)模數(shù)值計算，現(xiàn)已證明由衍射圖像型流式細胞儀所獲得的細胞二維衍射圖像與其三維結構高度相關，可以從中提取與細胞三維結構特征相關的許多特征，詳細討論可見參考文獻(例如 J. Q. Lu, P. Yang, X. H. Hu, "Simulations of Light scattering from a biconcave red blood cell using the FDTD method", Journal of Biomedical Optics, vol. 10,024022(2005) ；R. S. Brock, X. H. Hu, D. A. ffeidner, J. R. Mourant, J. Q. Lu, “ Effect of detai led cell structure on light scattering distribution :FDTD study of a B-cell with 3D structure constructed from confocal images “ ， Journal of Quantitative Spectroscopy & Radiative Transfer,vol. 102,pp. 25-36(2006) ；K. Dong, Y. Feng, K. M. Jacobs, J. Q. Lu, R. S. Brock, L. V. Yang, F. E. Bertrand, M. A. Farwel 1, X. H. Hu, "Label-free classification of cultured cells through diffraction imaging", Biomedical Optics Express，vol. 2，pp. 1717-1726 (2011))。此外一種可自動辨別細胞的衍射圖像測量分析系統(tǒng)及方法已經(jīng)公布，根據(jù)此方法可通過獲取不同波長及偏振衍射圖像數(shù)據(jù)并提取其圖像模式參數(shù)矢量，基于特征參數(shù)矢量與細胞內(nèi)部三維結構特征之間的高度關聯(lián)快速分析辨別大量細胞的類別(例如董珂、胡新華“自動辨別微粒的衍射圖像測量分析系統(tǒng)及方法”，中國專利申請?zhí)?201010221714. 7)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是，提供一種可在使用常規(guī)方法如薄膜過濾或離心分離富集后的血樣如外周細胞或淋巴結的針吸細胞等樣品中準確快速地檢測腫瘤細胞的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法。
本發(fā)明所采用的技術方案是一種檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法。檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，包括有由富集后細胞組成的樣品流，儲存包括細胞在內(nèi)的樣品流的樣品流室，儲存鞘流液體的鞘流管，與樣品流相交的相干激發(fā)光束，測量被相干激發(fā)光束所激發(fā)的細胞射出的具有第一中心散射角度的相干散射光束的第一散射光接受物鏡部分，第一分光及濾波部分，第一成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分，圖像處理電路及計算機部分以及與圖像處理電路及計算機部分相連的顯示部分；樣品流室沿軸向貫穿鞘流管，所述的樣品流室的頂端設置有樣品流室排氣管，所述的樣品流室在位于鞘流管上方部分的一側設置有樣品流入管，所述的樣品流入管的另一端通過三通閥分別連接樣品流壓液入口和樣品懸浮液入口，所述的樣品流室的底端形成樣品流噴嘴；所述的鞘流管用于減小樣品流直徑，鞘流管的一側設置有鞘流壓液流入管，鞘流管的底部形成為開口狀態(tài)的鞘流管出口 ；樣品流噴嘴和樣品流出口與鞘流管出口共同構成復合噴嘴，所述的復合噴嘴用于形成由樣品流和鞘流組成的層流，使得樣品流與鞘流在流出噴嘴后形成層流；所述的第一分光及濾波部分用于對所接收的微粒發(fā)射的散射光進行分光和濾波；所述的第一成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分用于對分光和濾波后的散射光進行成像測量及數(shù)據(jù)輸出，從而獲得由相干散射光束形成的衍射圖像；所述的圖像處理電路及計算機部分用于接收數(shù)據(jù)輸出部分的輸出信息，提取不同波長及偏振衍射圖像數(shù)據(jù)特征并計算、分析和辨別；所述的顯示部分是將計算、分析和辨別結果的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行顯示與輸出，
所述的樣品流室排氣管上設置有第一二通閥。
所述的鞘流壓液流入管上設置有第三二通閥。
所述的復合噴嘴內(nèi)的樣品流噴嘴伸出鞘流管出口。
所述的復合噴嘴內(nèi)的樣品流噴嘴的內(nèi)直徑為20微米至2000微米。
用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的分析方法，包括有如下步驟
第一步驟獲得血液或淋巴樣品后，去除樣品內(nèi)的平均線性尺寸小于設定閾值的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞后，制成富集后細胞懸浮液；
第二步驟將細胞懸浮液輸入至樣品流室后，在流體控制系統(tǒng)輸出的樣品流壓液和鞘流壓液作用下，經(jīng)過復合噴嘴形成層流，并使得樣品流內(nèi)的細胞以單列方式與設定速度通過激發(fā)光束，產(chǎn)生相干散射光信號；
第三步驟被測細胞所產(chǎn)生的相干散射光信號的空間分布由衍射成像系統(tǒng)收集測量，獲得相應的具有不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)；
第四步驟將被測細胞內(nèi)所有細胞在不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)以及細胞種類分辨判據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C內(nèi)的圖像存儲處理單元中，供下一步驟圖像分析用；
第五步驟分析不同波長及偏振衍射圖像并提取圖像模式特征；
第六步驟根據(jù)不同波長及偏振衍射圖像的模式特征參數(shù)組成衍射圖像特征參數(shù)矢量，并根據(jù)該矢量確定所測細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置；
第七步驟確定所測細胞內(nèi)的所有細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置后，根據(jù)細胞在特征參數(shù)矢量樣本空間的位置分布以及輸入的種類分辨判據(jù)，將被測細胞自動分類成不同的種類并顯示及輸出相應統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
步驟一所述的平均線性尺寸的設定閾值在5至15微米之間。
步驟一所述的去除樣品內(nèi)的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞這些平均線性尺寸小于設定閾值的細胞，是采用過濾、離心分離或微流器件的方法進行。
步驟五所述的提取圖像模式特征，包括有根據(jù)灰度共生矩陣算法提取的用于分辨腫瘤細胞與其他種類細胞的圖像模式特征。
一種用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的腫瘤多次監(jiān)測分析方法，包括有如下步驟
第一步驟將按預定的監(jiān)測方案多次獲得的腫瘤患者的外周血樣品，每次分別去除樣品內(nèi)的平均線性尺寸小于設定閾值的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞后，制成富集后細胞懸浮液；
第二步驟將細胞懸浮液輸入至樣品流室后，在流體控制系統(tǒng)輸出的樣品流壓液和鞘流壓液作用下，經(jīng)過復合噴嘴形成層流，并使得樣品流內(nèi)的細胞以單列方式與設定速度通過激發(fā)光束，產(chǎn)生相干散射光信號；
第三步驟被測細胞所產(chǎn)生的相干散射光信號的空間分布由衍射成像系統(tǒng)收集測量，獲得相應的具有不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)；
第四步驟將被測細胞內(nèi)所有細胞在不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)以及細胞種類分辨判據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C內(nèi)的圖像存儲處理單元中供下一步驟圖像分析用；
第五步驟分析不同波長及偏振衍射圖像并提取圖像模式特征；
第六步驟根據(jù)不同波長及偏振衍射圖像的模式特征參數(shù)組成衍射圖像特征參數(shù)矢量，并根據(jù)該矢量確定所測細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置；
第七步驟確定所測細胞內(nèi)的所有細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置后，根據(jù)細胞在特征參數(shù)矢量樣本空間的位置分布以及輸入的種類分辨判據(jù)，將被測細胞 自動分類成不同的種類并顯示及輸出相應統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)；第八步驟將步驟七得到的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)與之前該腫瘤患者的外周血樣品的統(tǒng)計 分析數(shù)據(jù)進行對比，得到腫瘤細胞的響應變化結果。步驟一所述的平均線性尺寸的設定閾值在5至15微米之間。步驟一所述的去除樣品內(nèi)的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞這些平均線 性尺寸小于設定閾值的細胞，是采用過濾、離心分離或微流器件的方法進行。步驟五所述的提取圖像模式特征，包括有根據(jù)灰度共生矩陣算法提取的用于分辨 腫瘤細胞與其他種類細胞的圖像模式特征。本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法，在對外周血樣或其他 細胞樣品富集后制成懸浮液并注入至樣品流室內(nèi)，使用流體控制系統(tǒng)和復合噴嘴在流體室 內(nèi)或流體通道形成由樣品流與鞘流組成的層流，在相干激發(fā)光束照射條件下，測量由流動 細胞所產(chǎn)生的相干散射光所形成的不同波長與偏振衍射圖像數(shù)據(jù)，快速分析提取衍射圖像 模式特征參數(shù)，組成與細胞內(nèi)部三維結構特征高度相關的特征參數(shù)矢量，據(jù)此對所測細胞 進行自動快速分類。本發(fā)明具有可根據(jù)所測細胞內(nèi)部三維結構特征分析辨別細胞以及無需 對細胞染色的優(yōu)點，可對大量細胞進行快速準確的分類，達到檢測腫瘤細胞的目的。


圖1是本發(fā)明所使用的衍射成像系統(tǒng)結構示意圖；圖2是本發(fā)明所使用的樣品流室與復合噴嘴結構示意圖；圖3是根據(jù)本發(fā)明所測量的不同類培養(yǎng)細胞的衍射圖像效果圖；其中圖3A是ー個肺癌細胞株A549細胞的衍射圖；圖加是另ー個肺癌細胞株A549細胞的衍射圖；圖3C是ー個乳癌細胞株MCF-7細胞的衍射圖；圖3D另ー個乳癌細胞株MCF-7細胞的衍射圖；圖3E是ー個白血細胞株K562細胞的衍射圖；圖3F是另ー個白血細胞株K562細胞的衍射圖；圖4是本發(fā)明檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法的流程圖。其中1:富集后細胞2:樣品流3 相干激發(fā)光束4 相干散射光束5 顯微物鏡6 分光片7 透射窄帶濾光片8 透射偏振濾光片9 透射聚焦透鏡10 透射分光散射光11:透射圖像傳感器12 透射數(shù)據(jù)輸出輸入端ロ13 透射圖像傳感器電源14 透射圖像處理電路及計算機15 反射窄帶濾光片16 反射偏振濾光片17 反射聚焦透鏡18 反射分光散射光
19反射圖像傳感器20反射數(shù)據(jù)輸出輸入端口
21反射圖像傳感器電源22反射圖像處理電路及計算機
23第一中心散射角度24相干散射光束
25顯微目鏡26分光片
27窄帶濾光片28偏振濾光片
29聚焦透鏡30散射光
31圖像傳感器32數(shù)據(jù)輸出輸入端口
35窄帶濾光片36偏振濾光片
37聚焦透鏡38散射光
39圖像傳感器40數(shù)據(jù)輸出輸入端口
43第二中心散射角度A 第一散射光接受物鏡部分
B 第一分光及濾波部分C 第一成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分
D 圖像處理電路及計算機部分A'第二散射光接受物鏡部分
B'第二分光及濾波部分C'第二成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分
51樣品流室排氣管52第一二通閥
53鞘流管排氣管54第二二通閥
55樣品流壓液入口56三通閥
57樣品懸浮液入口58樣品流入管
60樣品流室61鞘流管
62鞘流管出口63樣品流噴嘴
64樣品流噴嘴出口65鞘流壓液入口
66第三二通閥67鞘流壓液流入管具體實施方式
下面結合實施例和附圖對本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法做出詳細說明。
本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法，利用可調(diào)節(jié)成像系統(tǒng)測量不同波長及偏振的衍射圖像，然后通過計算機軟件快速分析多幅衍射圖像模式統(tǒng)計參數(shù)矢量并根據(jù)這些參數(shù)矢量與細胞類別分辨判據(jù)對大量細胞進行快速分類，達到檢測腫瘤細胞的目的。本發(fā)明所描述的方法還可以通過其他的光學系統(tǒng)，方法和計算機軟件實現(xiàn)。具體方法為將從待診或治療的病人提取的外周血樣或淋巴結針吸細胞樣品，使用過濾或離心分離方法去掉血樣中的線性尺寸小于某一閾值如10微米以下的小細胞如血小板、紅細胞和大多數(shù)白細胞等和細胞碎片；將富集后的細胞用適當?shù)南♂屢褐瞥蓱腋∫汉笪霕悠妨魇覂?nèi)，使細胞可在測量時間內(nèi)保持其結構完整性；樣品流室內(nèi)的細胞懸浮液在一具有適當壓強的液體推動下，由一具有內(nèi)外噴腔的復合噴嘴的內(nèi)腔作為樣品流噴出，另一具有適當壓強的液體則從復合噴嘴的外腔作為鞘流噴出；在合適的壓強差條件下，樣品流與鞘流在流體室或流體通道內(nèi)形成穩(wěn)定的層流，以保證樣品流內(nèi)的細胞以單列方式和適當速度條件下經(jīng)過與層流也即樣品流相交的相干激發(fā)光束；相干激發(fā)光束可由多個不同波長的激光束組成；在相干光束激發(fā)下的細胞所產(chǎn)生的相干散射光在空間形成與細胞內(nèi)部三維結構高度相關的特征分布，使用衍射成像測量系統(tǒng)獲得不同波長及偏振衍射圖像數(shù)據(jù)；通過分析提取不同波長及偏振衍射圖像模式特征參數(shù)，對所測量的過濾后的血樣細胞根據(jù)其內(nèi)部三維結構特征進行分類，并輸出顯示血樣細胞內(nèi)不同類型細胞的類別和數(shù)目以及其不同波長及偏振衍射圖像模式特征參數(shù)數(shù)據(jù)。其中，
所述的細胞富集可通過現(xiàn)有的梯度介質(zhì)離心或薄膜過濾方法進行，例如用一種新型熱塑性塑料聚對二甲苯制作的具有以點陣排列微孔的過濾薄膜(見例如美國專利 US784639;3B2)，可在去除血樣中小的血細胞和細胞碎片等雜質(zhì)粒子后獲得富集細胞；也可采用離心分離方法將血樣置于離心試管內(nèi)的梯度介質(zhì)(如Wiarmacia公司出售的商品名為 Ficoll-Paque的梯度介質(zhì))之上后放于離心機內(nèi)，以適當?shù)霓D(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30至40分鐘后，即可見到具有不同質(zhì)量密度的不同類細胞分布于梯度介質(zhì)內(nèi)不同層次，使用吸管將所需的一類或多類細胞自離心試管內(nèi)取出后作為富集細胞；此外也可使用微流器件方法去除小細胞和細胞碎片后制成富集細胞；
所述的細胞懸浮液可在使用PBS緩沖液將富集后的細胞多次沖洗，然后使用細胞培養(yǎng)液細胞營養(yǎng)液或平衡鹽溶液按所需要的濃度配置細胞懸浮液，然后通過流體控制系統(tǒng)的懸浮液入口吸入至與復合噴嘴內(nèi)腔相通的樣品流室內(nèi)；
所述的復合噴嘴可由兩個或多個同心管組成，其中的內(nèi)管可由樣品室及與其相通的樣品噴嘴組成，樣品室的一端與流體控制系統(tǒng)的樣品流壓液通道相連接，在樣品流壓液的推動下樣品室內(nèi)的細胞懸浮液通過樣品噴嘴流出形成樣品流，復合噴嘴的外管為鞘流管，與流體控制系統(tǒng)的鞘流壓液通道相連接，鞘流壓液自鞘流管出口流出后形成鞘流，在適當?shù)臉悠妨鲏阂号c鞘流壓液壓強差條件下樣品流和鞘流形成層流，層流內(nèi)的樣品流可在鞘流的壓迫下減小其直徑，稱為流體動力學聚焦，使得樣品流內(nèi)的細胞以單列方式和適當速度通過激發(fā)光束；此外，復合噴嘴的鞘流管可由多個同心管組成，利用多個鞘流之間的壓強差形成更強和/或更穩(wěn)定的流體動力學聚焦；
所述的相干激發(fā)光束可由多個激光束組成，與普通光不同，每個激光束單一波長， 其內(nèi)的光子或光束子波的位相相同或相關，因此具有高度的相干性或較長的相干長度，由多個激光束組成的激發(fā)光束可在各自的波長上獨立激發(fā)細胞內(nèi)的分子，使其在各個激發(fā)波長上產(chǎn)生各自獨立的相干散射光；
所述的衍射成像測量系統(tǒng)可由顯微物鏡、分光及濾光部分、聚焦透鏡、圖像傳感器和數(shù)據(jù)輸出輸入端口組成；其中顯微物鏡可在某一立體角度范圍內(nèi)接受被相干激發(fā)光束所激發(fā)的細胞射出的相干散射光束；分光及濾波部分包括有可將顯微物鏡接受的相干散射光分為兩束的分光片，接收從分光片透射出的散射光的且依次設置的第一窄帶濾光片和第一偏振濾光片，以及接收從分光片反射出的散射光的且依次設置的第二窄帶濾光片和第二偏振濾光片，分光及濾波部分還可包括光強衰減片；經(jīng)過分光與濾波部分后的相干散射光由圖像傳感器接受，其光強的空間變化以不同波長及偏振衍射圖像數(shù)據(jù)的方式經(jīng)過數(shù)據(jù)輸出輸入端口輸出至衍射圖像處理電路及計算機部分；
所述的圖像分析、細胞分類與細胞分類數(shù)據(jù)顯示輸出由圖像處理電路及計算機部分完成；其圖像處理電路可接收由圖像傳感器數(shù)據(jù)輸出輸入端口輸出的原始衍射圖像數(shù)據(jù)，在對原始圖像數(shù)據(jù)進行壓縮處理后通過數(shù)據(jù)線輸出至計算機；計算機內(nèi)的圖像處理軟件可分析不同波長及偏振衍射圖像數(shù)據(jù)并提取模式特征，然后根據(jù)與所測量細胞內(nèi)部三維結構特征高度相關的衍射圖像模式特征參數(shù)，對所測量細胞進行分類；計算機還可輸出并顯示所測細胞內(nèi)不同類型細胞的類別和數(shù)目以及其不同波長及偏振衍射圖像模式特征參數(shù)數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)可用于檢測外周血樣或淋巴針吸樣品中的腫瘤細胞，作為癌癥早期診斷的細胞學依據(jù)。本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)還可用于多次監(jiān)測癌癥病人的腫瘤在治療過程中的響應。例如在數(shù)周或更長時間的腫瘤放射或化療治療中及時掌握患者腫瘤的響應，適應性地調(diào)整治療方案，進而實現(xiàn)個性化治療，取得最佳療效或延長患者生存質(zhì)量。細胞病理學研究表明，在腫瘤放射治療或化療初期，腫瘤細胞核結構不清，核染色質(zhì)結構不均勻，為粗細不等的不規(guī)則顆粒狀。隨著治療進程的延續(xù)，出現(xiàn)核腫脹、核漿造明、核染色質(zhì)位于核膜下等，細胞核呈"牛眼樣"或稱"鐵絲圈" 樣，核膜明顯增厚。極度時核染色質(zhì)凝集，核膜扭曲，核結構不清。呈"木炭樣"，或核腫大且形態(tài)不規(guī)則，出現(xiàn)單核或多核的瘤巨細胞。這些細胞內(nèi)部三維結構的變化可使用本發(fā)明的流動測量系統(tǒng)通過對外周血樣中的腫瘤細胞和白細胞測量而獲得，根據(jù)所測細胞數(shù)量與內(nèi)部三維結構的改變程度可定量判斷患者的腫瘤對治療是否已經(jīng)產(chǎn)生響應及響應程度，醫(yī)生可據(jù)此及時調(diào)整治療方案(如調(diào)整放射或化療藥物劑量、放療計劃、改變分次設計，或者采用放化療綜合治療等)以期達到最佳治療效果。
如圖1所示，本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，包括有檢測腫瘤細胞的流動測量裝置，還設置有用于向檢測腫瘤細胞的流動測量裝置提供提純后細胞1的樣品室。
所述的檢測腫瘤細胞的流動測量裝置，包括有含有富集后細胞1的樣品流2，還設置有與樣品流2相交的相干激發(fā)光束3、被相干激發(fā)光束3所激發(fā)的細胞產(chǎn)生的相干散射光可設置多個衍射成像系統(tǒng)完成測量，例如由細胞產(chǎn)生的具有第一中心散射角度23的相干散射光束4可由包括顯微物鏡5的第一衍射成像散系統(tǒng)測量，還可以設置有包括顯微物鏡 25的第二衍射成像系統(tǒng)，用于測量被相干激發(fā)光束3所激發(fā)的細胞產(chǎn)生的具有第二中心散射角度43的相干散射光束M，再經(jīng)過相應的濾光部分和成像裝置部分形成四幅衍射圖像數(shù)據(jù)輸出。
兩個衍射成像系統(tǒng)可通過選用不同窄帶濾光片7、15、27、35測量不同波長的衍射圖像；還可通過調(diào)節(jié)兩個衍射成像系統(tǒng)相對于相干激發(fā)光束傳播方向的角度在不同散射角度范圍內(nèi)測量由被測細胞產(chǎn)生的衍射圖像，如由顯微物鏡5收集的相干散射光束4的立體角度范圍由顯微物鏡5的數(shù)值孔徑?jīng)Q定，在該角度范圍內(nèi)的光強隨散射角度的變化即形成衍射圖像，第一中心散射角度23可用來標志該散射光角度范圍的中心角度位置。被測相干散射光束4的立體角度范圍可在0至π球面度，中心散射角度可在5至180度之間；而由顯微物鏡25收集的相干散射光束M的立體角度范圍則由顯微物鏡25的數(shù)值孔徑?jīng)Q定，第二中心散射角度43可用來標志該散射光角度范圍的中心角度位置。被測相干散射光束M 的立體角度范圍可在0至π球面度，中心散射角度可在5至180度之間。第一與第二衍射成像系統(tǒng)可采用相同結構，下面以第一衍射成像系統(tǒng)為例敘述其組成結構。
從被相干激發(fā)光束照射的細胞所產(chǎn)生的相干散射光束4的立體角度范圍可在0至 JI球面度；所述的第一散射光接受物鏡部分A是由多個透鏡依次排列組成的具有適當數(shù)值孔徑及工作距離的顯微物鏡5構成。其設計制作需滿足不同立體角度內(nèi)通過衍射圖像測量散射光分布的要求。
圖1所示的分光及濾波部分B用于對所被相干激發(fā)光束3所激發(fā)的細胞發(fā)射的散射光進行分光和濾波，所述的分光及濾波部分B包括有分光片6，接收分光片6透射光的且依次設置的透射窄帶濾光片7和透射偏振濾光片8，以及接收分光片6反射光的且依次設置的反射窄帶濾光片15和反射偏振濾光片16。所述的透射偏振濾光片8和反射偏振濾光片 16的后面還可以設置有光強衰減片，可根據(jù)圖像傳感器光強數(shù)據(jù)自動調(diào)整進入傳感器的光強，避免傳感器過載飽和。
分光與及濾波部分可根據(jù)不同光路設計獲得，因此，所述的分光及濾波部分B還可以是包括有偏振分光片和接收從偏振分光片所射出的不同方向散射光的透射窄帶濾波片7和反射窄帶濾光片15，以及位于透射窄帶濾波片7后面的透射偏振濾光片8和位于反射窄帶濾光片15后面的反射偏振濾光片16 ；或者所述的分光及濾波部分B是由偏振窄帶分光片組成，或是由分光片與棱鏡或衍射光柵組成。
一般窄帶濾光片的光學波長帶寬為0. 5納米到50納米之間，帶寬中心波長可調(diào)， 只有波長位于帶寬之內(nèi)的光波才能在較小衰減的條件下通過。偏振濾光片只允許處于某種偏振狀態(tài)的光波在較小衰減的條件下通過，例如水平線偏振狀態(tài)或左旋偏振狀態(tài)等等。由于透射濾光部分與反射濾光部分的帶寬中心波長與偏振可分別獨立調(diào)整，這樣可按照不同的細胞分析要求獲得不同波長與偏振的衍射圖像后由透射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 12與反射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 20分別輸出至圖像處理電路。
所述的第一成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分C用于對分光和濾波后的散射光進行成像測量及數(shù)據(jù)輸出，從而獲得由不同角度范圍的散射光所形成的衍射圖像。所述的第一成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分C包括有分別對分光及濾波部分B所輸出的透射與反射光進行聚焦的透射聚焦透鏡9和反射聚焦透鏡17，位于透射聚焦透鏡9后面的透射圖像傳感器11和位于反射聚焦透鏡17后面的反射圖像傳感器19，以及連接在透射圖像傳感器11后提供數(shù)據(jù)輸出輸入通道的透射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 12和連接在反射圖像傳感器19后的反射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 20 ；所述的透射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 12和反射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 20結構完全相同， 作為信號通道提供圖像傳感器工作所需的偏置電壓以及圖像傳感器冷卻電源的電源電壓， 提供圖像傳感器控制信號并提供傳感器輸出模擬脈沖數(shù)據(jù)信號的時序信號，并提供傳感器模擬脈沖數(shù)據(jù)信號數(shù)字化后輸出的數(shù)據(jù)信號。其中圖像傳感器將散射光隨空間角度分布轉(zhuǎn)換為衍射圖像數(shù)據(jù)并根據(jù)控制信號輸出相應的模擬脈沖數(shù)據(jù)信號。數(shù)字化后的衍射圖像素灰度值可選為8位到16位；一般情況下像素灰度值位數(shù)越高，圖像信號測量的動態(tài)范圍就越大，但需要存儲的數(shù)據(jù)量也大。
所述的圖像處理電路及計算機部分D用于接收數(shù)據(jù)輸出部分C的輸出數(shù)據(jù)，計算與提取不同波長及偏振衍射圖像模式特征并辨別細胞。包括有分別向透射圖像傳感器11 和反射圖像傳感器19提供偏置電壓及電源電壓的透射圖像傳感器電源13和反射圖像傳感器電源21，分別通過透射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 12和反射數(shù)據(jù)輸出輸入端口 20接收圖像信號的透射圖像處理電路及計算機14和反射圖像處理電路及計算機22。
其中，所述的透射圖像處理電路及計算機14和反射圖像處理電路及計算機22結構完全相同，所述計算機部分為兩個不同的計算機，也可為同一計算機；圖像處理電路及計算機可對所接收的圖像信號進行存儲處理以及計算，提取不同波長及偏振衍射圖像模式特征參數(shù)并輸出顯示參數(shù)數(shù)據(jù)。
所述的透射圖像處理電路及計算機14和反射圖像處理電路及計算機22，有可通過圖像信號傳輸線接收圖像信號并對所接收的圖像信號進行存儲處理的圖像處理電路，產(chǎn)生圖像傳感器控制信號及時序信號的電路，以及與圖像處理電路相連對所接收的圖像進行計算提取不同波長及偏振衍射圖像模式特征參數(shù)并輸出顯示參數(shù)數(shù)據(jù)的計算機。所述的計算機顯示部分是將分析、計算和辨別結果的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行顯示。
圖像處理電路可將輸入的圖像信號存儲于電路內(nèi)部存儲器或電子計算機的存儲器內(nèi)，圖像處理電路也可包括可對存儲的圖像信號進行特定數(shù)學運算。
本發(fā)明所述的透射圖像傳感器11和反射圖像傳感器19均可采用CXD相機，本實施例所使用的CCD相機的型號是MegaPlus ES2093，廠家Princeton Instruments。兩個 CCD相機分別通過透射數(shù)據(jù)輸出端口 12和反射數(shù)據(jù)輸出端口 20輸出的信號可由插在計算機內(nèi)的幀接收器插板接收并存儲后再轉(zhuǎn)入計算機內(nèi)存儲器。幀接收器的型號是=PIXCI E4， 廠家=EPIX, Inc0
如圖2所示，所述的樣品流室和復合噴嘴包括有鞘流管61和軸向貫穿鞘流管61 的樣品流室60，所述的鞘流管61的頂端設置有鞘流管排氣管53，所述的鞘流管排氣管53 上設置有第二二通閥M，所述的鞘流管61—側設置有鞘流壓液流入管67，所述的鞘流壓液流入管67的另一端通過第三二通閥66連接鞘流壓液入口 65。所述的鞘流管61的底部形成為開口狀態(tài)的鞘流管出口 62，所述的樣品流室60的頂端設置有樣品流室排氣管51，所述的樣品流室排氣管51上設置有第一二通閥52。所述的樣品流室60在位于鞘流管61上方部分的一側設置有樣品流入管58，所述的樣品流入管58的另一端通過三通閥分別連接樣品流壓液入口 55和樣品懸浮液入口 57，所述樣品流室60的底端形成有樣品流噴嘴63，該樣品流噴嘴63伸出鞘流管出口 62，并與鞘流管出口 62共同構成復合噴嘴，使得樣品流與鞘流在流出噴嘴后形成流體動力學聚焦條件下的層流。
首先將鞘流壓液通過鞘流壓液入口 65和壓液流入管67在開通第三二通閥66后注入鞘流管61內(nèi)并形成向下流動的鞘流，在注入鞘流液的同時可開通二通閥M使用鞘流管排氣管53排除鞘流管61內(nèi)的氣體，在注滿鞘流管61后關閉排氣管53。然后使用三通閥56開通樣品懸浮液入口 57將富集后的細胞懸浮液吸入樣品流室60，在吸入樣品懸浮液的同時可開通樣品流室排氣管51排除樣品流室60內(nèi)的氣體。在完成注入樣品懸浮液和形成穩(wěn)定的鞘流后，可使用三通閥56開通樣品流壓液入口 55，使得樣品流室60內(nèi)的樣品懸浮液在樣品壓液的推動下經(jīng)過樣品流噴嘴63的通道自其樣品流噴嘴出口 64流出，與自鞘流管出口 62流出的鞘流形成層流，并在與復合噴嘴相連的流體室內(nèi)或流體通道(圖中未示) 內(nèi)完成流體動力學聚焦，使得樣品流2內(nèi)的富集后細胞1成單列流動經(jīng)過可包含多束激光的相干激發(fā)光束3。
如圖3所示，利用本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，檢測腫瘤細胞可以得到不同培養(yǎng)細胞的衍射圖像，其中圖3A和圖:3B為自兩個不同的人體非小細胞肺癌細胞株A549細胞所測量的衍射圖像，圖3C和圖3D為自兩個不同的人乳腺癌細胞株MCF-7細胞所測量的衍射圖像，圖3E和圖3F則為自兩個不同的人白血病細胞株K562細胞所測量的衍射圖像。從這些衍射圖像可以觀察到在相干激發(fā)光束照射下不同類細胞產(chǎn)生的散射光的空間強度分布顯示不同的衍射圖像模式特征，而這些模式特征與細胞內(nèi)部的三維結構高度相干。通過已公布的衍射圖像分析方法與軟件可通過獲取非偏振衍射圖像模式參數(shù)矢量自動快速地分析辨別大量細胞的類別及其內(nèi)部結構特征，可以準確地分別腫瘤細胞株和源自白細胞的細胞株(例如董珂、胡新華“自動辨別微粒的衍射圖像測量分析系統(tǒng)及方法，，，中國專利申請?zhí)?201010221714. 7 ；K. Dong, Y. Feng, K. Μ. Jacobs, J. Q. Lu, R. S. Brock, L.V.Yang, F. E. Bertrand, M. A. Farwel 1, X. H. Hu, "Label-free classification of cultured cells through diffraction imaging", Biomedical Optics Express, vol. 2, PP. 1717-1726(2011))。采用本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，可測量富集后細胞在不同波長與偏振狀態(tài)下產(chǎn)生的多幅衍射圖像，通過提取多幅衍射圖像的模式參數(shù)矢量，進一步提高分辨腫瘤細胞和其他細胞種類的準確度。
如圖4所示，本發(fā)明的用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的分析方法，是利用本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)而進行的，包括有如下步驟
第一步驟獲得血液或淋巴樣品后，去除樣品內(nèi)的平均線性尺寸小于設定閾值的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞后，制成富集后細胞懸浮液；所述的去除樣品內(nèi)的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞這些細胞，是采用過濾、離心分離或為微流器件的方法進行。
過濾體積較小的細胞的線性尺寸的閾值可根據(jù)腫瘤細胞與大多數(shù)血細胞之間的尺寸差別設為在5至15微米之間，例如可設為10微米，并據(jù)此選擇適當?shù)母患牧?、器件和方法?br> 所述的細胞富集可通過現(xiàn)有的梯度介質(zhì)離心或薄膜過濾方法進行，例如用一種新型熱塑性塑料聚對二甲苯制作的具有以點陣排列微孔的過濾薄膜(見例如美國專利 US784639;3B2)，可在去除血樣中小的血細胞和細胞碎片等雜質(zhì)粒子后獲得富集細胞；也可采用離心分離方法將血樣置于離心試管內(nèi)的梯度介質(zhì)(如Wiarmacia公司出售的商品名為 Ficoll-Paque的梯度介質(zhì))之上后放于離心機內(nèi)，以適當?shù)霓D(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30至40分鐘后，即可見到具有不同質(zhì)量密度的不同類細胞分布于梯度介質(zhì)內(nèi)不同層次，使用吸管將所需的一類或多類細胞自離心試管內(nèi)取出后作為富集細胞；還可使用微流器件方法去除小細胞和細胞碎片制成富集細胞。
所述的細胞懸浮液可在使用PBS緩沖液將富集細胞多次沖洗，然后使用細胞培養(yǎng)液細胞營養(yǎng)液或平衡鹽溶液按所需要的濃度配置細胞懸浮液，然后通過流體控制系統(tǒng)的懸浮液入口吸入至與復合噴嘴內(nèi)腔相通的樣品流室內(nèi)。
第二步驟將細胞懸浮液輸入至樣品流室后，在流體控制系統(tǒng)如針管泵輸出的樣品流壓液和鞘流壓液作用下，形成層流，并使得樣品流內(nèi)的細胞以單列方式與設定速度通過激發(fā)光束，產(chǎn)生相干散射光信號；
第三步驟被測細胞所產(chǎn)生的相干散射光信號的空間分布由衍射成像系統(tǒng)收集測量，獲得相應的具有不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)；
第四步驟將被測細胞內(nèi)所有細胞在不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)以及腫瘤細胞和其他細胞種類分辨判據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C內(nèi)的圖像存儲處理單元中供下一步驟圖像分析用，所述的腫瘤細胞和其他細胞種類的衍射圖像分辨判據(jù)可由已知細胞種類的三維結構與衍射圖像數(shù)據(jù)庫提供(見例如董珂、胡新華“自動辨別微粒的衍射圖像測量分析系統(tǒng)及方法”，中國專利申請?zhí)?201010221714. 7)；
第五步驟分析不同波長及偏振衍射圖像并提取圖像模式特征；
所述的提取圖像模式特征，包括有根據(jù)灰度共生矩陣算法或其他圖像分析算法提取的用于分辨腫瘤細胞與其他細胞種類的圖像模式特征(見例如董珂、胡新華“自動辨別微粒的衍射圖像測量分析系統(tǒng)及方法”，中國專利申請?zhí)?01010221714. 7)。
第六步驟根據(jù)不同波長及偏振衍射圖像的模式特征參數(shù)組成衍射圖像特征參數(shù)矢量，并根據(jù)該矢量確定所測細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置；
第七步驟確定所測細胞內(nèi)的所有細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置后，根據(jù)細胞在特征參數(shù)矢量樣本空間的位置分布以及輸入的種類分辨判據(jù)，將被測細胞自動分類成不同的種類并顯示及輸出相應統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，還可以用于對癌癥病人治療響應的監(jiān)測。具體監(jiān)測過程可使用本發(fā)明的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)按如下步驟進行
第一步驟將按預定的監(jiān)測方案多次獲得腫瘤患者的外周血樣，每次分別去除樣品內(nèi)的平均線性尺寸小于設定閾值的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞后，制成富集后細胞懸浮液；所述的去除樣品內(nèi)的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞這些體積較小的細胞，是采用過濾、離心分離或微流器件的方法進行。
過濾體積較小的細胞的線性尺寸的閾值可根據(jù)腫瘤細胞與大多數(shù)血細胞之間的尺寸差別設為在5至15微米之間，例如可設為10微米，并據(jù)此選擇適當?shù)母患牧稀⑵骷头椒ā?br> 所述的細胞富集可通過現(xiàn)有的梯度介質(zhì)離心或薄膜過濾方法進行，例如用一種新型熱塑性塑料聚對二甲苯制作的具有以點陣排列微孔的過濾薄膜(見例如美國專利 US784639;3B2)，可在去除血樣中小的血細胞和細胞碎片等雜質(zhì)粒子后獲得富集細胞；也可采用離心分離方法將血樣置于離心試管內(nèi)的梯度介質(zhì)(如Wiarmacia公司出售的商品名為 Ficoll-Paque的梯度介質(zhì))之上后放于離心機內(nèi)，以適當?shù)霓D(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)30至40分鐘后，即可見到具有不同質(zhì)量密度的不同類細胞分布于梯度介質(zhì)內(nèi)不同層次，使用吸管將所需的一類或多類細胞自離心試管內(nèi)取出后作為富集細胞；還可使用微流器件方法去除小細胞和細胞碎片制成富集細胞。
所述的細胞懸浮液可在使用PBS緩沖液將富集細胞多次沖洗，然后使用細胞培養(yǎng)液細胞營養(yǎng)液或平衡鹽溶液按所需要的濃度配置細胞懸浮液，然后通過流體控制系統(tǒng)的懸浮液入口吸入至與復合噴嘴內(nèi)腔相通的樣品流室內(nèi)。
第二步驟將細胞懸浮液輸入至樣品流室后，在流體控制系統(tǒng)輸出的樣品流壓液和鞘流壓液作用下，經(jīng)過復合噴嘴形成層流，并使得樣品流內(nèi)的細胞以單列方式與設定速度通過激發(fā)光束，產(chǎn)生相干散射光信號；
第三步驟被測細胞所產(chǎn)生的相干散射光信號的空間分布由衍射成像系統(tǒng)收集測量，獲得相應的具有不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)；
第四步驟將被測細胞內(nèi)所有細胞在不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)以及細胞種類分辨判據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C內(nèi)的圖像存儲處理單元中供下一步驟圖像分析用，所述的腫瘤細胞和其他細胞種類的衍射圖像分辨判據(jù)可由已知細胞種類的三維結構與衍射圖像數(shù)據(jù)庫提供(見例如董珂、胡新華“自動辨別微粒的衍射圖像測量分析系統(tǒng)及方法”，中國專利申請?zhí)?201010221714. 7)
第五步驟分析不同波長及偏振衍射圖像并提取圖像模式特征；
所述的提取圖像模式特征，包括有灰度共生矩陣算法或其他圖像分析算法提取的用于分辨腫瘤細胞與其他細胞種類的圖像模式特征(見例如董珂、胡新華“自動辨別微粒的衍射圖像測量分析系統(tǒng)及方法”，中國專利申請?zhí)?01010221714. 7)。
第六步驟根據(jù)不同波長及偏振衍射圖像的模式特征參數(shù)組成衍射圖像特征參數(shù)矢量，并根據(jù)該矢量確定所測細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置；
第七步驟確定所測細胞內(nèi)的所有細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置后，根據(jù)細胞在特征參數(shù)矢量樣本空間的位置分布以及輸入的種類分辨判據(jù)，將被測細胞自動分類成不同的種類并顯示及輸出相應統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)；
第八步驟將步驟七得到的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)與之前得到的該腫瘤患者的外周血樣品的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)進行對比，得到腫瘤細胞的治療響應變化結果。
權利要求
1.一種檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，包括有由富集后細胞(1)組成的樣品流0)， 儲存包括細胞在內(nèi)的樣品流O)的樣品流室(60)，儲存鞘流液體的鞘流管(61)，與樣品流 (2)相交的相干激發(fā)光束(3)，測量被相干激發(fā)光束C3)所激發(fā)的細胞射出的具有第一中心散射角度的相干散射光束(4)的第一散射光接受物鏡部分(A)，第一分光及濾波部分(B)，第一成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分(C)，圖像處理電路及計算機部分(D)以及與圖像處理電路及計算機部分(D)相連的顯示部分；其特征在于，樣品流室(60)沿軸向貫穿鞘流管 (61)，所述的樣品流室(60)的頂端設置有樣品流室排氣管(51)，所述的樣品流室(60)在位于鞘流管(61)上方部分的一側設置有樣品流入管(58)，所述的樣品流入管(58)的另一端通過三通閥分別連接樣品流壓液入口(5 和樣品懸浮液入口(57)，所述的樣品流室(60) 的底端形成樣品流噴嘴(6 ；所述的鞘流管(61)用于減小樣品流直徑，鞘流管(61)的一側設置有鞘流壓液流入管(67)，鞘流管(61)的底部形成為開口狀態(tài)的鞘流管出口(6 ；樣品流噴嘴(63)和樣品流出口(64)與鞘流管出口(62)共同構成復合噴嘴，所述的復合噴嘴用于形成由樣品流和鞘流組成的層流，使得樣品流與鞘流在流出噴嘴后形成層流；所述的第一分光及濾波部分(B)用于對所接收的微粒發(fā)射的散射光進行分光和濾波；所述的第一成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分(C)用于對分光和濾波后的散射光進行成像測量及數(shù)據(jù)輸出，從而獲得由相干散射光束(4)形成的衍射圖像；所述的圖像處理電路及計算機部分(D)用于接收數(shù)據(jù)輸出部分(C)的輸出信息，提取不同波長及偏振衍射圖像數(shù)據(jù)特征并計算、分析和辨別；所述的顯示部分是將計算、分析和辨別結果的統(tǒng)計數(shù)據(jù)進行顯示與輸出。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，其特征在于，所述的樣品流室排氣管(51)上設置有第一二通閥(52)。
3.根據(jù)權利要求1所述的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，其特征在于，所述的鞘流壓液流入管(67)上設置有第三二通閥(66)。
4.根據(jù)權利要求1所述的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，其特征在于，所述的復合噴嘴內(nèi)的樣品流噴嘴(63)伸出鞘流管出口(62)。
5.根據(jù)權利要求1所述的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)，其特征在于，所述的復合噴嘴內(nèi)的樣品流噴嘴(63)的內(nèi)直徑為20微米至2000微米。
6.一種用于權利要求1所述的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的分析方法，其特征在于，包括有如下步驟第一步驟獲得血液或淋巴樣品后，去除樣品內(nèi)的平均線性尺寸小于設定閾值的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞后，制成富集后細胞懸浮液；第二步驟將細胞懸浮液輸入至樣品流室后，在流體控制系統(tǒng)輸出的樣品流壓液和鞘流壓液作用下，經(jīng)過復合噴嘴形成層流，并使得樣品流內(nèi)的細胞以單列方式與設定速度通過激發(fā)光束，產(chǎn)生相干散射光信號；第三步驟被測細胞所產(chǎn)生的相干散射光信號的空間分布由衍射成像系統(tǒng)收集測量， 獲得相應的具有不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)；第四步驟將被測細胞內(nèi)所有細胞在不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)以及細胞種類分辨判據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C內(nèi)的圖像存儲處理單元中，供下一步驟圖像分析用；第五步驟分析不同波長及偏振衍射圖像并提取圖像模式特征；第六步驟根據(jù)不同波長及偏振衍射圖像的模式特征參數(shù)組成衍射圖像特征參數(shù)矢量，并根據(jù)該矢量確定所測細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置；第七步驟確定所測細胞內(nèi)的所有細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置后， 根據(jù)細胞在特征參數(shù)矢量樣本空間的位置分布以及輸入的種類分辨判據(jù)，將被測細胞自動分類成不同的種類并顯示及輸出相應統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。
7.根據(jù)權利要求6所述的用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的分析方法，其特征在于，步驟一所述的平均線性尺寸的設定閾值在5至15微米之間。
8.根據(jù)權利要求6所述的用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的分析方法，其特征在于，步驟一所述的去除樣品內(nèi)的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞這些平均線性尺寸小于設定閾值的細胞，是采用過濾、離心分離或微流器件的方法進行。
9.根據(jù)權利要求6所述的用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的分析方法，其特征在于，步驟五所述的提取圖像模式特征，包括有根據(jù)灰度共生矩陣算法提取的用于分辨腫瘤細胞與其他種類細胞的圖像模式特征。
10.一種用于權利要求1所述的檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的腫瘤多次監(jiān)測分析方法，其特征在于，包括有如下步驟第一步驟將按預定的監(jiān)測方案多次獲得的腫瘤患者的外周血樣品，每次分別去除樣品內(nèi)的平均線性尺寸小于設定閾值的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞后，制成富集后細胞懸浮液；第二步驟將細胞懸浮液輸入至樣品流室后，在流體控制系統(tǒng)輸出的樣品流壓液和鞘流壓液作用下，經(jīng)過復合噴嘴形成層流，并使得樣品流內(nèi)的細胞以單列方式與設定速度通過激發(fā)光束，產(chǎn)生相干散射光信號；第三步驟被測細胞所產(chǎn)生的相干散射光信號的空間分布由衍射成像系統(tǒng)收集測量， 獲得相應的具有不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)；第四步驟將被測細胞內(nèi)所有細胞在不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)以及細胞種類分辨判據(jù)傳輸?shù)接嬎銠C內(nèi)的圖像存儲處理單元中供下一步驟圖像分析用； 第五步驟分析不同波長及偏振衍射圖像并提取圖像模式特征； 第六步驟根據(jù)不同波長及偏振衍射圖像的模式特征參數(shù)組成衍射圖像特征參數(shù)矢量，并根據(jù)該矢量確定所測細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置；第七步驟確定所測細胞內(nèi)的所有細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置后， 根據(jù)細胞在特征參數(shù)矢量樣本空間的位置分布以及輸入的種類分辨判據(jù)，將被測細胞自動分類成不同的種類并顯示及輸出相應統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)；第八步驟將步驟七得到的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)與之前該腫瘤患者的外周血樣品的統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)進行對比，得到腫瘤細胞的響應變化結果。
11.根據(jù)權利要求10所述的用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的腫瘤多次監(jiān)測分析方法，其特征在于，步驟一所述的平均線性尺寸的設定閾值在5至15微米之間。
12.根據(jù)權利要求10所述的用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的腫瘤多次監(jiān)測分析方法，其特征在于，步驟一所述的去除樣品內(nèi)的細胞碎片、血小板、紅細胞和部分白細胞這些平均線性尺寸小于設定閾值的細胞，是采用過濾、離心分離或微流器件的方法進行。
13.根據(jù)權利要求10所述的用于檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)的腫瘤多次監(jiān)測分析方法，其特征在于，步驟五所述的提取圖像模式特征，包括有根據(jù)灰度共生矩陣算法提取的用于分辨腫瘤細胞與其他種類細胞的圖像模式特征。
全文摘要
一種檢測腫瘤細胞的流動測量系統(tǒng)及分析和監(jiān)測方法，系統(tǒng)有由富集后細胞組成的樣品流，儲存樣品流的樣品流室，儲存鞘流液體的鞘流管，與樣品流相交的相干激發(fā)光束，測量被激發(fā)的細胞射出的具有中心散射角度的相干散射光束的散射光接受物鏡部分，分光及濾波部分，成像測量及數(shù)據(jù)輸出部分，圖像處理電路及計算機部分以及顯示部分；方法是將獲得血液或淋巴樣品制成富集后細胞懸浮液；產(chǎn)生相干散射光信號；獲得相應的具有不同波長及偏振的衍射圖像數(shù)據(jù)并傳輸?shù)接嬎銠C內(nèi)的圖像存儲處理單元中；提取圖像模式特征；確定所測細胞在衍射圖像特征參數(shù)矢量樣本空間的位置；顯示及輸出相應統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。本發(fā)明可對大量細胞進行快速準確的分類，達到檢測腫瘤細胞的目的。
文檔編號C12Q1/02GK102507508SQ201110299529
公開日2012年6月20日 申請日期2011年9月28日 優(yōu)先權日2011年9月28日
發(fā)明者馮遠明, 胡新華 申請人:天津大學, 天津煒輻醫(yī)療科技有限公司